專利名稱：大豆胰蛋白酶抑制劑濃縮物的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及簡單且廉價地制造大豆中含有的、具有生理活性的胰蛋白酶抑制劑等有用的濃縮物的方法。
背景技術(shù)：
胰蛋白酶抑制劑是大豆中含有的生理活性物質(zhì)之一，已公知其有Kunitz型和BBI型，Kunitz型的分子量大約為20000，等電點為4.5，BBI型的分子量大約為8000，等電點為4.2，據(jù)報道有發(fā)揮生理作用的癌性胸-腹水潴留抑制劑(特公平6-23113號公報)、炎癥性浮腫亢進抑制劑(特開平7-10772號公報)、含有含酶抑制劑的皮膚保養(yǎng)組合物的一次性吸收性產(chǎn)品(特表2002-505916號公報)等。
作為大豆胰蛋白酶抑制劑的分離方法，通過組合實驗室水平的等電點沉淀、鹽析、離子交換色譜法、凝膠過濾等，提出了各種精制方法。作為工業(yè)方法，有特開平6-145198號公報，其組合了超濾膜和離子交換色譜法，還有特開平10-066572號公報等，其組合了胰蛋白酶抑制劑提取法和離子交換色譜法等。
與胰蛋白酶抑制劑相同，β-淀粉酶也是大豆的有效成分，其分離方法有特公昭57-11636號公報和特開平7-107974號公報，其中利用了超濾膜，還有特公昭57-52386號公報等，其中利用合成硅酸鋁作為吸附劑。
這些大豆胰蛋白酶抑制劑、大豆β-淀粉酶是有用的物質(zhì)，如果能確立實現(xiàn)工業(yè)化的簡單的分離技術(shù)，則對社會的貢獻很大。
另一方面，雖然舉出了現(xiàn)有技術(shù)中大豆胰蛋白酶抑制劑的分離法、大豆β-淀粉酶的分離法的例子，但這些是現(xiàn)實中不能進行工業(yè)化的特殊方法，或者缺乏有效利用多種成分的概念。

發(fā)明內(nèi)容
大豆乳清中以胰蛋白酶抑制劑和β-淀粉酶為主，含有各種有效成分。另外，鹽析是有效分離蛋白性有效成分的方法之一。但是，以濃度小的乳清作為原料進行鹽析時，例如濃度為3重量％的乳清，需要向其中加入14重量％的鹽，這是不現(xiàn)實的方法。
本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，將大豆分離蛋白的制造過程等所產(chǎn)生的副產(chǎn)物即大豆乳清濃縮后，將pH調(diào)節(jié)至特定的范圍內(nèi)，并且適當?shù)丶尤臌}，由此可以有效地以沉淀的形式回收大豆乳清中存在的胰蛋白酶抑制劑。
即，本發(fā)明人等已經(jīng)在先完成了如下發(fā)明將大豆乳清濃縮到特定濃度后，即使不添加鹽也能以沉淀組分的形式得到胰蛋白酶抑制劑(特愿2002-223228號、特愿2003-094128號、特愿2003-284120號)，但在工業(yè)生產(chǎn)上，本發(fā)明能進一步降低生產(chǎn)成本。
本發(fā)明者等專心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過添加特定比例的鹽并降低濃縮的程度，可降低生產(chǎn)成本，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，將大豆分離蛋白的制造過程等所產(chǎn)生的副產(chǎn)物即大豆乳清濃縮到特定濃度后，加鹽，并且將pH調(diào)節(jié)至特定范圍，由此可以以沉淀組分的形式回收大豆乳清中存在的胰蛋白酶抑制劑。
