專利名稱：從大豆工藝流中回收庫尼茲胰蛋白酶抑制劑蛋白的方法
技術(shù)領域：
本公開提供了從大豆工藝流中回收純化庫尼茲胰蛋白酶抑制劑(KTI)蛋白的方法。具體地講，本公開提供的方法包括層析分離以及任選地，分離和移除KTI產(chǎn)品的一種或多種分離技術(shù)，所述KTI產(chǎn)品具有以總KTI蛋白濃度表示的至少約95重量％的純度。發(fā)明背景
抑制蛋白分解酶類的蛋白經(jīng)常以高濃度存在于很多種子和其它的植物貯藏器官中。抑制劑蛋白還存在于幾乎全部的動物組織和體液中。由于這些蛋白結(jié)合并抑制來自動物和微生物的蛋白分解酶類的能力，多年來它們已成為大量研究的對象。在醫(yī)學和生物學中，抑制劑已成為蛋白水解研究的有用工具。由于蛋白酶抑制劑在控制涉及一些疾病如膜腺炎、休克和肺氣腫的蛋白酶方面，以及作為用于調(diào)節(jié)哺乳動物受精作用的劑方面的治療潛力，它們是尤其受關注的。包含顯著量的蛋白酶抑制劑的大豆工藝流。蛋白酶抑制劑已知至少抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及可能抑制調(diào)控一些關鍵代謝功能的多種其它關鍵跨膜蛋白酶。蛋白酶的局部給藥對于例如特應性皮炎的病癥是有用的，特應性皮炎是皮膚炎癥的一種普通形式，其可以局限于少數(shù)區(qū)塊或涉及身體的大部分。蛋白酶抑制劑的褪色活性和它們防止紫外線導致的色素沉著的能力在體外和體內(nèi)均已被證明(參見,例如,Paine等人，J. Invest.Dermatol. ,116 :587-595 [2001])。蛋白酶抑制劑還被報道有利于創(chuàng)傷愈合。例如，分泌性白細胞蛋白酶抑制劑被證明當被局部施用時逆轉(zhuǎn)了組織的破壞并加速了創(chuàng)傷愈合過程。此夕卜，絲氨酸蛋白酶抑制劑還能夠有助于在紅斑狼瘡病人中降低疼痛(參見，例如，美國專利6，537，968)。天然存在的蛋白酶抑制劑可見于多種食物中，例如糧谷類(燕麥、大麥和玉米)、芽甘藍、洋蔥、甜菜根、小麥、龍爪稷和花生。所關注的一個來源是大豆。從大豆和其它豆類中已鑒定了兩大類的蛋白酶抑制劑超家族，每一類具有多種同工抑制劑。庫尼茲胰蛋白酶抑制劑(KTI)是第一類的重要成員，第一類的成員具有大約170-200個氨基酸，介于20-25kDa之間的分子量，并且主要針對胰蛋白酶。庫尼茲胰蛋白酶抑制劑通常是具有以兩個二硫鍵連接的4個半胱氨酸，并且具有一個位于由二硫鍵限定的環(huán)中的反應性位點的單鏈多肽。第二類的抑制劑包含60-85個氨基酸，具有6-10kDa范圍的分子量，相對地熱穩(wěn)定，并且在獨立的結(jié)合位點抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。Bowman-Birk抑制劑(BBI)是這一類的一個實例。大豆中存在的蛋白酶抑制劑的平均水平，對于KTI和BBI最重要的蛋白酶抑制劑而言分別是約I. 4%和O. 6%。要注意的是，這些低水平使得分離天然的蛋白酶抑制劑用于臨床用途是不現(xiàn)實的?，F(xiàn)有技術(shù)尚未描述從大豆蛋白來源獲得的、不使用酸或醇萃取或丙酮沉淀的、具有高純度水平的KTI產(chǎn)品。本領域公開的用于分離KTI產(chǎn)品的方法已被描述于下列的特定參考文獻中，但沒有導致高純度KTI產(chǎn)品的分離J. Agric. Food Chem. 39 (5)862-866(1991) ；Protein Expression and Purification 30 167-170(2003) ；J. Agric.Food Chem. 57(15) :7022-7029(2009) ；FEBS Letters 294(1,2) :141-143(1991) Journalof Food Science,54 (3) :606-617 (1989) ；JournaI of Agriculture and Food Chemistry,49(3) 1069-1086 (2001) ； Journal of Agriculture and Food Chemistry,35 (2)205-209(1987) ；Yamamoto, M.和 Ikenaka, T. , Studies on Soybean Trypsin Inhibitors.I.Purification and Characterization of Two Soybean Trypsin Inhibitors.J. Biochem. (Tokyo),62(2),141-149 (1967) ；Birk, Y. , The Bowman-Birk inhibitor trypsin-and chymotrypsin-inhibitor from soybeans, Int. J. Peptide Protein Res.,25(2),113-131 (1985) ；Hwang, D. , Davis Lin, K. T. , Yang, ff. , Foard, D. , Purification,Partial Characterization, and Immunological Relationships of Multiple LowMolecular Weight Protease Inhibitors of Soybean,Biochimica et Biophysica Acta,495,369-382(1977) ；Frattali, V·, Soybean Inhibitors-III. Properties of a lowmolecular weight soybean proteinase inhibitor,Journal of Biological Chemistry,244(2),274-280 (1969) ；Kassell, B. , Trypsin and Chymotrypsin Inhibitors fromSoybean, Methods in Enzymology,66(c),853(1970) ；Birk, Y. , Proteinase Inhib·itorsfrom Legume Seeds, Methods in Enzymology,57,697 ；以及 Birk, Y. , Trypsin andChymotrypsin Inhibitors from Soybeans, Methods in Enzymology, 58, 700。因此，存在對適用于高純度蛋白酶抑制劑和變體(具體而言，KTI)的生產(chǎn)的方法和組合物的需求。因此，本發(fā)明描述了通過本文所公開的方法分離高純度形式的KTI產(chǎn)品的方法。發(fā)明概述本發(fā)明描述了生產(chǎn)高度富集的KTI蛋白的組合物的新方法。更具體地講，本發(fā)明描述了通過一系列連續(xù)分離操作從大豆乳清中移除多種其它組分以產(chǎn)生適用作KTI蛋白回收底物的純化部分的大豆工藝流濃度。如本文中其它地方所詳述的，本發(fā)明描述了從大豆工藝流中回收純化部分，所述回收通過包括設計用于回收含水大豆乳清的多個組分的一個或多個膜分離(過濾)操作或?qū)游龇蛛x操作的方法。大豆工藝流的多種組分的移除通常包括在其組分的移除之前和/或過程中濃縮所述大豆工藝流。通常純化的部分通過從大豆工藝流中移除一種或多種雜質(zhì)(例如，微生物或礦物)、一種或多種大豆貯藏蛋白(例如，大豆球蛋白和β-伴球蛋白)、一種或多種大豆乳清蛋白、和/或一種或多種糖類制備。通過稀釋移除使純度降低的工藝流的其它主要組分(例如，貯藏蛋白、礦物、脂質(zhì)、微生物和糖類)，同時同樣地通過純化蛋白部分提高總KTI蛋白濃度，改進了高純度的KTI蛋白的回收，其中所述純化蛋白部分通過移除作為所述蛋白的拮抗物和/或具有有害效應的組分(例如，內(nèi)毒素)進行。具體而言，本公開提供了導致KTI產(chǎn)品的分離和移除的方法，所述KTI產(chǎn)品具有以總KTI蛋白濃度表示的至少約95重量％的純度。本發(fā)明的方法包括首先將大豆工藝流引入過濾進料區(qū)域，與分離膜的一側(cè)接觸；使流體通過上述膜，以在過濾進料區(qū)域產(chǎn)生包含至少一種大豆貯藏蛋白和至少一種大豆乳清蛋白的第一保留物，以及在透過區(qū)域產(chǎn)生包含一種或多種糖類和一種或多種礦物的第一透過物；將所述第一保留物或其部分引入第二過濾進料區(qū)域，與第二分離膜的一側(cè)接觸；使流體通過所述第二膜，以在第二過濾進料區(qū)域產(chǎn)生包含一種或多種大豆貯藏蛋白的第二保留物，以及在第二透過區(qū)域產(chǎn)生包含水、一種或多種大豆乳清蛋白和糖類的第二透過物；將蛋白濃縮的大豆工藝流引入在其中包含離子交換樹脂的離子交換單元；分離大豆乳清流以提供用于離子交換的多種進料部分；將上述多種進料部分引入離子交換區(qū)域；使上述多種進料部分的每一種與離子交換樹脂接觸，以通過與離子交換樹脂的親和移除KTI產(chǎn)品；以及，使離子交換樹脂與洗脫介質(zhì)接觸，以從離子交換樹脂移出KTI產(chǎn)品，從而形成洗脫的KTI蛋白部分。本公開還包括使用多種技術(shù)的方法，所述技術(shù)首先從大豆乳清固體中分離水，然后通過所述技術(shù)從大豆乳清固體中分離微生物，接著通過所述技術(shù)從大豆乳清固體中分離蛋白，接下來通過所述技術(shù)從大豆乳清固體中分離糖，繼而最后形成包含水的純化流。盡管本文所公開的步驟的順序提供了本發(fā)明的一個特定實施方案，應當指出的是，本文所公開的步驟可以任何順序被實行。 附圖簡沭圖IA是描述用于從工藝流中回收純化的大豆乳清蛋白的方法中的步驟O至4的流程示意圖。圖IB是描述用于從工藝流中回收純化的大豆乳清蛋白的方法中的步驟5、6、14、
