專利名稱：一種利用耐鹽性混合模式吸附劑純化人尿胰蛋白酶抑制劑的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種純化人尿胰蛋白酶抑制劑的方法，尤其涉及一種利用耐鹽性混合模式吸附劑純化人尿胰蛋白酶抑制劑的方法。
背景技術：
人尿胰蛋白酶抑制劑(Humanurinary trypsin inhibitor,簡稱為 HUTI)，是一種從人尿中分離純化的藥用蛋白，對胰蛋白酶、纖溶酶、彈性蛋白酶等多種酶均具有抑制作用。1909年，Beurer等首次發(fā)現了在人尿中存在的一種對胰蛋白酶有抑制作用的蛋白，也由此命名為人尿胰蛋白酶抑制劑。直到1977年，科學家首次成功地從人尿中經分離純化得到完整的HUTI分子。HUTI是由143個氨基酸組成的一種糖蛋白，N端和C端分別為丙氨酸和亮氨酸。HUTI分子量為37000 43000 (SDS-PAGE電泳法)，等電點為2. 5左右。HUTI具有抑制胰蛋白酶等多種酶的生理功能，這與HUTI自身的分子結構有關。HUTI具有多個功能結構域，其中Kimitz型結構域是其主要的活性結構域。HUTI在臨床上的應用最初是用于治療急性胰腺炎，經過臨床研究證明，HUTI對治療胰腺炎具有良好的效果。HUTI的臨床應用遠不止于此，其多樣的生物功能決定了其多樣的臨床應用價值。經研究發(fā)現HUTI可參與細胞表達分泌調控；參與炎癥反應的調控，局限炎癥反應，幫助組織的修復；可改善休克時的循環(huán)狀況，減少器官功能衰竭；手術時有預防細胞功能障礙和改善細胞能力代謝的作用；具有保護羊膜、抑制宮縮、防治早產和降低圍產期死亡的作用；可降低腫瘤細胞的擴散能力和侵襲力，抑制腫瘤細胞的轉移等。由于HUTI在臨床上的應用價值，人們一直在不斷探索生產HUTI的新技術。當前， HUTI的制備工藝主要是使用陰離子交換層析法、陽離子交換層析法、疏水層析法、金屬螯合層析法、凝膠層析法、親和層析法或這幾種方法得組合純化HUTI，這些方法中有的工藝過于復雜，總收率非常低，有的則雖然工藝簡單，但是具有不穩(wěn)定或純度不高等不足。因此，本領域的技術人員仍在不斷地探索更好、更合理的純化方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供了一種利用耐鹽性混合模式吸附劑純化人尿胰蛋白酶抑制劑的方法，該方法適合在中高鹽條件下實現對HUTI的有效吸附，通過改變流動相pH來實現HUTI的洗脫，可以避免對料液的預處理，提高純化的效率。本發(fā)明是這樣來實現的，方法步驟為
a.將人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解在水中，使得過濾后電導不低于30mS/cm，用稀鹽酸將濾液PH調至2-5，接著用耐鹽性混合模式吸附劑裝柱對人尿胰蛋白酶抑制劑進行靜態(tài)吸附，再通過常規(guī)柱層析純化方法洗脫并收集人尿胰蛋白酶抑制劑的洗脫高峰；
b.利用pH為7-10的洗脫緩沖液對耐鹽性混合模式吸附劑進行洗脫，收集人尿胰蛋白酶抑制劑的洗脫高峰；c.將收集的人尿胰蛋白酶抑制劑洗脫高峰進行冷凍干燥，即得到高純度的人尿胰蛋白酶抑制劑。 所述耐鹽性混合模式吸附劑的結構為為耐鹽性混合模式吸附劑的載體包括甲基丙烯酸聚合物、瓊脂糖或纖維素。所述耐鹽性混合模式吸附劑的制備方法為
a.活化取甲基丙烯酸聚合物、瓊脂糖或纖維素作載體，將載體與溶解于丙酮中的羰基二咪唑在30°C條件下攪拌反應，洗滌后抽干，得到活化的載體介質；
b.接臂將活化的載體介質加入到氨基己酸溶液中30°C攪拌，進行縮合反應，得到氨基己酸-甲基丙烯酸聚合物復合物；