即，本發(fā)明涉及大豆胰蛋白酶抑制劑濃縮物的制造方法，其中，將大豆乳清濃縮成固體成分濃度為10重量％～30重量％，對濃縮大豆乳清進行加鹽，加鹽量大于等于所述濃縮大豆乳清的3重量％，回收在酸性條件下析出的凝集沉淀物。相對于濃縮液，所述加鹽量優(yōu)選大于等于按(39％—固體成分濃度％)/3式計算出的數(shù)值。另外，所用的鹽含有選自由硝酸根離子、硫酸根離子以及氯離子組成的組中的一種或者一種以上的陰離子；和選自由鈉、鉀以及銨組成的組中的一種或一種以上的陽離子。進一步向凝集沉淀物加水，在pH2.0～4.8的范圍進行部分再溶解，并將其固液分離，可以得到大豆胰蛋白酶抑制劑濃縮物，其中，固液分離得到的液體組分是BBI型胰蛋白酶抑制劑濃縮物，固體組分是Kunitz型胰蛋白酶抑制劑濃縮物。
將大豆乳清濃縮到一定濃度之后向濃縮液加鹽與僅通過自身濃縮進行鹽析的方法相比，可以控制濃縮成本，并高效率地得到大豆胰蛋白酶抑制劑濃縮物，并可高效率地得到副產(chǎn)物大豆β-淀粉酶濃縮物。
具體實施例方式
本發(fā)明所用的大豆乳清可以使用含有大豆胰蛋白酶抑制劑的大豆乳清。即，優(yōu)選在大豆乳清的生產(chǎn)過程中沒有經(jīng)歷使大豆胰蛋白酶抑制劑失活程度的受熱過程，大豆乳清的生產(chǎn)過程在小于等于100℃，優(yōu)選小于等于80℃的溫度進行。
大豆乳清是用大豆制造大豆分離蛋白或大豆?jié)饪s蛋白的過程等中的副產(chǎn)物。受熱過程少的大豆乳清能夠以溶液的形式得到，例如用水在中性附近提取低變性脫脂大豆后，除去豆渣成分得到脫脂豆乳，將其中的大豆蛋白在等電點附近(例如pH4.5附近)凝集沉淀，除去大豆蛋白而得到溶液。
工業(yè)上制造大豆分離蛋白的過程中的副產(chǎn)物大豆乳清可作為大量質(zhì)量穩(wěn)定的原料利用，所以方便，通常這些乳清中典型的是固體成分大約為3％左右，其固體成分組成(以下稱“干重％”)為粗蛋白質(zhì)20％、灰份20％、含糖物質(zhì)60％左右，即使改變從脫脂大豆的水提倍率，大豆乳清的固體成分組成也呈幾乎不變的趨勢。所以，如果固體成分是3％左右，從活性上看，含有5單位/毫升左右的大豆胰蛋白酶抑制劑，其可以適用于本發(fā)明。
在本說明書中，大豆胰蛋白酶抑制劑活性的測定法采用基于A.O.A.C.的公定法的BAPA(N-α-苯甲酰基-DL-精氨酸-對硝基酰苯胺鹽酸鹽)法進行定量。
在本發(fā)明中，大豆乳清的濃縮與添加的鹽的量存在負相關(guān)。首先，將乳清濃縮至固體成分為10重量％～30重量％、優(yōu)選15重量％～25重量％的范圍是合適的。固體成分濃度小于10重量％時，不加入大量鹽就不發(fā)生鹽析，而濃縮到大于30重量％時，難以降低蒸餾濃縮的成本。
濃縮方式可采用公知的方式，但減壓下濃縮能防止溫度上升，可高效率地進行濃縮。
此時，pH優(yōu)選酸性條件，更優(yōu)選pH3.5～8.5，進一步優(yōu)選pH4.5～7.0。對此時溶液的溫度(品溫)也沒有特別限制，在能取得高活性的各種乳清有效成分的范圍，優(yōu)選溶液溫度低，如20℃～80℃，更優(yōu)選在20℃～65℃進行，接著對濃縮液進行加鹽，添加量大于等于3重量％，更優(yōu)選3重量％～10重量％。加鹽時所使用的鹽含有選自由硝酸根離子、硫酸根離子以及氯離子組成的組中的一種或者一種以上的陰離子；和選自由鈉、鉀以及銨組成的組中的一種或一種以上的陽離子。如果考慮價格和獲得方法，優(yōu)選鈉鹽，特別是氯化鈉。