15、16和17的流程示意圖。圖IC是描述用于從工藝流中回收純化的大豆乳清蛋白的方法中的步驟7至13的流程示意圖。圖ID是描述用于從含水的大豆乳清流中回收純化的KTI產(chǎn)品的方法的流程示意圖。圖2描述對KTI的Potos HS50離子交換部分的十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。圖3描述對富集的KTI部分的SDS-PAGE分析。圖4描述對HiTrap DEAE FF離子交換部分的SDS-PAGE分析。圖5描述提交給LC-MS/MS分析的KTI條帶。圖6描述對Mimo6HE部分的SDS-PAGE分析。優(yōu)詵方面的詳述本文描述了用于從在大豆蛋白分離物的制造中產(chǎn)生的多種豆科植物工藝流(包括大豆乳清流和大豆糖漿流)回收高度純化的KTI蛋白和其它產(chǎn)品的新型方法。例如，本公開的方法包括選擇并設計用于回收KTI蛋白或其它產(chǎn)品、或分離大豆乳清流的多個組分、或上述兩者的一種或多種分離技術(shù)或方法(例如層析分離或膜分離)。KTI蛋白和大豆乳清流的一種或多種其它組分(例如，多種糖類，包括低聚糖)的分離可以利用多種分離技術(shù)(例如，膜、層析、沉淀、離心、或過濾)。具體的分離技術(shù)將取決于有待通過將其與所述工藝流的其它組分分離而被回收的所期望的組分。例如，純化的KTI部分通常通過下列步驟制備首先移除一種或多種雜質(zhì)(例如，微生物或礦物)，然后移除包括一種或多種大豆貯藏蛋白(即，大豆球蛋白和β_伴球蛋白)的附加的雜質(zhì)，然后移除一種或多種大豆乳清蛋白(包括，例如，BBI和其它非KTI的蛋白或鈦)，和/或然后從大豆乳清中移除包括糖類的一種或多種附加的雜質(zhì)。通過稀釋移除使純度降低的乳清流的其它主要組分(例如，貯藏蛋白、礦物和糖類)，同時同樣地通過純化蛋白部分提高純度，改進了高純度形式的KTI蛋白的回收，其中所述純化蛋白部分通過移除作為所述蛋白的拮抗物和/或具有有害效應的組分(例如，內(nèi)毒素)進行。大豆乳清的多種組分的移除通常包括在所述大豆乳清的組分的移除之前和/或過程中對所述大豆乳清的純化。本發(fā)明的方法也將減少加工大量含水垃圾產(chǎn)生的污染。貯藏蛋白、糖類、礦物和其它雜志 的移除產(chǎn)生富集了所期望的KTI蛋白，并且不含可能是拮抗劑或毒素或可能在其它方面具有有毒效應的雜質(zhì)的部分。例如，大豆貯藏蛋白富集的部分通?？梢耘c富集了一種或多種大豆乳清蛋白的部分一起被回收。富集了一種或多種糖類(例如，低聚糖和/或多糖)的部分也通常被制備。因此，本方法提供適合作為用于回收KTI蛋白的基料的部分，并且還提供能夠被用于從 含水的大豆乳清中回收其它有用產(chǎn)品的其它部分。例如，糖類和/或礦物從大豆乳清流中的移除產(chǎn)生了有用的部分，糖類能夠從其中被進一步分離，從而產(chǎn)生附加的有用的部分濃縮的糖和礦物部分(可以包括檸檬酸)，以及可以最低限度的處理(如果存在的話)被處置或作為工藝用水被回收的相對純的含水部分。如此產(chǎn)生的工藝用水在本方法的實施中可以是尤其有用的。因此，本方法的進一步的優(yōu)點可以是與常規(guī)的分離制備方法相比降低的工藝用水需求。本公開的方法以至少兩種方式提供了高于制造大豆蛋白分離物和濃縮物的常規(guī)方法的優(yōu)點。如所指出的，制造大豆蛋白材料的常規(guī)方法通常處理大豆乳清流(例如，含水的大豆乳清或大豆糖漿)。因此，通過本公開的方法回收的產(chǎn)品代表了附加的產(chǎn)品，以及目前在與常規(guī)的大豆蛋白分離物和大豆蛋白濃縮物制造的關聯(lián)中未實現(xiàn)的收益來源。此外，對大豆乳清流或大豆糖漿進行的用于回收可出售的產(chǎn)品的處理，可取地降低了與對大豆乳清流或大豆糖漿的處理或處置相關的成本。例如，如本文中其它地方所詳述的，本發(fā)明的多種方法提供了相對純的工藝流，所述工藝流可以在多種其它方法中被容易地利用或以最低限度的處理(如果存在的話)被處置，從而降低所述方法對環(huán)境的影響。某些成本與本公開的方法相關聯(lián)地存在，但所分離的附加的產(chǎn)品和廢物處理的最小化的益處據(jù)信彌補了任何增加的成本。A.酸可溶的蛋白大豆蛋白分離物通常在大豆貯藏蛋白的等電點(例如，約4.5的pH)從脫脂大豆柏或大豆粉的水提物中沉淀。因此，大豆蛋白分離物一般包括在酸性液體介質(zhì)中不可溶的蛋白。類似地，大豆蛋白濃縮物(第二精純的大豆蛋白材料)的蛋白同樣在酸性液體介質(zhì)中是不可溶的。然而，通過本公開的方法回收的大豆乳清蛋白一般是酸可溶的，意味著它們在酸性液體介質(zhì)中是可溶的。例如，本公開提供了來源于含水大豆乳清，并且在環(huán)境條件(例如，約25°C的溫度)下表現(xiàn)出跨越相對寬范圍PH的含水(通常為酸性的)介質(zhì)(例如，具有約2至約10、約2至約7、或約2至約6的pH的含水介質(zhì))中的優(yōu)越溶解度的大豆蛋白組合物。通常所述大豆蛋白組合物的溶解度為至少約10克每升(g/L)，更典型至少約15g/L，以及更典型至少約20g/L。應當了解，提及跨越pH范圍的溶解度時(包括在所附權(quán)利要求中)是指所指定的溶解度是在落在所指定的PH范圍內(nèi)的任何和全部的pH值達到的。例如，提及在約2至約10的pH范圍至少約10g/L的溶解度表示所指定的溶解度是在3、4、5、6等pH達到的。
通過本公開的方法回收的酸可溶的大豆蛋白代表著本領域中的顯著改進。如本文所指出的，所述酸可溶的蛋白是從通常被丟棄的大豆乳清流中回收的。B.庫尼茲胰蛋白酶抑制齊U如本文所論及的，大豆工藝流(包括，例如，大豆乳清流和大豆糖漿流)包含庫尼茲胰蛋白酶抑制劑(KTI)蛋白。這種蛋白酶抑制劑已知至少抑制胰蛋白酶，并且可能抑制調(diào)節(jié)一些關鍵代謝功能的多種其它關鍵蛋白酶。根據(jù)本發(fā)明的實施方案分離的KTI蛋白可以包含多肽，所述多肽具有與SEQ IDNO 1 至少 50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或甚至 100%相同的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述KTI蛋白可以包含與SEQ ID NO :I至少70%相同，更優(yōu)選與SEQ ID NO : I至少80%相同，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO : I 至少90%相同，最優(yōu)選與SEQ ID NO 1至少95%相同的氨基酸序列。 在本實施方案的另一方面，所述氨基酸序列與SEQ ID NO : I至少50 %、60 %、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、或甚至 100%相同。在本發(fā)明的某些方面，兩種氨基酸序列之間的序列同一性通過比較所述氨基酸序列確定。在本發(fā)明的其它方面，序列同一性能夠通過比較氨基酸序列與其保守的氨基酸取代物而確定。在本發(fā)明的某些方面，本發(fā)明的蛋白能夠具有一個或多個保守取代。在本發(fā)明的其它方面，本發(fā)明的蛋白能夠具有一個或多個非保守取代。天然存在的氨基酸包括，例如，丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸⑴和纈氨酸(V)。保守的和非保守的氨基酸取代是本領域的普通技術(shù)人員已知的，例如，酸性氨基酸對另一種酸性氨基酸的取代可以被認為是保守取代而堿性氨基酸對酸性氨基酸的取代可以被認為是非保守取代；類似地，極性氨基酸對另一種極性氨基酸的取代可以被認為是保守取代而非極性氨基酸對極性氨基酸的取代可以被認為是非保守取代。氨基酸一般被分為下列類別(這能夠被用作指導，用于確定取代是保守的還是非保守的)(1)極性的/親水性的:N、Q、S、T、K、R、H、D、E、C和 Y ;(2)非極性的 / 疏水性的:G、A、L、V、I、P、F、W 和 M ;
(3)酸性的D、E和C ;⑷堿性的K、R和H ; (5)芳香族的F、W、Y和H ;和(6)脂族的G、A、L、V、I 和 Po在本發(fā)明的某些方面，其中一種或多種氨基酸序列與SEQ ID NO :1不相同，這樣的一種或多種氨基酸序列也具有KTI蛋白的功能，KTI蛋白已知抑制胰蛋白酶活性。用于確定這些功能的方法描述于本文中，并且是本領域的普通技術(shù)人員已知的。在本發(fā)明的其它方面，其中組合物包含與SEQ ID NO :1不相同的一種或多種氨基酸序列，這樣的一種或多種氨基酸序列也具有KTI蛋白的功能，KTI蛋白已知抑制胰蛋白酶。用于確定這些功能的方法描述于本文中，并且是本領域的普通技術(shù)人員已知的。KTI蛋白由170個至200個氨基酸殘基和大約兩個二硫鍵組成。KTI蛋白的一級結(jié)構(gòu)自 1973 年起即是已知的(參見 Koide,T.和 Ikenaka, T. , Studies on Soybean TrypsinInhibitors.3. Amino-Acid Sequence of the CarboxyI-Terminal Region and theComplete Amino-Acid Sequence of Soybean Trypsin Inhibitor, Eur. J. Biochem. 32,417，1973)。本公開的KTI產(chǎn)品的純度代表著與其它KTI產(chǎn)品相比此前尚未達到的純度水平。KTI部分的純度是總KTI蛋白濃度、比活性(如以胰蛋白酶抑制劑單位/克蛋白測量的)和具有KTI拮抗劑功能的組分、毒素、或在單純的對每單位數(shù)量的KTI的功效的稀釋之外還具有有毒效應的其它組分的不存在的函數(shù)。一般而言，本公開的KTI產(chǎn)品的總KTI蛋白濃度是至少約70重量％，或至少約80重量％。通常，本公開的KTI產(chǎn)品的總KTI蛋白濃度是至少約90重量％，優(yōu)選至少約95重量％，更優(yōu)選至少約99重量％?！凹兊摹眴误w蛋白在單向或雙向SDS-PAGE凝膠上電泳之后將產(chǎn)生單一條帶，將作為單獨的對稱吸收峰從凝膠過濾、高效液相色譜(HPLC)、或離子交換柱上洗脫，將產(chǎn)生單獨的一組質(zhì)譜、核磁共振(NMR)、或W吸收光譜信號，并且在適當?shù)那闆r下將沒有對酶活性的污染。由于絕對的純度不能被確定，簡單的純度標準被常規(guī)地使用，即，在SDS-PAGE之后 不能檢測到多于一個的蛋白條帶。(參見Mohan, Determination of purity and yield.Methods in Molecular Biology, 11, 307-323 (1992))。圖 3 描述了單向凝膠電泳之后的本發(fā)明的KTI蛋白。如圖3所示，本發(fā)明的KTI蛋白顯示為對應于21kDa分子量標準的單一條帶并且具有不同的等電點。KTI部分的純度是總KTI蛋白濃度、比活性(如以胰蛋白酶抑制劑單位/克蛋白測量的)和具有KTI拮抗劑功能的組分、毒素、或在單純的對每單位數(shù)量的KTI的功效的稀釋之外還具有有毒效應的其它組分的不存在的函數(shù)。一般而言，本公開的KTI產(chǎn)品的總KTI蛋白濃度是至少約70重量％，或至少約80重量％。通常，本公開的KTI產(chǎn)品的總KTI蛋白濃度是至少約90重量％，優(yōu)選至少約95重量％，更優(yōu)選至少約99重量％。除KTI純度之外，本公開的KTI產(chǎn)品的總蛋白含量也是有利的和/或代表了本領域的改進。本公開的產(chǎn)品的KTI蛋白含量可以通過本領域已知的常規(guī)方法測定，包括，例如，描述于Ohnishi, S. T.和Barr, J. K. ,A simplified method of quantitating proteinsusing the biuret and phenol reagents. Anal. Biochem. , 86,193 (1978)中的 Lowry 方法。一般而言，本公開的KTI產(chǎn)品的總蛋白含量為至少約60重量％ (基于干重)，至少約70重量％，至少約80重量％,或至少約85重量％。通常，本公開的KTI產(chǎn)品的總蛋白含量是至少約90重量％，優(yōu)選至少約95重量％，更優(yōu)選至少約99重量％。KTI蛋白已知僅抑制胰蛋白酶，而包含蛋白的組合物的其它組分(例如BBI蛋白)已知既抑制胰蛋白酶又抑制胰凝乳蛋白酶。因此，在本發(fā)明的抑制胰蛋白酶的準備中，胰凝乳蛋白酶抑制劑活性的不存在指示了 KTI蛋白的存在。類似地，本公開的KTI產(chǎn)品的胰蛋白酶抑制劑活性(按照胰蛋白酶抑制劑單位/克蛋白，或TIU/克蛋白表達)可以通過本領域已知的常規(guī)方法測定，包括，例如，在其中一個Tiu被定義為能夠抑制Img的胰蛋白酶的底物的量，而一個胰蛋白酶單位等于在pH 8. 