c.偶聯氨基己酸-載體介質復合物再與苯乙胺發(fā)生偶聯反應，控制氨基己酸與苯乙胺的縮合反應，使得反應后羧基含量不低于30%，得到耐鹽性混合模式吸附劑；
d.上述氨基己酸溶液1kg氨基己酸溶于1升pH9.3碳酸鹽緩沖液；以上各步反應所用的試劑用量比例見下表
權利要求
1.一種利用耐鹽性混合模式吸附劑純化人尿胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征是方法步驟為a.將人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解在水中，使得過濾后電導不低于30mS/cm，用稀鹽酸將濾液PH調至2-5，接著用耐鹽性混合模式吸附劑裝柱對人尿胰蛋白酶抑制劑進行靜態(tài)吸附，再通過常規(guī)柱層析純化方法洗脫并收集人尿胰蛋白酶抑制劑的洗脫高峰；b.利用pH為7-10的洗脫緩沖液對耐鹽性混合模式吸附劑進行洗脫，收集人尿胰蛋白酶抑制劑的洗脫高峰；c.將收集的人尿胰蛋白酶抑制劑洗脫高峰進行冷凍干燥，即得到高純度的人尿胰蛋白酶抑制劑。
2.根據權利要求1所述的利用耐鹽性混合模式吸附劑純化人尿胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征是所述耐鹽性混合模式吸附劑的結構為為
3.根據權利要求1所述的利用耐鹽性混合模式吸附劑純化人尿胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征是耐鹽性混合模式吸附劑的載體包括甲基丙烯酸聚合物、瓊脂糖或纖維素。
4.根據權利要求2所述的利用耐鹽性混合模式吸附劑純化人尿胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征是所述耐鹽性混合模式吸附劑的制備方法為a.活化取甲基丙烯酸聚合物、瓊脂糖或纖維素作載體，將載體與溶解于丙酮中的羰基二咪唑在30°C條件下攪拌反應，洗滌后抽干，得到活化的載體介質；b.接臂將活化的載體介質加入到氨基己酸溶液中30°C攪拌，進行縮合反應，得到氨基己酸-甲基丙烯酸聚合物復合物；c.偶聯氨基己酸-載體介質復合物再與苯乙胺發(fā)生偶聯反應，控制氨基己酸與苯乙胺的縮合反應，使得反應后羧基含量不低于30%，得到耐鹽性混合模式吸附劑；d.上述氨基己酸溶液1kg氨基己酸溶于1升pH9.3碳酸鹽緩沖液；以上各步反應所用的試劑用量比例見下表
5.根據權利要求1所述的利用耐鹽性混合模式吸附劑純化人尿胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征是洗脫緩沖液為磷酸二氫鈉溶液、磷酸氫二鈉溶液、氫氧化鈉溶液、碳酸鈉溶液、 碳酸氫鈉溶液、氨水、銨鹽溶液、氯化鈉溶液的一種或若干種的混合物。
全文摘要
一種利用耐鹽性混合模式吸附劑純化人尿胰蛋白酶抑制劑的方法，方法步驟為a.將人尿胰蛋白酶抑制劑粗品溶解在水中，使得過濾后電導不低于30ms/cm，將濾液pH調至2-5，接著用耐鹽性混合模式吸附劑選擇性吸附人尿胰蛋白酶抑制劑；b.利用pH為7-10的洗脫緩沖液對耐鹽性混合模式吸附劑進行洗脫，收集人尿胰蛋白酶抑制劑的洗脫高峰；c.將收集的人尿胰蛋白酶抑制劑洗脫高峰進行冷凍干燥，即得到高純度的人尿胰蛋白酶抑制劑。本發(fā)明的技術效果是本發(fā)明的純化方法具有純化效率高，工藝步驟少，容易放大等特點，便于實現該技術的產業(yè)化應用。
文檔編號C07K1/22GK102167739SQ20111003770
公開日2011年8月31日 申請日期2011年2月15日 優(yōu)先權日2011年2月15日
發(fā)明者萬偲, 朱碧君, 楊華英, 饒志偉, 高鐵旦 申請人:南昌市浩然生物醫(yī)藥有限公司