這些鹽的最適添加量因鹽的種類不同而不同，但應為3重量％～10重量％，并且，相對于100份濃縮液，加入大于等于按(31％-固體成分濃度％)/3式算出的數(shù)字的量的鹽，優(yōu)選加入大于等于按(39％-固體成分濃度％)/3式算出的數(shù)字的量的鹽。也就是說，例如，對于固體成分濃度為19重量％的濃縮液，必須添加大于等于4重量％、優(yōu)選大于等于6.7重量％的鹽。但是，加入的鹽的濃度小于3重量％時效果小，如果大于10重量％則溶液的比重變大，則對析出的沉淀進行分離變得困難。
對于如上述那樣濃縮的大豆乳清，酸性條件下，優(yōu)選調(diào)整到pH1.7～5.2的范圍，更優(yōu)選調(diào)整到2.7～4.8的范圍，分離析出的凝集沉淀物和上清液。大豆胰蛋白酶抑制劑被濃縮在該凝集沉淀物中。另一方面，β-淀粉酶被濃縮在上清液組分中。希望在不使β-淀粉酶失活的情況下進行分離時，進行在酸性條件下、小于等于20℃的溫度進行等的處理即可。
此外，胰蛋白酶抑制劑的Kunitz型的等電點是pH4.5，BBI型的等電點是pH4.2，β-淀粉酶的等電點是pH5.5，但是，即使直接將大豆乳清的pH調(diào)整至各個等電點，企圖等電點沉淀，也不會產(chǎn)生目標物質(zhì)的凝集沉淀，或者產(chǎn)生的量極少。
這樣得到的凝集沉淀物是大豆胰蛋白酶抑制劑濃縮物，加水并在pH2.0～4.8、優(yōu)選在pH3.0～pH4.4范圍進行部分溶解，進而可以固液分離。通過該固液分離得到的液體組分可作為“BBI型胰蛋白酶抑制劑濃縮物”，固體組分可作為“Kunitz型胰蛋白酶抑制劑濃縮物”。這是因為，通過加水使鹽濃度比濃縮乳清的鹽濃度低，BBI型胰蛋白酶抑制劑再次溶解，而Kunitz型胰蛋白酶抑制劑沒有溶解，所以可將兩者分離成上清和沉淀。
加水的程度大于等于凝集沉淀物(含水物)的1.5倍，優(yōu)選2～10倍，最優(yōu)選2.5～4倍。
作為固液分離的方式，可以利用公知的固液分離裝置，例如利用離心分離裝置、膜分離裝置等。
通過上述工序，可以從大豆乳清中高效率地濃縮大豆胰蛋白酶抑制劑，進而濃縮BBI型胰蛋白酶抑制劑和Kunitz型胰蛋白酶抑制劑。
實施例下面舉出實施例說明本發(fā)明的具體實施方式
。
制造例1向低變性脫脂大豆中加入10倍量的溫水，維持pH＝7.0，同時攪拌1小時，以進行萃取。用潷析器除去作為不溶成分的豆渣，得到脫脂豆乳液。向脫脂豆乳液加入濃鹽酸，使pH＝4.5，分離析出的大豆蛋白質(zhì)的沉淀，得到大豆乳清。
實施例1用薄膜式閃蒸器(東京理科器械制)將上述制造例1得到的大豆乳清(固體成分為3重量％、pH＝4.5)在真空度為40Torr、加熱溫度為60℃、蒸發(fā)溫度為35℃的條件下減壓濃縮，在固體成分濃度為7％、12％、16％、27％時抽出。向得到的各濃度的濃縮乳清中加入硫酸鈉，添加量為濃縮乳清的0.5％、3％、6％、9％、14％，進一步用磷酸調(diào)整為pH＝4，冷藏放置一晚。
將各樣品以3000rpm離心分離5分鐘，對上清液進行SDS電泳，對相當于Kunitz型胰蛋白酶抑制劑(以下稱KSTI)的20kDa譜帶的濃度進行定量，與原材料的乳清進行比較。
實施例2(乳清濃度為28％的例子)與實施例1同樣，用薄膜式閃蒸器減壓濃縮大豆乳清，使固體成分濃度為28％。向濃縮乳清加入硫酸鈉，添加量為濃縮乳清的3％或者6％，進一步用磷酸調(diào)整為pH＝4，冷藏放置一晚。
將各樣品以3000rpm離心分離5分鐘，對上清液進行SDS電泳，對相當于KSTI的20kDa譜帶的濃度進行定量，與原材料的乳清進行比較。