2和37°C以N-苯甲酰-DL-精氨酸對硝基苯胺(ΒΑΡΑ硝基苯胺)作為底物每10分鐘0. 019的ΛΑ410。一般而言，本公開的KTI產(chǎn)品的胰蛋白酶抑制劑活性為至少約300TIU/克蛋白，典型為至少約500TIU/克蛋白，更典型為至少約950TIU/克蛋白，甚至更典型為至少約1500TIU/克蛋白。KTI產(chǎn)品目前據(jù)信適合的多種應用要求相對低的內(nèi)毒素含量。例如，多種治療應用要求KTI產(chǎn)品滿足藥品等級材料適用的規(guī)章。因此，在多個優(yōu)選的方面，所述KTI產(chǎn)品的總內(nèi)毒素含量為優(yōu)選不超過約I. 5EU/克蛋白，更優(yōu)選不超過約IEU/克蛋白，更優(yōu)選不超過約O. 5EU/克蛋白，以及甚至更優(yōu)選不超過約O. 25EU/克蛋白。例如，根據(jù)多個此類方面，所述KTI產(chǎn)品的總內(nèi)毒素含量典型為約O. IEU/克蛋白至約I. 5EU/克蛋白，更典型為約O. IEU/克蛋白至約I. OEU/克蛋白，以及更典型為約O. IEU/克蛋白至約O. 5EU/克蛋白(例如，約O. IEU/克蛋白至約O. 25EU/克蛋白)。附加地或作為另外一種選擇，本公開的KTI產(chǎn)品的總內(nèi)毒素含量為不超過約5. O內(nèi)毒素單位每克蛋白(EU/克蛋白)，或不超過約2. 5EU/克蛋白。例如，在多個方面，總內(nèi)毒素含量為約O. IEU/克蛋白至約5. OEU/克蛋白，或約O. IEU/克蛋白至約2. 5EU/克蛋白。應當了解，本公開的KTI產(chǎn)品可以表現(xiàn)出以上指定的特征中的一種、組合、或全部。例如，本公開的KTI產(chǎn)品可以表現(xiàn)出所指定的KTI純度和總蛋白含量。KTI產(chǎn)品也可以表現(xiàn)出所指定的KTI純度、胰蛋白酶抑制劑活性和本文所公開的序列。以另一個實例的方式，所述KTI產(chǎn)品可以表現(xiàn)出所指定的KTI蛋白濃度和總內(nèi)毒素含量。在這些以及另外的方面，本公開的KTI產(chǎn)品可以表現(xiàn)出所指定的總大豆蛋白濃度和胰蛋白酶抑制劑活性。以另一個實例的方式，本公開的KTI產(chǎn)品可以表現(xiàn)出所指定的總大豆蛋白濃度和總內(nèi)毒素含 量。所述KTI產(chǎn)品的特性的這些組合是示例性的，并且這一列舉并不旨在是詳盡的。也就是說，根據(jù)本公開，KTI產(chǎn)品可以任何以上所指定范圍內(nèi)的任何以上所指定的值，表現(xiàn)出以上提及的特性的任何組合。本發(fā)明的KTI產(chǎn)品能夠從任何來源或允許從天然的基于植物的基質(zhì)離析、分離、或純化KTI的任何方法獲得。以非限制性實例的方式，天然的基于植物的基質(zhì)能夠來源于豆科植物，包括例如大豆、玉米、豌豆、卡諾拉、向日葵、高粱、稻、莧屬植物、馬鈴薯、木薯、竹芋、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麥、燕麥、裸麥、大麥、花生、洋刀豆、薏苡、豌豆家族豆類、巴魯、鵲豆、矛豆莢(例如，雨豆樹種子)、苜蓿、蝸牛苜蓿種子、利馬豆、牛油豆、蕓豆、矮菜豆、甘蔗、小米、成材木、菠菜、chapule、纖毛蟲、甜點香蕉、兵豆、麩、蠶豆或胡豆、綠豆、赤豆、豇豆、麻風樹、綠藻、以及它們的組合。在本發(fā)明的特定方面，KTI是在多種工藝流中從大豆獲得的。多種大豆工藝流包括，例如，含水的大豆提取流(其是大豆流的蛋白組分在其中為可溶性形式的任何流。例如來自脫脂大豆材料)、含水的豆?jié){提取流(其是大豆流的蛋白組分在其中為可溶性形式的來自全部或部分脫脂的大豆材料的任何流)、含水的大豆乳清流(其是由貯藏蛋白的沉淀或鹽析得到的任何乳清流；沉淀方法能夠包括高溫以及化學方法)、含水的大豆糖漿流(其是通過從含水的大豆乳清流中移除水產(chǎn)生的任何流)、含水的大豆蛋白濃縮物大豆糖漿流(其是來自對來自大豆蛋白濃縮方法的可溶性糖的醇提取物的任何流)、含水的大豆透過流(其是由不同分子量的蛋白部分的分離得到的任何流，所述分離中較小分子量的蛋白通過膜)和含水的豆腐乳清流(其包括來源于豆腐凝結(jié)過程的任何乳清流。通過本發(fā)明的方法分離的KTI產(chǎn)品的量可以是低至克級(實驗室規(guī)模的分離)或可以是若干公噸(工業(yè)或大規(guī)模分離)。C.含水的乳清流含水的乳清流和糖漿流是大豆工藝流的類型，它們是從精煉完整豆類或油料種子的方法產(chǎn)生的。完整的豆類或油料種子可以來源于多種適合的植物。以非限制性實例的方式，適合的植物包括豆科植物(包括如大豆)、玉米、豌豆、卡諾拉、向日葵、高粱、稻、莧屬植物、馬鈴薯、木薯、竹芋、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麥、燕麥、裸麥、大麥、花生、洋刀豆、薏苡、豌豆家族豆類、巴魯、鵲豆、矛豆莢(例如，雨豆樹種子)、苜蓿、蝸牛苜蓿種子、利馬豆、牛油豆、蕓豆、矮菜豆、甘蔗、小米、成材木、菠菜、chapule、纖毛蟲、甜點香蕉、兵豆、麩、蠶豆或胡豆、綠豆、赤豆、豇豆、麻風樹、綠藻、以及它們的組合。在一個實施方案中，所述豆科植物是大豆，并且從精煉大豆的方法產(chǎn)生的含水的乳清流是含水的大豆乳清流。在大豆蛋白分離物的制造中產(chǎn)生的含水的大豆乳清流一般是相對被稀釋 的并且通常作為廢物被丟棄。更具體地講，所述含水的大豆乳清流具有典型小于約10重量％，典型小于約7. 5重量％，以及更典型小于約5重量％的總固體含量。例如，在多個方面，所述含水的大豆乳清流的固體含量為約O. 5重量％至約10重量％，約I重量％至約4重量％，或約I重量％至約3重量％ (例如，約2重量％)。因此，在商業(yè)化的大豆蛋白分離物生產(chǎn)過程中，產(chǎn)生了必須被處理或處置的顯著體積的廢水。大豆乳清流通常包含起始大豆材料的大部分初始大豆蛋白含量。如本文所用，術(shù)語“大豆蛋白”一般是指來源于大豆的任何和全部的蛋白。天然存在的大豆蛋白一般是具有被親水外殼圍繞的疏水核心的球狀蛋白。大量的大豆蛋白已被鑒定，包括，例如，貯藏蛋白如大豆球蛋白和β_伴球蛋白。大豆蛋白同樣包括蛋白酶抑制劑，如以上提及的KTI蛋白。大豆蛋白也包括血球凝集素如凝集素、脂氧合酶、β_淀粉酶和露那辛。值得注意的是，大豆植物可以被轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生通常不被大豆植物表達的其它蛋白。應當了解，本文提及“大豆蛋白”時同樣設想了如此產(chǎn)生的蛋白?；诟芍?，大豆蛋白占大豆乳清流的至少約10重量％，至少約15重量％，或至少 約20重量％ (基于干重)。通常，大豆蛋白占大豆乳清流的約10重量％至約40重量％，或約20重量％至約30重量％ (基于干重)。大豆蛋白分離物通常包含大豆的大部分貯藏蛋白。然而，在分離物沉淀之后剩余的大豆乳清流同樣包含一種或多種大豆貯藏蛋白。除多種大豆蛋白之外，含水的大豆乳清流還同樣包含一種或多種碳水化合物(即糖類)。一般而言，糖類以大豆乳清流的重量計(基于干重)占至少約25%，至少約35%，或至少約45%。通常，糖類以大豆乳清流的重量計(基于干重)占約25%至約75%，更典型占約35%至約65%，更典型占約40%至約60%。大豆乳清流的糖類一般包括一種或多種單糖、和/或一種或多種低聚糖或多糖。例如，在多個方面，所述大豆乳清流包含選自葡萄糖、果糖、以及它們的組合的單糖。通常，單糖占大豆乳清流的約O. 5%至約10重量％，更典型約1%至約5重量％ (基于干重)。進一步根據(jù)這些以及多個其它方面，所述大豆乳清流包含選自蔗糖、棉子糖、水蘇糖、以及它們的組合的低聚糖。通常，低聚糖以大豆乳清流的重量計(基于干重)占約30%至約60%，更典型約40%至約50%。含水的大豆乳清流還通常包含包括多種組分的灰分，所述組分包括，例如，多種礦物、植酸、檸檬酸和維生素。通常存在于大豆乳清流中的礦物包括鈉、鉀、鈣、磷、鎂、氯、鐵、錳、鋅、銅、以及它們的組合。存在于大豆乳清流中的維生素包括，例如，硫胺素和核黃素。無論其確切的組成如何，灰分按重量計典型占大豆乳清流(基于干重)的約5%至約30%，更典型約10%至約25%。含水的大豆乳清流還通常包含脂肪部分，脂肪部分按重量計一般占大豆乳清流(基于干重)的約O. 1%至約5%。在本發(fā)明的某些方面，脂肪含量通過酸水解測量，并且按大豆乳清流的重量計(基于干重)為約3%。
除上述組分之外，含水的大豆乳清流通常還包含一種或多種微生物，包括，例如，多種細菌、霉菌和酵母。這些組分的比例通常為約100至約IXlO9菌落形成單位數(shù)(CFU)每毫升不等。如本文中其它地方所詳述的，在多個方面，在蛋白回收和/或分離之前，含水的大豆乳清流被處理，以移除這些組分。如所指出的，大豆蛋白分離物的常規(guī)的生產(chǎn)通常包括處理大豆蛋白分離物的分離之后剩余的含水的大豆乳清流。根據(jù)本公開，一種或多種蛋白和多種其它組分(例如，糖類和礦物)的回收導致相對純的含水的大豆乳清流。蛋白和一種或多種組分未被移除的常規(guī)的大豆乳清流一般要求在處置和/或再利用之前進行處理。根據(jù)本公開的多個方面，所述含水的乳清流可以最低限度的(如果存在的話)處理被處置或作為工藝用水被利用。例如，所述含水的乳清流可以在本公開的一個或多個過濾(例如，滲濾)操作中被使用。除了從大豆蛋白分離物的制造中產(chǎn)生的含水的大豆乳清流回收KTI蛋白之外，應當了解，本文所述的方法還同樣適合用于回收大豆蛋白分離物的制造中產(chǎn)生的大豆糖漿流的一種或多種組分，因為大豆糖漿流是附加類型的大豆工藝流。D. KTI蛋白的回收·本文所述的方式涉及純化的KTI蛋白的回收和分離，所述KTI蛋白存在于產(chǎn)生自完整的豆類或油料種子的精煉方法的含水的乳清流中。如上文所論及，所述完整的豆類或油料種子可以來源于多種適合的植物。以非限制性實例的方式，適合的植物包括豆科植物(包括如大豆)、玉米、豌豆、卡諾拉、向日葵、高粱、稻、莧屬植物、馬鈴薯、木薯、竹芋、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麥、燕麥、裸麥、大麥、花生、洋刀豆、薏苡、豌豆家族豆類、巴魯、鵲豆、矛豆莢(例如，雨豆樹種子)、苜蓿、蝸牛苜蓿種子、利馬豆、牛油豆、蕓豆、矮菜豆、甘蔗、小米、成材木、菠菜、chapule、纖毛蟲、甜點香蕉、兵豆、麩、蠶豆或胡豆、綠豆、赤豆、豇豆、麻風樹、綠藻、以及它們的組合。在一個實施方案中，所述豆科植物是大豆，并且從精煉大豆的方法產(chǎn)生的含水的乳清流是含水的大豆乳清流。在多個方面，本公開提供了用于回收和分離KTI蛋白的方法，所述KTI蛋白存在于大豆蛋白分離物的生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的含水的大豆乳清流中。應當指出的是，本發(fā)明的方法不限于大豆乳清或大豆糖漿流，并且可以被用于從很多種豆科植物工藝流中回收蛋白和多種其它組分。在多個方面，包含高比例的KTI蛋白的部分被從大豆乳清流中回收。通過本公開的方法處理的大豆乳清流一般是相對稀釋的。為了有利于KTI蛋白的回收和/或分離，所述乳清流優(yōu)選在所述方法的初始步驟中被濃縮。大豆乳清流的濃縮有助于從所述乳清流中回收和分離KTI蛋白。例如，在本公開的一個優(yōu)選的實施方案中，在回收KTI蛋白之前，通過使含水的大豆乳清或其部分與分離膜接觸，以形成包含含水的大豆乳清的保留物和包含水的透過物，從所述含水的大豆乳清中移除水。在本公開的其它實施方案中，水可以通過本領域已知的任何方法從所述大豆乳清中移除，例如通過蒸發(fā)。隨著KTI蛋白的回收，本公開的方法通常將蛋白自存在于大豆乳清流中的糖類分離。任選地，本公開的方法可以被配置和控制，以將大豆乳清流中的糖分離至一種或多種部分(例如，單糖富集的部分和/或低聚糖富集的部分)。這可以在多個步驟中完成，以將不同的糖類從蛋白分離。因此，糖類從大豆乳清流中的回收提供了進一步的產(chǎn)品流。如所指出的，糖類的移除通常產(chǎn)生糖類能夠被從其分離的部分，所述分離產(chǎn)生濃縮的糖類部分和可以最低限度的(如果存在的話)處理被處置或作為工藝用水被回收利用的相對純的含水部分。在處理所述保留物以移除糖類之后，所述保留物被進一步處理以移除附加的組分。如所指出的，可以通過本公開被處理的多種大豆乳清流包括一種或多種礦物(例如，磷和鈣)。已經(jīng)被注意到，一種或多種礦物的存在，可以通過，例如，膜的污染和從所期望回收的組分(即，KTI蛋白)分離方面的困難，對下游的處理造成挑戰(zhàn)。除了普遍地回收這些所期望的組分之外，從大豆乳清中移除礦物目前據(jù)信還有助于回收具有較高純度的KTI產(chǎn)品。如本文中其它地方所詳述的，從大豆乳清中移除礦物一般可以根據(jù)本領域中已知的方法進行，所述方法包括，例如，沉淀和離心。由于植酸通常存在于通過本發(fā)明的方法處理的含水的大豆乳清流中，礦物如鈣和鎂通常以植酸鈣和植酸鎂的形式被回收。其它被移除的礦物還可以包括，例如，鈉、鉀、鋅、鐵、錳和銅。本公開包括多種適用于從在大豆蛋白分離物的生產(chǎn)中產(chǎn)生的含水的大豆乳清流回收KTI蛋白的方法。一般而言，本公開的方法包括一個或多個操作，所述操作被設計和配置為分離出含水的大豆乳清流的特定組分，從而濃縮所述乳清流并使得能夠從其回收純化的KTI蛋白。 一般而言，根據(jù)本公開，任何本領域中熟知的多種分離和純化技術(shù)可以被用于移除存在于含水的大豆乳清中的多種干擾組分和從其分離純化的KTI蛋白，所述技術(shù)包括，例如膜分離技術(shù)(例如，過濾，如超濾、微量過濾、納濾、和/或反向滲透)、層析分離技術(shù)(例如，離子交換層析、膜層析、吸附層析、尺寸排阻層析、反相層析、凝膠過濾、親和層析，其包括，例如，陰離子或陽離子交換層析、模擬移動床層析、膨脹床吸附層析、凝膠過濾、反相層析、和/或混合床離子交換)、電泳、透析、微粒過濾、沉淀、離心、結(jié)晶、以及它們的組合。上述多種組分的分離的主要原理是分子大小，盡管在過濾應用中，過濾介質(zhì)的滲透性能夠被樣品的化學、分子或靜電特性影響。如本文中其它地方所詳述的(例如，下文提及

圖1A、1B、1C和ID時)，本公開的方法通常利用多于一種的取決于待移除的乳清流的特定組分的分離膜。例如，所述方法的一個步驟可以利用超濾分離膜，然后的一個或多個步驟利用納濾分離膜。在關于不溶性固體的移除的某些方面，微粒過濾、沉淀、離心、結(jié)晶、以及它們的組合可以被使用。通過這些方法移除的不溶性固體通常大于20μπι。微粒過濾是通過使用微粒過濾膜將固體顆粒從流體分離的方法。適合的微孔濾膜由本領域已知的適當材料構(gòu)成，所述材料包括，例如，聚砜、改性聚砜、陶瓷和不銹鋼。微孔濾膜通常具有約O. I微米(μπι)至約20μπι范圍的孔徑。在某些方面，微孔濾膜具有約
O.2 μ m至約2 μ m范圍的孔徑。超濾與微量過濾類似，但在分離膜的孔徑方面不同。超濾膜通常被用于從具有較低分子量的分子分離具有較高分子量的分子(包括，例如，蛋白)。適合的超濾膜通常由本領域已知的適當材料構(gòu)成，所述材料例如聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚丙烯(PP)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、再生纖維素(RC)、陶瓷、不銹鋼、或薄膜復合材料。超濾膜通常具有約I千道爾頓(kDa)至約300kDa或約5kDa至約50kDa的阻隔分子量。附加地或作為另外一種選擇，適合的超濾膜可以具有約O. 002 μ m至約O. 5 μ m的孔徑。納濾被用于流體移除小分子。適合的納濾膜通常由本領域已知的適當材料構(gòu)成(例如聚醚砜、聚砜、陶瓷和聚酯上的聚酰胺型薄膜復合材料)并且通常具有約O. IkDa至約5kDa或約IkDa至約4kDa的MWCO。附加地或作為另外一種選擇，適合的納濾膜可以具有約
O.0009 μ m 至約 O. 009 μ m 的孔徑。反向滲透(或超濾)通常被用于糖類的濃縮。適合的反向滲透膜包括本領域一般已知的那些(例如，具有小于O. 5nm的孔徑的膜)。本發(fā)明的過濾步驟中利用的分離膜可以單獨地或以組合方式根據(jù)本領域已知的一種或多種配置方式被布置。例如，膜可以平板的形式、或以多層膜在其中被組合到一起(連同分離器篩網(wǎng)的任選的層)的盒模塊的形式被配置。含水的大豆乳清通常在膜堆的一端被引入交替通道，而流體通過膜進入一個或多個濾液或透過物通道。分離膜也可以被布置在螺旋狀的模塊中，在其中交替的膜的層圍繞著中空的中心核。含水的大豆乳清被引入所述模塊的一個末端，而流體通過所述交替的膜的層，流向并進入所述模塊的核心。以另一個實例的方式，分離膜可以被布置在中空纖維模塊中，所述模塊包括一束相對窄的膜管。含水的大豆乳清被引入所述模塊中，而流體沿通過所述模塊的大豆乳清的流的橫向通過膜管束。適合的膜的布置描述于，例如，美國專利6，946，075中，其全文以引用方式并入本文。 本發(fā)明的過濾步驟可以采用直接(常規(guī)流)過濾或切向(錯流)過濾。在直接或常規(guī)流過濾中，流體(即，含水的大豆乳清)被直接向著分離膜運送。作為另外一種選擇，在切向或錯流過濾中，流體(即，含水的大豆乳清)可以沿分離膜表面的切向被運送。切向或錯流過濾的一個優(yōu)點是，含水的大豆乳清的流切向施加在膜上的摩擦或掃刮力通常有助于維持流量。相應地，在多個方面，本公開的方法中的一個或多個步驟以及它們的組合按照錯流過濾操作。適合的錯流過濾器包括本領域中一般已知的那些，包括美國專利6，946，075中描述的那些。應當了解，流體的通過可以根據(jù)常規(guī)的和/或切向的(即，交錯的)流適當?shù)剡M行。還應當了解，流體穿越其它膜分離單元的通過可以根據(jù)這些機制中的一種或全部兩種進行，所述其它膜分離單元詳述于本文中與圖1A、1B、1C和ID中描述的實施方案以及其它方面相關的其它地方。本發(fā)明所描述的方法涉及選擇適當?shù)姆蛛x操作或操作的組合，以從大豆乳清流中順序移除多種組分和回收或分離KTI產(chǎn)品，所述KTI產(chǎn)品包含本領域此前尚未達到的水平的純度。一般而言，并且如本文中其它地方所詳述的，用于回收KTI蛋白的方法利用膜分離和層析分離(例如，離子交換)操作的組合。如本文中其它地方所指出的，通過本公開的方法處理的含水的大豆乳清流一般是相對稀釋的。在多個方面，在回收作為靶標的個別的蛋白之前，含水的大豆乳清通過，例如，水的移除，以至少約2 (例如，約3或約6)的濃縮系數(shù)被濃縮。與用于回收KTI蛋白的其它方法相比，至少部分地由于其處理含水的大豆乳清的多個樣品的能力，通過模擬移動床(SMB)層析回收KTI蛋白一般也可以提供低成本、通量、和/或靈活性的優(yōu)勢。已經(jīng)被注意到，大豆乳清流的一種或多種組分可以干擾KTI蛋白的回收。例如，在大豆蛋白分離物制造過程中，硅化合物(通常為硅氧烷)經(jīng)常作為消泡劑被引入，通常是以包含娃的化合物的形式，例如可從Hydrite Chemical或Emerald Performance Materials商購獲得的那些。無論確切的來源如何，有機硅化合物通常以按硅含量計至高約15份每一百萬份(ppm)、至高約lOppm、或至高約5ppm的濃度存在于大豆乳清流中。有機娃化合物的存在一般是非期望的，因為它可以干擾大豆乳清流的KTI蛋白的回收。
相應地，在多個方面，在用于回收和分離KTI蛋白的操作之前，硅氧烷和/或其它有機硅化合物被從大豆乳清流中移除，如本文中其它地方所詳述的。優(yōu)選地，硅化合物被移除至使得大豆乳清包含不超過痕量級有機硅的程度，如本文中其它地方所詳述的。附加地或作為另外一種選擇，含水的大豆乳清可以包含一種或多種微生物，所述微生物可以干擾所述含水的大豆乳清的所期望的組分的回收，和/或在所述方法的最終的回收的產(chǎn)品中是非期望的。為了移除這些干擾組分，可以使用選擇性保留硅消泡劑和/或一種或多種微生物的分離膜過濾所述大豆乳清流，以產(chǎn)生包含硅和/或一種或多種微生物的保留物和包含含水的大豆乳清的透過物。這一初始純化中使用的特定的膜(包括，例如，微量過濾)是根據(jù)待移除的組分選擇的。無論所選擇的膜的類型和從大豆乳清流中移除的組分如何，優(yōu)選所期望的KTI蛋白的至少主要部分，并且優(yōu)選所期望的KTI蛋白的基本上全部存在于保留物中。此外，就這一點而言，應當注意的是，提及包含含水的大豆乳清的透過物時表示用于移除一種或多種雜質(zhì)的對乳清流的處理對所述大豆乳清流的其它組分具有很小的(如果存在的話)影響。 在多個供選擇的替代方面，所述乳清流中包含的細菌可以在蛋白的回收之前通過加熱被殺死。加熱大豆乳清流以殺滅細菌的方式是不嚴格的，并且一般可以根據(jù)本領域已知的常規(guī)方法進行。分離技術(shù)領域的技術(shù)人員知道，由于分離不會是100%，在每一流中能夠存在殘余的組分。此外，本領域的技術(shù)人員了解，分離技術(shù)能夠依賴于起始的原材料而變化。步驟0(參見圖IA)-乳清蛋白預處理能夠從包括但不限于大豆分離蛋白(ISP)糖漿、ISP乳清、大豆蛋白濃縮物(SPC)糖漿、SPC乳清、功能性大豆蛋白濃縮物(FSPC)乳清、以及它們的組合的進料流開始。能夠用于乳清蛋白預處理步驟中的加工助劑包括但不限于酸、堿、氫氧化鈉、氫氧化鈣、鹽酸、水、蒸汽、以及它們的組合。在調(diào)節(jié)PH之后，步驟O的pH能夠是介于約3. O和約6. O之間、或介于3. 5和5. 5之間或約5. 3。溫度能夠是介于約70°C和約95°C之間或約85°C。溫度保持時間能夠在約O分鐘至約20分鐘之間或約10分鐘變化。在保留時間之后，所述流通過一個離心分離步驟(通常在間歇放電圓盤式凈化離心機中)，以從所述乳清流中分離沉淀。來自乳清蛋白預處理的產(chǎn)物包括但不限于流Oa中的乳清流(預處理的大豆乳清)的水相中的可溶性組分(分子量等于或小于約50千道爾頓(kDa))和流Ob中的不溶性大分子量蛋白(介于約300kDa和約50kDa之間)，例如預處理的大豆乳清、貯藏蛋白、以及它們的組合。步驟I (參見圖IA)-微生物的降低能夠以上述乳清蛋白預處理步驟的產(chǎn)物開始，包括但不限于預處理的大豆乳清。本步驟涉及預處理的大豆乳清的微量過濾。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于離心、死端過濾、加熱滅菌、紫外滅菌、微量過濾、錯流膜過濾、以及它們的組合。