實施例3(乳清濃度為13％的例子)與實施例1同樣，用薄膜式閃蒸器減壓濃縮大豆乳清，使固體成分濃度為13％。向濃縮乳清加入硫酸鈉或氯化鈉，添加量為濃縮乳清的0.5％、3％、6％、9％、14％，進一步用磷酸調(diào)整為pH＝4，冷藏放置一晚。
將各樣品以3000rpm離心分離5分鐘，對上清液進行SDS電泳，對相當于KSTI的20kDa譜帶的濃度進行定量，與原乳清進行比較。
比較例1與實施例1同樣，用薄膜式閃蒸器減壓濃縮大豆乳清，使固體成分濃度為32％、35％、38％、41％、44％、47％、51％時抽出，對得到的各濃度的濃縮乳清用磷酸調(diào)整為pH＝4，冷藏放置一晚。
將各樣品以3000rpm離心分離5分鐘，對上清液進行SDS電泳，對相當于KSTI的20kDa譜帶的濃度進行定量，與原乳清進行比較。
表1各固體成分濃度、鹽濃度下的上清液中KSTI分子殘存量

評價方法TI分子殘存量小于55％(分離良好○)TI分子殘存量小于70％(多少有些分離△)TI分子殘存量大于等于70％(分離差×)
對實施例1～3的各固體成分濃度的濃縮乳清加鹽后的KSTI分子的殘存量進行比較。添加的鹽是硫酸鈉的情況下，濃縮液濃度為3％和7％時，加鹽量為14％，濃縮液濃度為12％、13％以及16％時，加鹽量大于等于9％，濃縮液濃度為27％和28％時，加鹽量大于等于6％，通過這樣進行加鹽，KSTI分子有效地形成沉淀。
另外，添加的鹽是氯化鈉的情況下，濃縮液濃度為13％時，通過加入14％的鹽，KSTI分子有效地形成沉淀。
本發(fā)明中，比較例1所示那樣的固體成分濃度大于30重量％時，濃縮所需能量多。另外，固體成分濃度小于10重量％，加鹽量變大，產(chǎn)生與鹽相關(guān)的費用，并且濃縮液的比重變大，分離性變差。本發(fā)明方法按10重量％～30重量％的限定濃度進行加鹽，即使?jié)舛炔桓咭矔a(chǎn)生KSTI的沉淀，所以濃縮所需的能量得到節(jié)省，可以更廉價且有效地對大豆乳清進行成分分離。
實施例4將大豆分離蛋白制造過程獲得的70kg大豆乳清(固體成分為2.9重量％、pH＝4.6、總胰蛋白酶抑制劑活性為357000單位、粗蛋白質(zhì)含有量為20.1干重％、灰份為19.7干重％、糖類為60.2干重％)，用大川原制作所生產(chǎn)的蒸發(fā)器(CEP-L型)，在大豆乳清的蒸發(fā)溫度為50℃(加熱溫度為80℃)的條件下減壓濃縮，得到8kg濃縮乳清，其固體成分為20.0重量％，總胰蛋白酶抑制劑活性為333000單位。
將560g氯化鈉加入濃縮乳清，冷卻到15℃，用磷酸調(diào)整為pH＝4.0，靜置3小時之后進行離心分離(1500G×10分鐘)，分為上清液和沉淀。
分離的上清液為8100g，固體成分為26.0重量％，總胰蛋白酶抑制劑活性為40000單位，分離的沉淀為324g，固體成分為55.0重量％、總胰蛋白酶抑制劑活性為305000單位。
所以，兩酶活性的分配率如下胰蛋白酶抑制劑占上清液的11.6％，占沉淀的88.4％β-淀粉酶占上清液的92.1％，占沉淀的7.9％。
向100g作為沉淀的胰蛋白酶抑制劑組分加入200g水，維持可使其沉淀的pH＝4.0，同時用均質(zhì)機(4000rpm×15分鐘)攪拌，使其溶解后，進行離心分離(5000G×10分鐘)，分成上清液和沉淀。
得到上清液277g，其固體成分為14.2％，總胰蛋白酶抑制劑效價為60000單位，得到沉淀23g，其固體成分為55.8％，總胰蛋白酶抑制劑效價為22100單位。