錯流膜過濾包括但不限于螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動態(tài)或旋轉(zhuǎn)盤、納米纖維、以及它們的組合。步驟I的PH能夠是介于約2. O和約12. O之間、或介于約3. 5和約5. 5之間或約5. 3。溫度能夠是介于約5°C和約90°C之間、或介于約25°C和75°C之間或約50°C。來自步驟I的產(chǎn)物包括但不限于流Ia中的貯藏蛋白、微生物、硅、以及它們的組合和流Ib中的純化的預處理的大豆乳清。步驟2 (參見圖IA)-水和礦物的移除能夠以來自流Ib或4a的純化的預處理的大豆乳清、或來自流Ob的預處理的大豆乳清開始。其包括用于水的移除和部分礦物的移除的納濾步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于錯流膜過濾、反向滲透、蒸發(fā)、納濾、以及它們的組合。錯流膜過濾包括但不限于螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動態(tài)或旋轉(zhuǎn)盤、納米纖維、以及它們的組合。步驟2的pH能夠是介于約2. O和約12. O之間、或介于約3. 5和約5. 5之間或約5. 3。溫度能夠是介于約5°C和約90°C之間、或介于約25°C和75°C之間或約50°C。來自這一水移除步驟的產(chǎn)物包括但不限于流2a中的純化的預處理的大豆乳清和流2b中的水、一些礦物、一價陽離子、以及它們的組合。步驟3 (參見圖IA)-礦物沉淀步驟能夠以來自流2a的純化的預處理的大豆乳清或來自流Oa或Ib的預處理的大豆乳清開始。其包括通過pH和/或溫度變化沉淀的步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于攪拌的或再循環(huán)的反應槽。能夠用于礦物沉淀步驟中的加工助劑包括但不限于酸、堿、氫氧化鈉、氫氧化鈣、鹽酸、氯化鈉、肌醇六磷酸酶、以及它們的組合。步驟3的pH能夠是介于約2. O和約12. O之間、或介于約6. O和約9. O之間或約8. O。溫度能夠是介于約5°C和約90°C之間、或介于約25°C和75°C之間或約50°C。pH保持時間能夠介于約O分鐘至約60分鐘之間、或介于約5分鐘和約20分鐘之間或約10分鐘變化。流3的產(chǎn)物是純化的預處理的大豆乳清和沉淀的礦物的 懸液。步驟4(參見圖IA)-礦物移除步驟能夠以來自流3的純化的預處理的大豆乳清和沉淀的礦物的懸液開始。其包括離心步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于離心、過濾、死端過濾、錯流膜過濾、以及它們的組合。錯流膜過濾包括但不限于螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動態(tài)或旋轉(zhuǎn)盤、納米纖維、以及它們的組合。來自礦物移除步驟的產(chǎn)物包括但不限于流4a中的去礦物化的預處理的乳清和流4b中的不溶性礦物與一些蛋白礦物復合物。步驟5 (參見圖IB)-蛋白分離和濃縮步驟能夠以來自流4a的純化的預處理的乳清或來自流0a、lb、或2a的乳清開始。它包括超濾步驟。能夠用于超濾步驟中的加工助劑包括但不限于酸、堿、氫氧化鈣、氫氧化鈉、鹽酸、以及它們的組合。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于錯流膜過濾、超濾、以及它們的組合。錯流膜過濾包括但不限于螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動態(tài)或旋轉(zhuǎn)盤、納米纖維、以及它們的組合。步驟5的pH能夠是介于約2. O和約12. O之間、或介于約6. O和約9. O之間或約8. O。溫度能夠是介于約5°C和約90°C之間、或介于約25°C和75°C之間或約50°C。來自流5a的產(chǎn)物包括但不限于大豆乳清蛋白、BBI、KTI、貯藏蛋白、其它蛋白以及它們的組合。來自流5b的產(chǎn)物包括但不限于鈦、大豆低聚糖、礦物、以及它們的組合。步驟6 (參見圖IB)-蛋白洗滌和純化步驟能夠以來自流4a或5a的大豆乳清蛋白、BBI、KTI、貯藏蛋白、其它蛋白或純化的預處理的乳清、或來自流0a、lb、或2a的乳清開始。其包括滲濾步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于再漿化、錯流膜過濾、超濾、水滲濾、緩沖液滲濾、以及它們的組合。錯流膜過濾包括但不限于螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動態(tài)或旋轉(zhuǎn)盤、納米纖維、以及它們的組合。能夠用于蛋白洗滌和純化步驟中的加工助劑包括但不限于水、流、以及它們的組合。步驟6的pH能夠是介于約2. O和約12. O之間、或介于約6. O和約9. O之間或約7. O。溫度能夠是介于約5°C和約90°C之間、介于約25°C和75°C之間或約50°C。來自流6a的產(chǎn)物包括但不限于大豆乳清蛋白、BBI、KTI、貯藏蛋白、其它蛋白、以及它們的組合。來自流6b的產(chǎn)物包括但不限于鈦、大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合。步驟7 (參見圖IC)-水移除步驟能夠以來自流5b和/或流6b的鈦、大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合開始。其包括納濾步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于反向滲透、蒸發(fā)、納濾、水滲濾、緩沖液滲濾、以及它們的組合。步驟7的pH能夠是介于約2. O和約12. O之間、或介于約6. O和約9. O之間或約7. O。溫度能夠是介于約5°C和約90°C之間、介于約25°C和75°C之間或約50°C。來自流7a的產(chǎn)物包括但不限于鈦、大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合。來自流7b的產(chǎn)物包括但不限于水、礦物、以及它們的組合。步驟8(參見圖IC)-礦物移除步驟能夠以來自流5b、6b、7a、和/或12b的鈦、大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合開始。其包括電滲析膜步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于離子交換柱、層析、以及它們的組合。能夠用于這一礦物移除步驟中的加工助劑包括但不限于水、酶、以及它們的組合。酶包括但不限于蛋白酶、 肌醇六磷酸酶、以及它們的組合。步驟8的pH能夠是介于約2. O和約12. O之間、或介于約6. O和約9. O之間或約7. O。溫度能夠是介于約5°C和約90°C之間、介于約25°C和50°C之間或約40°C。來自流8a的產(chǎn)物包括但不限于具有介于約10毫西門子/厘米(mS/cm)和約O. 5mS/cm之間或約2mS/cm的電導率的去礦物化的大豆低聚糖。來自流8b的產(chǎn)物包括但不限于水、礦物、以及它們的組合。步驟9 (參見圖IC)-顏色移除步驟能夠以來自流8&、513、613、1213、和/或7&的去礦物化的大豆低聚糖開始。其利用活性炭床。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于離子交換。能夠用于這一顏色移除步驟中的加工助劑包括但不限于活性炭、離子交換樹脂、以及它們的組合。溫度能夠是介于約5°C和約90°C之間或約40°C。來自流9a的產(chǎn)物包括但不限于顏色化合物。流9b為脫色的溶液。來自流9b的產(chǎn)物包括但不限于大豆低聚糖、以及它們的組合。步驟10 (參見圖10_大豆低聚糖分餾步驟能夠以來自流％、513、613、7&、和/或8&的大豆低聚糖、以及它們的組合開始。其包括層析步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于層析、納濾、以及它們的組合。能夠用于這一大豆低聚糖分餾步驟中的加工助劑包括但不限于酸或堿，以如本領域的技術(shù)人員所知地基于所使用的樹脂調(diào)節(jié)pH。來自流IOa的產(chǎn)物包括但不限于大豆低聚糖。來自流IOb的產(chǎn)物包括但不限于大豆低聚糖。步驟11 (參見圖IC)-水移除步驟能夠以來自流9b、5b、6b、7a、8a和/或IOb的大豆低聚糖開始。其包括蒸發(fā)步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于反向滲透、蒸發(fā)、納濾、以及它們的組合。能夠用于這一水移除步驟中的加工助劑包括但不限于消泡劑、流、真空、以及它們的組合。溫度能夠是介于約5°C和約90°C之間或約60°C。來自流Ila的產(chǎn)物包括但不限于水。來自流Ilb的產(chǎn)物包括但不限于大豆低聚糖。步驟12(參見圖IC)-附加的從大豆低聚糖分離蛋白的步驟能夠以來自流7a、5b、和/或6b的鈦、大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合開始。其包括超濾步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于錯流膜過濾、孔徑介于約50kDa和約IkDa之間的超濾、以及它們的組合。錯流膜過濾包括但不限于螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動態(tài)或旋轉(zhuǎn)盤、納米纖維、以及它們的組合。能夠用于這一從糖類分離蛋白的步驟的加工助劑包括但不限于酸、堿、蛋白酶、肌醇六磷酸酶、以及它們的組合。步驟12的pH能夠是介于約2. O和約12. O之間、約7. O。溫度能夠是介于約5°C和約90°C之間、介于約25°C和75°C之間或約50°C。來自流12b的產(chǎn)物包括但不限于大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合。來自流12a的產(chǎn)物包括但不限于肽、其它蛋白、以及它們的組合。步驟13 (參見圖IC)-水移除步驟能夠以來自流12a的肽和其它蛋白開始。其包括蒸發(fā)步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于反向滲透、納濾、噴霧干燥、以及它們的組合。來自流13a的產(chǎn)物包括但不限于水。來自流13b的產(chǎn)物包括但不限于肽、其它蛋白、以及它們的組合。步驟14 (參見圖1B)-蛋白分餾步驟可以通過以來自流6a和/或5a的大豆乳清蛋白、BBI、KTI、貯藏蛋白、其它蛋白、以及它們的組合開始進行。其包括超濾(具有300kDa至IOkDa的孔徑)步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于錯流膜過濾、超濾、納濾、以及它們的組合。錯流膜過濾包括但不限于螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動態(tài)或旋轉(zhuǎn)盤、納米纖維、以及它們的組合。步驟14的pH能夠是介于約2. O和約12. O之間、或介于約6. O和約9. O之間或約7. O。溫度能夠是介于約5°C和約90°C之間、介 于約25°C和75°C之間或約50°C。來自流14a的產(chǎn)物包括但不限于貯藏蛋白。來自流14b的產(chǎn)物包括但不限于大豆乳清蛋白、BBI、KTI、其它蛋白、以及它們的組合。步驟15 (參見圖IB)-水移除步驟能夠以來自流6a、5a、和/或14b的大豆乳清蛋白、BBI、KTI和其它蛋白開始。其包括蒸發(fā)步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于蒸發(fā)、納濾、R0、以及它們的組合。來自流15a的產(chǎn)物包括但不限于水。流15b產(chǎn)物包括但不限于大豆乳清蛋白、BBI、KTI、其它蛋白、以及它們的組合。步驟16(參見圖IB)-熱處理步驟和瞬間冷卻步驟能夠以來自流6a、5a、14b、和/或15b的大豆乳清蛋白、BBI、KTI和其它蛋白開始。其包括超高溫步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限于加熱滅菌、蒸發(fā)、以及它們的組合。能夠用于這一熱處理和瞬間冷卻步驟中的加工助劑包括但不限于水、流、以及它們的組合。所述加熱步驟的溫度能夠是介于約129°C和約160°C之間或約152°C。溫度保持時間能夠是介于約8秒和約15秒之間或約9秒。瞬間冷卻后，溫度能夠是介于約50°C和約95°C之間或約82V。來自流16的產(chǎn)物包括但不限于大豆乳清蛋白。步驟17 (參見圖18)-干燥步驟能夠以來自流6&、5&、1413、1513、和/或16的大豆乳清蛋白、BBI、KTI和其它蛋白開始。其包括干燥步驟。液體進料溫度能夠是介于約50°C和約95°C之間或約82°C。入口溫度能夠是介于約175°C和約370°C之間或約290°C。排氣溫度能夠是介于約65°C和約98°C之間或約88°C。來自流17a的產(chǎn)物包括但不限于水。來自流17b的產(chǎn)物包括但不限于大豆乳清蛋白，其包括BBI、KTI、以及其它蛋白。圖ID描述了用于從在大豆蛋白分離物的生成中產(chǎn)生的大豆乳清流中回收一直或多種單獨的蛋白的本公開的方法的實施方案。盡管未描述于圖ID中，乳清蛋白預處理能夠從處理包括但不限于大豆分離蛋白(ISP)糖漿、ISP乳清、大豆蛋白濃縮物(SPC)糖漿、SPC乳清、功能性大豆蛋白濃縮物(FSPC)乳清、以及它們的組合的進料流開始。能夠用于乳清蛋白預處理步驟中的加工助劑包括但不限于酸、堿、氫氧化鈉、氫氧化鈣、鹽酸、水、蒸汽、以及它們的組合。所述預處理步驟的pH能夠是介于約3. O和約6. O之間，并且優(yōu)選4. 5。溫度能夠是介于約70°C和約95°C之間，并且優(yōu)選約85°C。溫度保持時間能夠介于約O分鐘至約20分鐘之間，并且優(yōu)選約10分鐘變化。來自乳清蛋白的預處理的產(chǎn)物包括但不限于保留物中的乳清流(預處理的大豆乳清)的水相中的可溶性組分(分子量等于或小于約50千道爾頓(kDa))和透過物中的不溶性大分子量蛋白(介于約300kDa和約50kDa之間)，例如預處理的大豆乳清、貯藏蛋白、以及它們的組合。如圖ID中所示，所述大豆乳清I (其可進行預處理)被引入包含第一過濾進料區(qū)域6的膜分離單元5中，所述第一過濾進料區(qū)域6以比分離膜7另一側(cè)的第一透過區(qū)域8中的壓力更高的壓力與所述膜的一側(cè)接觸。優(yōu)選地，膜分離單元5包含至少一種微孔濾膜?？缭侥し蛛x單元5中的分離膜7的跨膜壓力一般是至少約lpsi、至少約5psi、至少約lOpsi、至少約20psi、至少約30psi、至少約40psi、至少約50psi、或至少約75psi。流體通常以至少約I升流體/小時/平方米、或約I升流體/小時/平方米至約400升流體/小時/平方米橫截面膜區(qū)域(橫向于流動方向)的體積流量或流量通過所述膜。流量可 以被，例如，過濾的類型、膜的污染等影響。大豆乳清典型以約0°C至約100°C，更典型以約25°C至約75°C的溫度被引入所述膜分離單元的過濾進料區(qū)域。通常，含水的大豆乳清I由于保留物的原因體積減少約5%。流體穿越分離膜的通過導致第一保留物9和第一透過區(qū)域8中的第一透過物13。所述第一保留物9將主要包含一種或多種微生物和不溶性材料，更具體地講，所述第一保留物9通常相對于所述第一透過物13富集了微生物。優(yōu)選地，所述第一保留物9包含所述含水的大豆乳清的微生物含量的主要部分(如果不是基本上全部)。甚至更優(yōu)選地，所述第一保留物9還包含消泡劑(例如，存在于所述含水的大豆乳清中的有機硅的硅或包含脂質(zhì)的化合物)的主要部分，更具體地講，基于消泡劑含量，所述第一保留物9包含至少約70重量％，更優(yōu)選至少約80重量％，甚至更優(yōu)選至少約90重量％的含水的大豆乳清的消泡劑含量。所述第一透過物13將主要包含所述含水的大豆乳清流的全部的多種剩余組分，例如可溶性大豆貯藏蛋白、大豆乳清蛋白、多種糖類、水、礦物、異黃酮素和維生素。再次就圖ID而言，所述第一透過物13被引入包含第二過濾進料區(qū)域18的膜分離單元17中，所述第二過濾進料區(qū)域18以比第二透過區(qū)域20中的壓力更高的壓力與分離膜19的一側(cè)接觸。膜分離單元17優(yōu)選包含至少一種超濾膜作為分離膜19。跨越膜分離單元17中的分離膜19的跨膜壓力一般是至少約5psi、至少約lOpsi、至少約25psi、至少約50psi、至少約lOOpsi、或至少約150psi。流體通常以至少約I升流體/小時/平方米、或約I升流體/小時/平方米至約150升流體/小時/平方米橫截面膜區(qū)域(橫向于流動方向)的體積流量或流量通過所述膜。大豆乳清典型以約(TC至約100°C，更典型以約25°C至約75°C的溫度被引入所述膜分離單元的過濾進料區(qū)域。通常，含水的大豆乳清I以至少約
5、或約5至約75(例如，約25)的濃縮系數(shù)被濃縮。超濾步驟可以任選地包括滲濾。滲濾體積通常為約I直到約10份滲濾體積每份保留物范圍。流體穿越所述分離膜的通過導致第二保留物21和第二透過物25。所述第二保留物21包含所述含水的大豆乳清的大部分蛋白含量，并因此被進一步處理，以回收KTI蛋白。優(yōu)選地，所述第二保留物21包含存在于被引入所述第一過濾進料區(qū)域6的含水的大豆乳清中的多種大豆乳清蛋白的至少約25重量％至至少約90重量％ (例如，至少約50重量％ )(基于干重)。再次就圖ID而言，所述第二透過物25—般包含沒有被回收至第二保留物21中的任何蛋白和所述大豆乳清流的多種其它組分(例如，多種糖類、水、礦物、維生素和異黃酮素)。盡管未圖示于圖ID中，所述第二透過物25的組分可以按照適當?shù)姆蛛x操作被進一步處理，以分離和/或移除來自所述含水的乳清流的單獨的組分。在附加的分離步驟之后，將優(yōu)選地形成相對純的水流，其在被處置或使用之前需要最低限度的處理(如果存在的話)。因此，本文所述的發(fā)明還通過，例如，改善環(huán)境品質(zhì)處理了環(huán)境有益效果。將所述第二保留物21與載體流23混合以形成進料24，通向包含至少一種離子交換樹脂30的離子交換柱或單元29。所述載體流的確切位置不被嚴格要求。通常，所述載體流的PH是約I至約7，更典型是約2至約6，更典型是約2至約5，甚至更典型是約3至約 4。在KTI蛋白的回收的多個方面，所述載體流包括非揮發(fā)性的緩沖液，包括如檸檬酸鈉，或揮發(fā)性的緩沖液，包括如甲酸銨。例如，在多個方面，所述載體流包括在含水混合物中以約10毫摩爾每升至約30毫摩爾每升(例如，20mM)包含反離子的緩沖液。所述第二保留物21和/或進料流24的pH影響大豆蛋白的溶解度，而沉淀的蛋白可以導致離子交換柱的污染。因此，可能期望將流向離子交換柱的進料的PH控制在某些范圍內(nèi)(例如，通過緩沖作用)。如果必要，可以通過，例如，稀釋所述第二保留物、載體流和/或通過所述保留物和載體流的混合提供的進料，將所述進料的PH維持在所述范圍內(nèi)。稀釋劑的組成沒有嚴格要求，通常為可以由本領域的技術(shù)人員容易地選擇的含水介質(zhì)(例如，去離子水)。除了影響所述進料的PH外，稀釋還通常降低所述進料的內(nèi)在離子強度，這促進了蛋白與離子交換樹脂的結(jié)合。附加地或作為另外一種選擇，所述進料的PH可以通過載體流的選擇來控制。離子交換樹脂被選擇為適用于第二保留物21和進料24中存在的一種或多種蛋白的選擇性保留和回收。在多個方面，所述離子交換樹脂被選擇用于KTI蛋白的選擇性保留或非KTI蛋白的保留，使得KTI蛋白與非KTI蛋白分離。以下的討論聚焦在從含水的大豆乳清(例如，第二保留物21)中回收和分離KTI蛋白上。然而，應當了解，下列的流程能夠容易地適應其它靶蛋白(例如BBI蛋白)的回收以及含水的之外的其它類型的輸入流(例如，從噴霧干燥的復原的)。無論離子交換單元的確切配置如何，適用于KTI蛋白的回收的離子交換樹脂包括多種陽離子和陰離子交換樹脂。依賴于進入離子交換柱的進料，盡管陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂均適用于回收KTI蛋白，所述離子交換樹脂在多個方面包括陽離子交換樹月旨。例如，暴露于低于其等電點(Pi)的PH中的蛋白更可能具有帶正電荷的區(qū)域，并因此更牢固地與陽離子交換樹脂結(jié)合。所述進料流中的大多數(shù)蛋白(例如，大豆貯藏蛋白)具有比KIT的Pl和所述進料通常的pH更高的pi。因此，這些蛋白通常更牢固地與所述樹脂結(jié)合。包含KTI蛋白的部分可以通過使樹脂與適當?shù)南疵搫┙佑|而被容易地從離子交換柱上洗脫。作為另外一種選擇，所述進料的pH可以被控制為低于KTI蛋白的pl，以通過離子交換樹脂提供KTI蛋白的保留。其它蛋白(例如BBI蛋白)也與樹脂結(jié)合。然而，所期望的部分的回收可以通過使離子交換樹脂與用于蛋白部分的差別洗脫的適當?shù)南疵摍C接觸進行。
適當?shù)年栯x子交換樹脂包括本領域所熟知的多種樹脂。在至少一個實施方案中，所述離子交換樹脂包括Poros 20HS-由Applied Biosystems制造的交聯(lián)的多聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基質(zhì)，其表面涂覆了用磺基丙基(例如，丙烷磺酸，(OH)2S(O)-(CH2)3-)官能化的多羥基聚合物。再次就圖ID而言，在進料24通過了離子交換柱30之后，回收洗脫了 KTI蛋白流