對上清液和沉淀蛋白進行SDS電泳分析，結(jié)果確認到上清液中是BBI型胰蛋白酶抑制劑，沉淀中是Kunitz型胰蛋白酶抑制劑。
實施例5與實施例1同樣，用薄膜式閃蒸器減壓濃縮大豆乳清(pH4.5)，使固體成分濃度為13％。用磷酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)濃縮大豆乳清的pH，使pH為2、3、4、5、6，其中希望pH小于濃縮乳清pH時使用磷酸，希望pH大于濃縮乳清pH時使用氫氧化鈉，然后加入9％的硫酸鈉，冷藏放置一晚。
將各樣品以3000rpm分別離心分離5分鐘，對上清液進行SDS電泳，對相當于KSTI的20kDa譜帶的濃度進行定量，與原乳清進行比較。
表2各pH下的上清液中KSTI分子殘存量pH 2 3 4 5 6實施例565△30○26○60△75×評價方法TI分子殘存量小于55％(分離良好○)TI分子殘存量小于70％(多少有些分離△)TI分子殘存量大于等于70％(分離差×)可以判定pH在2～5的范圍內(nèi)，KSTI分子可以有效地發(fā)生沉淀。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性利用本發(fā)明的制造方法，可以從大豆乳清中有效分離大豆胰蛋白酶抑制劑，并且可以以系列工序分離BBI型胰蛋白酶抑制劑和Kunitz型胰蛋白酶抑制劑、大豆β-淀粉酶、以及大豆低聚糖類，可以綜合地利用大豆乳清。
權(quán)利要求
1.大豆胰蛋白酶抑制劑濃縮物的制造方法，其中，將大豆乳清濃縮成固體成分濃度為10重量％～30重量％，對濃縮大豆乳清進行加鹽，加鹽量為所述濃縮大豆乳清的3重量％～10重量％，回收在pH1.7～5.2范圍的酸性條件下析出的凝集沉淀物。
2.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其中，向凝集沉淀物加水，在pH2.0～4.8的范圍進行部分再溶解，并將其固液分離，固液分離得到的液體組分是BBI型胰蛋白酶抑制劑濃縮物，固體組分是Kunitz型胰蛋白酶抑制劑濃縮物。
3.大豆β-淀粉酶濃縮物的制造方法，其中，將大豆乳清濃縮成固體成分濃度為10重量％～30重量％，對濃縮大豆乳清進行加鹽，加鹽量為所述濃縮大豆乳清的3重量％～10重量％，在pH1.7～5.2范圍的酸性條件下回收上清液。
4.如權(quán)利要求1～3任一項所述的制造方法，其中，相對于濃縮液，所述加鹽量大于等于按(31％-固體成分濃度％)/3式計算出的數(shù)值，并且為所述濃縮大豆乳清的3重量％～10重量％。
5.如權(quán)利要求1～3任一項所述的制造方法，其中，所用的鹽含有選自由硝酸根離子、硫酸根離子以及氯離子組成的組中的一種或者一種以上的陰離子；和選自由鈉、鉀以及銨組成的組中的一種或一種以上的陽離子。
全文摘要
本發(fā)明提出一種大豆胰蛋白酶抑制劑濃縮物和大豆β－淀粉酶濃縮物的制造方法，其中，將大豆乳清濃縮成固體成分濃度為10重量％～30重量％，對濃縮的大豆乳清進行加鹽，添加量大于等于濃縮大豆乳清的3重量％，回收在酸性條件下析出的凝集沉淀物。
文檔編號A61K36/185GK1647701SQ20051000515
公開日2005年8月3日 申請日期2005年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月30日
發(fā)明者吉田隆治, 福田洋一 申請人:不二制油株式會社