33。為了進一步純化KTI蛋白流33并達到95%或更高的純度，可以通過使用親和層析(未描述于圖ID中)分離所述KTI蛋白流33。親和層析是通常在單個步驟中提供>95%純度的純化技術(shù)。它利用靶分子的天然的或添加的特異性性質(zhì)來將其與樣品中的全部雜質(zhì)分離。為了純化KTI蛋白流33，在之前的步驟中尚未被移除的剩余的雜質(zhì)(主要是大豆凝集素)，能夠容易地通過親和層析被移除。任何預制的應用特異性樹脂(即，具有連接至其表面的特異性針對待分離化合物的配體的樹脂)能夠被使用和平衡，例如，N-乙酰-D-半乳糖胺樹脂(目錄號A2787, Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO)。使用本領域已知的方法，將KTI蛋白流33調(diào)節(jié)至與所述樹脂相同的緩沖液組成，并施加至親和柱，雜質(zhì)從而粘附至樹脂，而穿流被收集作為純化的KTI部分。 圖2示出了對如圖ID所示的本發(fā)明的方法過程中分離的多種保留物和透過物的SDS-PAGE純度分析，包括KTI蛋白流33。泳道I描述了分離之前的大豆乳清的組成并且顯示了多重組分的存在。與此相對，泳道5描述了在圖ID中所示的多個分離操作之后富集的KTI部分(即，KTI蛋白流33)。兩個條帶的存在表明，在圖ID的分離過程之后，KTI蛋白和一種其它雜質(zhì)(基于所述KTI部分的分子量推測其為大豆凝集素)已從大豆乳清中分離。剩余的雜質(zhì)(即，大豆凝集素)的移除能夠如實施例中所示通過親和層析完成，以獲得幾乎不含附加的組分并具有高水平的純度(> 95% )的KTI產(chǎn)品。圖1A、1B、1C和ID中所描述的方法設計不限于原料或以上所示的大豆乳清組分的分離和回收的順序，并且可被用于制備與上文所論及的那些不同的工藝流，包括，例如，如所附權(quán)利要求中所示的。E.制備KTI的方法在某些實施方案中，本發(fā)明的KTI蛋白通過，例如，重組方法或合成產(chǎn)生。本發(fā)明的蛋白的重組制備使用本領域的普通技術(shù)人員已知的標準技術(shù)進行。此類方法包括，例如，制備一種或多種編碼核酸序列，這能夠通過基于聚合酶鏈反應(PCR)的方法用全長cDNA序列作為模板進行。在制備了所期望的核酸序列之后，該序列被插入表達載體(包括，例如，大腸桿菌(Escherichia coli)pCAL_n表達質(zhì)粒)中,然后將其轉(zhuǎn)入微生物；然后，使用選擇標記(包括，例如，抗生素抗性選擇標記或突光選擇標記)，進行對包含含有所期望序列的質(zhì)粒的克隆的選擇；然后大量制備包含含有所期望序列的質(zhì)粒的克??；并從所期望的克隆純化肽(參加，例如，Gorlatov等人所述的方法，Biochemistry (2002)41,4107-4116 ;美國專利4，980，456)。作為另外一種選擇，本發(fā)明的肽能夠通過合成方法或半合成方法(例如，重組制備和合成方法的組合)制備。合成制備能夠通過，例如，應用根據(jù)Carpino L. A.和Han. G Y, J. (Amer. Chem.Soc. ,1981 ；37 ；3404-3409)的芴甲氧羰基保護基團策略或叔-丁氧羰基(t-Boc)-保護基團策略進行。肽使用多重肽合成儀合成，例如，通過根據(jù)Merrifield R. B. (J. Amer. Chem.Soc.，1963 ;85，2149-2154)的固相肽合成方法。然后對粗制肽進行純化。
用于本發(fā)明的蛋白的合成制備的示例性方法描述于下文中。IOOmgTentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)以O. 24mmol/g的載量被轉(zhuǎn)入可商購獲得的肽合成設備(PSMM (Shimadzu))中，其中肽序列根據(jù)碳二亞胺/HOBt方法被逐步構(gòu)建。FMOC-氨基酸衍生物通過加入5倍克分子數(shù)相等的過量二異丙基碳二亞胺(DIC)、二異丙基乙胺(DIPEA)和羥基苯并三唑(HOBt)，然后轉(zhuǎn)入反應容器，與樹脂載體混合30分鐘而被預激活。洗滌步驟通過，例如，添加DMF并徹底混合I分鐘進行。裂解步驟通過，例如，在DMF中添加哌啶并徹底混合4分鐘進行。單個反應的移除和洗滌溶液通過迫使溶液通過反應容器的底部玻璃料實現(xiàn)。使用了氨基酸衍生物 FM0C-Ala、FM0C-Arg (Pbf),FMOC-Asp,FMOC-Gly,FMOC-His (Trt)、FMOC-Ile, FMOC-Leu, FMOC-Lys (BOC)、FMOC-Pro, FMOC-Ser (tBu)和 FMOC-Tyr (tBu)(Orpegen)。當合成完成時，干燥肽樹脂。隨后通過在室溫用三氟乙酸/TIS/EDT/水(體積比95 : 2 : 2 : I)處理2小時裂解肽酰胺。通過過濾、濃縮所述溶液和通過加入冰冷的乙醚沉淀，獲得固體形式的粗產(chǎn)物。在O. 1% TFA中以5-60%梯度乙腈在40分鐘內(nèi)以12ml/min的流量通過RP-HPLC純化肽，并通過UV檢測器方法在215nm評估洗脫液。通過分析型RP-HPLC和質(zhì)譜測定了單個部分的純度。F.使用方法 在本發(fā)明的多個方面，本發(fā)明的KTI蛋白能夠被用于促進皮膚健康。促進皮膚健康的實例包括皮膚變色或色素沉著的減少、炎癥的減少、皺紋的最小化、皺紋的除去、脫色、著色、皮膚軟化、皮膚平滑化、脫毛和清潔。與此相關的皮膚健康的其它實例和實驗方法可見于美國專利申請公布 20100093028、20100092409、20090111160、20080249029、美國專利6,555，143 (亦參見 Chen 等人，Photochemistry and Photobiology, 2008,84 :1551-1559 和Paine 等人，J. Invest. Dermatol. 200IApr ；116 (4) :587-95)。定義為了更好的理解本發(fā)明，下文定義了幾個術(shù)語。如本文所用，術(shù)語“酸可溶的”是指物質(zhì)在具有約2至約7的pH的含水介質(zhì)中以10克每升(g/L)的濃度具有至少約80%的溶解度。如本文所用，術(shù)語“大豆分離蛋白”或“分離大豆蛋白”是指按無水計具有至少約90 %的大 蛋白的蛋白含量的大 材料。如本文所用，術(shù)語“對象”是指需要對病理狀態(tài)進行處理的哺乳動物(優(yōu)選人類)、鳥、魚、爬行動物、兩棲動物，所述病理狀態(tài)包括但不限于與肌肉相關的疾病、非受控的細胞生長、自體免疫疾病和癌癥。如本文所用，術(shù)語“工藝流”是指來源于精煉完整的豆類或油料種子的方法的次級或附帶的產(chǎn)物，包括含水的或溶劑流，其包括，例如，含水的大豆提取流、含水的豆?jié){提取流、含水的大豆乳清流、含水的大豆糖漿流、含水的大豆蛋白濃縮物大豆糖漿流、含水的大豆透過流和含水的豆腐乳清流，并且附加地包括例如液體和干粉形式的大豆乳清蛋白，其能夠根據(jù)本文所公開的方法被回收作為中間產(chǎn)物。如本文所用，術(shù)語“大豆乳清蛋白”是指在大豆貯藏蛋白通常不溶解的pH可溶的蛋白，包括但不限于BBI、KTI、露那辛、脂氧合酶、脫水蛋白、凝集素、肽、以及它們的組合，并且還涵蓋貯藏蛋白。將在整個專利申請中提到的其它蛋白定義為包括但不限于露那辛、凝集素、脫水蛋白、脂氧合酶、以及它們的組合。大豆低聚糖被定義為包括但不限于糖。糖被定義為包括但不限于蔗糖、棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖、單糖、以及它們的組合。當介紹本發(fā)明或其優(yōu)選實施方案的要素時，冠詞“一個”和“所述”旨在表示一個或多個要素。術(shù)語“包含”、“包括”和“具有”旨在表示包容性并且表示除列出要素外還可以有其它要素。在不脫離本發(fā)明范圍的條件下，可對以上化合物、產(chǎn)品和方法進行各種更改，這意味著可將上文描述和下文實施例中包含的所有內(nèi)容理解為例證性的而非限定性的。
實施例 實施例I :從大豆乳清蛋白中回收KTI蛋白具有大約3. 7重量％的總固體含量和22. 5重量％ (基于干重)的總蛋白含量的含水的大豆乳清(1451)被引入包含BTS-25或MMM O. 45微米微孔濾膜的0PTISEP 7000過濾模塊中。含水的大豆乳清穿越膜的通過形成了包含含水的大豆乳清的透過物(1321，具有3. 2重量％的固體含量)以及包含大于99%的大豆乳清初始細菌含量和大于90%的大豆乳清硅消泡劑含量的保留物。復I:實驗中所使用的膜的描述
膜名稱膜類型HiS制造商
BTS-25微量過濾(MF)聚砜(PS)O. 5μιηΡ^
MMM O. 45 μ m 微量過濾(MF)改性聚砜(MPS)O. 45μιηPall
RC IOOkDa 超濾(UF)再生纖維素(RC)IOOkDaMicrodyn-Nadir
PES 5kDa超濾(UF)聚釀諷(PES)5kDaMicrodyn-Nadir
NF PES 30 納濾(NF)聚醚砜(PES)30%脫 NaCl Microdyn-Nadir
NF 20納濾(NF)聚砜薄膜35%脫NaCl Sepro
SG反向滲透(RO)Se98. 2%! NaClGE來自微量過濾模塊的透過物(1321)被引入包含具有大約IOOkDa的孔徑的再生纖維素(RC)超濾膜的0PTISEP 7000過濾模塊中。透過物穿越超濾膜的通過形成包含糖、礦物和維生素的第二透過物以及具有大約25. 4重量％的固含量和大約83重量％ (基于干燥)的總大豆蛋白含量的第二保留物(大約21)。通過使用Virtis Freezemobile 25XL凍干，干燥了第二保留物。將干燥樣品的等分試樣(53mg)懸浮于水中至25%的最終固體濃度，然后在室溫攪拌孵育10分鐘以促進溶解。以2000 Xg離心IOmin移除不溶的材料，并且將上清液用pH 3. O的20mM檸檬酸鈉進一步稀釋5x。所得pH下降導致所述混合物的一些組分沉淀，隨后以2000 Xg離心5min移除沉淀。將7X25mm Poros 50HS 柱(O. 8ml 床體積；Applied Biosystems)預平衡于 pH
3.O的20mM檸檬酸鈉緩沖液中。通過O. 45微米注射器過濾器過濾樣品，并將O. 5ml以lml/min流量應用于所述柱。用20倍柱體積的平衡緩沖液將未結(jié)合的蛋白洗出所述柱，然后使用40倍柱體積、IM氯化鈉在pH 3. O的20mM檸檬酸鈉緩沖液中0-100%線性梯度以Iml的部分回收結(jié)合的部分?？捡R斯染色的SDS-PAGE凝膠被用于分析每一部分?；邴恄，KTIapp局限于部分25-32中(參見圖2)。部分29和30被合并，并且使用改進的Lowry蛋白檢測分析法(Sigma-Aldrich總蛋白試劑盒，Micro-Lowry, Onishi和Barr改進)對總蛋白進行了分析。使用Kakade等人的流程(Kakade,M. L. , Simons,N.和Liener,I. E.,1969, An Evaluation of Natural vs. Synthetic Substrates for Measuringthe Antitryptic Activity of Soybeans, Cereal Chem. 46 :518)估算了 KTI 活性。合并的樣品的蛋白濃度被發(fā)現(xiàn)為O. 48mg/ml,并且比活性為708Ti單位/克蛋白。還就胰凝乳蛋白酶抑制活性對富集的KTI樣品進行了分析(使用Schechter, N. , Sprows, J., Schoenberger,0. ,Lazarus,G. ,Cooperman,B.和Rubin,H. ,1989,Reaction of Human SkinChymotrypsin-Iike Proteinase Chymase with Plasma Proteinase Inhibitors,J.Biol.Chem. 264 :21308-21315, Jameson, G. ff. , Roberts, D. V., Adams, R. ff. , Kyle, ff. S. A.和Elmore, D.T.,1973, Determination of the Operational Molarity of Solutions ofBovine a -Chymotrypsin, Trypsin, Thrombin and Factor Xa by SpectrofluorimetricTitration, Biochem. J. 131 :107-117)并且發(fā)現(xiàn)基本不含。因此，如本實施例所述制備的KTI不含BBI活性雜質(zhì)。在KTI純化過程中制備的多種部分的SDS-PAGE分析描述于圖3中。使用親和層析來移除泳道5中顯示的剩余的雜質(zhì)，能夠獲得具有> 95%純度的KTI。因此，將N-乙?；?D-半乳糖胺樹脂(目錄號 A2787, Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO)平衡于 pH 7. 4的20mM Tris,154mM NaCl中。使用本領域已知的方法，將富集的KTI部分調(diào)節(jié)至此相同的緩沖液組成并應用于親和柱。將雜質(zhì)與樹脂結(jié)合，并收集柱的穿流作為純化的KTI部分。實施例2 :通過質(zhì)譜確認KTI同一件使用下列流程將KTI純化至大約90%的純度(基于SDS-PAGE分析)。將I克大豆Bowman-Birk抑制劑濃縮物(BBIC，Central Soya Co. Lot#02176_2)重懸于 20ml pH 6. 8的20mM HEPES緩沖液中以得到5% (w/v)漿液。室溫下，在攪拌臺上使用磁力攪拌棒在燒杯中攪拌所述衆(zhòng)液20min以使所述材料完全水化,然后以10. OOOXg離心IOmin以移除不溶的材料。輕輕倒出所得上清液并通過O. 2 μ m過濾器過濾，并且將Iml濾液用起始緩沖液(25mM Tris, pH 7. 5)稀釋至10ml。然后,稀釋的樣品被立即以lml/min的流量應用于在起始緩沖液中平衡的Iml HiTrap DEAE FF柱(GE Healthcare目錄號17-5055-01)。在洗出未結(jié)合的蛋白之后，用O-IM NaCl在pH 7.5的20mM Tris中40倍柱體積線性梯度洗脫所述柱。洗脫過程中收集一 ml的部分，并通過SDS-PAGE進行分析(參見圖4)。在部分8-15中鑒定到KTIapp。部分All包含大約90%純的KTI，并且被選擇用于質(zhì)譜分析。因此，
12.5μ I的這一部分在10-20% SDS-PAGE凝膠上被分離、考馬斯染色，并被提交至質(zhì)譜分析(參見圖5)。分析在Donald Danforth Plant Sciences Center (St. Louis, MO)進行。因此，膠內(nèi)胰蛋白酶酶解過程被用于將KTIapp條帶裂解為肽，然后使用QStar XL nanospray-QTOF設備(Applied Biosciences)對其進行LC-MS/MS分析。針對NCBInr和TIGR大豆數(shù)據(jù)庫檢索了質(zhì)譜數(shù)據(jù)，以鑒定胰蛋白酶酶解的肽所來源的蛋白。條帶IA被鑒定為來自大豆的胰蛋白酶抑制劑亞型A，圖5。鑒定到的特異性肽是來自KTI的NELDKGIGTIISSPYR(aa 73-88)、FIAEGHPLSLK(aa 91-101), IGENKDAMDGffFR(aa 132-144)、VSDDEFNNYK(aa 148-157)和NKPLVVQFQK(aa 191-200)。實施例3 :使用膨脹床吸附^BA)層析從大暈大豆乳清蛋白中純化KTI用氫氧化鈉將200ml具有I. 92 %的總固體含量的含水的大豆乳清調(diào)節(jié)至pH
6.0，并且應用于在pH 6. O的IOmM檸檬酸鈉中平衡的I X 25cm Mimo6HE樹脂柱(UpFrontChromatography, Copenhagen Denmark)。材料在 20°C -25°C 使用 7. 5cm/min 的線性流量從下向上加載至柱上。每隔一定間隔收集柱的穿流樣品用于后期的分析。用10倍柱體積的平衡緩沖液將未結(jié)合的材料洗出柱，然后通過用30mM氫氧化鈉洗脫回收結(jié)合的材料。在 4-12%聚丙烯酰胺凝膠上分離了大豆乳清粉末懸浮液的EBA層析過程中回收的每一部分10 μ 1，并且用考馬斯亮藍R 250染料染色。柱的載樣、穿流、洗滌和氫氧化鈉洗脫樣品的SDS-PAGE分析描述于圖6中。如圖6中所用，RM :原材料(柱的載樣)；RT1_4 :在載樣過程中以相等間隔收集的穿流材料(穿流)；總計總穿流部分；W :柱的洗滌液；E :柱的洗脫液。明顯地看見大多數(shù)加載的蛋白洗脫于穿流中，而大多數(shù)的KTI蛋白依然結(jié)合在樹脂上。在洗脫液中回收總共355mg的蛋白(其大部分為KTI)，收率為1.8mg/ml起始材料。在這些條件下,這種樹脂的容量顯示為17. 8mg的KTI (加上微量雜質(zhì))每ml吸附劑。為了實現(xiàn)95%或更高的純度，所述材料將被凍干，然后重溶于最小體積的緩沖液(例如，包含IOOmM NaCl的pH 7.5的2OmM Tris)中，并且應用于在相同緩沖液中平衡的SupeiOse 6尺寸排阻層析柱。柱將以0. 5ml每分鐘的流量被使用，并且連續(xù)監(jiān)測洗脫液的280nm波長吸光度。部分的收集將在一個柱空體積的洗脫之后立即開始，并且使用SDS-PAGE將純化的KTI定位在特定的部分。包含KTI的部分將被合并，并且就胰蛋白酶抑制進行檢測以驗證純度。本領域的技術(shù)人員將容易地了解，本文所述的方法和組合物代表示例性的實施方案，并且不旨在限制本發(fā)明的范圍。對本領域的技術(shù)人員而言將顯而易見的是，可以對本文所公開的本公開進行不同的替換和修改，而不會背離本發(fā)明的范圍和精神。本說明書中提及的全部專利和出版物指示本公開所屬的領域的那些技術(shù)人員的水平。全部專利和出版物均以引用方式并入本文，其引用程度如同每一單獨的公布被特定和個別地以引用方式并入。本文適當?shù)乩C性地描述的本公開可以在未具體公開于本文中的任何元件或限制的不存在下實施。因此，例如，在本文的每一實例中，術(shù)語“包含/包括”、“基本上
由......組成”和“由......組成”中的任何一個可以被其它兩個術(shù)語之一替代。本文所
用的術(shù)語和表述被用于描述而并非進行限制，使用此類術(shù)語和表述并無意排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但公認的是在受權(quán)利要求書保護的本公開的范圍內(nèi)可以使用各種修改形式。因此，應當理解，雖然通過優(yōu)選實施方案和任選特征對本公開進行了具體描述，但是本領域的技術(shù)人員可借助本文所公開的概念的修改形式和變型形式，并且應當理解此類修改形式和變型形式在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.分離和純化具有至少95重量％的總KTI蛋白濃度的KTI產(chǎn)品的方法，其中所述方法包括使大豆蛋白工藝流通過至少一種分離操作以分離純化的KTI蛋白流。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述至少一種分離操作選自膜分離、層析分離、電泳、滲析、微粒過濾、沉淀、離心、結(jié)晶、重力分離、以及它們的任何組合。
3.權(quán)利要求I的方法，其中所述至少一種分離操作是膜分離。
4.權(quán)利要求3的方法，其中使所述大豆工藝流以至少約I升流體/小時/平方米的體積流量通過至少一種分離膜。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述體積流量是約I至約150升流體/小時/平方米。
6.權(quán)利要求4的方法，其中使所述大豆工藝流在約(TC至約100°C的溫度下通過所述至少一種分離膜。
7.權(quán)利要求4的方法，其中使所述大豆工藝流在約25°C至約75°C的溫度下通過所述至少一種分離膜。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種分離膜包括用于從所述大豆工藝流中移除雜質(zhì)的微孔濾膜。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述微孔濾膜的孔徑介于約O.I μ m和約20 μ m之間。
10.權(quán)利要求3的方法，其中所述至少一種分離操作還包括層析分離。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述層析分離是離子交換層析以及親和層析。
12.權(quán)利要求I的方法，其中所述純化的KTI產(chǎn)品包含與SEQID NO 1至少80%相同的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求I的方法，其中所述純化的KTI產(chǎn)品包含與SEQID NO 1至少85%相同的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求I的方法，其中所述純化的KTI產(chǎn)品包含與SEQID NO 1至少90%相同的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求I的方法，其中所述純化的KTI產(chǎn)品包含與SEQID NO 1至少95%相同的氨基酸序列。
16.分離和純化具有至少95重量％的總KTI蛋白濃度的KTI產(chǎn)品的方法，其中所述方法包括 (a)使包含大豆蛋白和雜質(zhì)的大豆工藝流通過至少一種分離技術(shù)以形成第一透過物和第一保留物，其中所述雜質(zhì)由大豆貯藏蛋白、微生物、礦物和糖構(gòu)成，所述第一透過物包含所述大豆蛋白，并且所述保留物包含所述雜質(zhì)； (b)使所述第一透過物通過至少一種分離操作以形成第二透過物和第二保留物，所述第二保留物包含大部分蛋白，并且所述第二透過物包含雜質(zhì)； (c)使所述第二保留物與載體流混合以通過至少一種分離操作從所述工藝流中的其它蛋白中分離KTI蛋白流，以形成部分純化的KTI產(chǎn)品；以及 (d)使所述部分純化的KTI產(chǎn)品通過至少一種層析分離操作以形成純化的具有至少95重量％的總KTI蛋白濃度的KTI產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了從工藝流中回收和分離具有至少95重量％的總KTI蛋白濃度的KTI產(chǎn)品的方法。
文檔編號C07K1/14GK102762584SQ201080064208
公開日2012年10月31日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者B.塔爾克, C.S.沙斯蒂恩, D.馬什, J.吳, K.克勒, M.梅克爾 申請人:索萊有限責任公司