專利名稱：：用于免疫學(xué)方法檢測急性心肌梗塞的試劑及測試條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)診斷試劑，尤其涉及快速診斷急性心肌梗塞的診斷試劑及測試條。
背景技術(shù)：
：急性心肌梗塞AMI是內(nèi)科常見的急危重癥，已成為嚴(yán)重影響人類健康的疾病，其發(fā)病后16小時是溶栓治療和介入手術(shù)治療的黃金時間，而快速診斷發(fā)病6小時內(nèi)的早期AMI是決定治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。按照世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦典型的胸痛、心電圖改變和心肌酶異常三項指標(biāo)中有兩項符合，即可診斷AMI。然而，在我國約25%的AMI病人無癥狀，約30%的病例無典型心絞痛表現(xiàn)；采用心電圖診斷AMI的準(zhǔn)確性平均約60%，診斷非Q波心肌梗死缺乏特異性，對不穩(wěn)定心絞痛和小范圍AMI難以鑒別，而具有確診意義的病理性Q波常在發(fā)病68小時以后才出現(xiàn)，因而AMI早期心電圖確診率很低。心肌損傷生化標(biāo)志物的檢測在急性心肌梗塞的診斷、監(jiān)測、危險評估、預(yù)后和引導(dǎo)治療等方面都起到了重要作用，目前常用的心肌損傷生化標(biāo)志物有肌酸激酶同功酶(CK-MB)、肌鈣蛋白I(TroponinI)或肌鈣蛋白T(cTnl或cTnT)、肌紅蛋白(Myoglobin)等。例如，美國心臟病學(xué)會規(guī)定聯(lián)合使用肌紅蛋白(Myoglobin)，CK-MB和肌鈣蛋白I(TroponinI)三個標(biāo)志物作為心肌梗塞檢測的常規(guī)手段。但是，目前的心肌損傷生化標(biāo)志物的在急性心肌梗塞早期診斷，尤其是發(fā)病6小時以內(nèi)的早期診斷的敏感性和特異性方面仍有不足。肌酸激酶同功酶(CK-MB)=CK-MB在肌酸激酶的三個同工酶中，CK-MB對于診斷AMI具有高度敏感性，從19世紀(jì)80年代至1995年一直被認(rèn)為是診斷AMI的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而，CK-MB存在于心肌和骨骼肌細(xì)胞中，影響診斷特異性。CK-MB在胸痛作之后56小時會升高2倍，1224小時達(dá)到峰值。因此，不能作為早期標(biāo)志物。肌鈣蛋白肌鈣蛋白(Cardiactroponins,cTn)是橫紋肌收縮的主要蛋白，有三個亞單位Tnc，TnI和TnT。cTn不能透過細(xì)胞膜進(jìn)入血循環(huán)，故健康人血內(nèi)不含或含極低量的cTnT和cTnl。當(dāng)心肌缺血或缺氧發(fā)生變性壞死，細(xì)胞膜破損，cTnl和cTnT進(jìn)入細(xì)胞間質(zhì)。1989年首次報道檢測cTnT，后來在1992年對cTnT的檢測進(jìn)一步描述。由于cTnT、cTnl對心肌細(xì)胞損傷有高度的敏感性和特異性，被人們認(rèn)為是診斷AMI的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但肌鈣蛋白在AMI后的早期釋放動力學(xué)與CK-MB相似，需要幾個小時釋放至血液中，才能進(jìn)行檢測，因此這兩種肌鈣蛋白不能作為早期標(biāo)志物。肌紅蛋白(Myo)肌紅蛋白是19世紀(jì)70年代以來用于診斷AMI的第一個非酶蛋白。它的分子量小，發(fā)病后1小時能快速釋放到血液中，具有高敏感性和陰性預(yù)測值，對于早期篩選AMI非常有價值。然而，肌紅蛋白不僅大量存在于心肌細(xì)胞，還存在于骨骼肌細(xì)胞等多種組織中，故炎癥、局部缺血、SLE、休克、皮肌炎等亦可引起MYO升高，其作為AMI的診斷指標(biāo)特異性較低。人們一直致力于研究新的用于AMI早期診斷的生化標(biāo)志物，近年來，有研究者對心型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)作為急性心肌梗塞的標(biāo)志物進(jìn)行了研究。H-FABP是一種低分子量的胞漿蛋白，分子量約15000Dt，是重要的細(xì)胞內(nèi)脂肪酸載體蛋白。VanNieuwenFA等在Circulation，1995，922848報告了FABP存在于心臟及某些骨骼肌中，但是在心肌中它的含量比骨骼肌中要高幾倍，心肌缺氧時，在AMI早期就可查到FABP在血中升高。TanakaT等在ClinBiochem,1991,24:195_201報道了10例AMI患者發(fā)病1.54小時內(nèi)的早期標(biāo)本中FABP都升高而CK-MB仍在正常范圍。TsujiR等在IntJCardiol,1993,41209-217報道了在發(fā)病早期階段(O3小時)FABP和CK-MB的臨床靈敏度分別為91.4%和20%，F(xiàn)ABP顯著高于CK-MB。Glatz等在ClinChimActa,1998，27287報告了83例AMI患者不同標(biāo)志物的診斷靈敏度分別為FABP78%,myoglobin53%,CK-MB57%；而且myoglobin和CK-MB活性增加的患者，99%也表現(xiàn)有FABP濃度增加。Suzuki等在NipponKyobuGekaGakkaiZasshi,1996,44:760_764報告了FABP在心肌再灌注后60分鐘內(nèi)立即出現(xiàn)高峰，遠(yuǎn)在CK-MB和cTnT之前。此外，Glatz等在ClinChimActa,1998，27287報告健康人血漿FABP水平為(2.1士1.l)ug/L，上限(鑒別值)為5ug/L，F(xiàn)ABP還可以用作判斷圍手術(shù)期心肌損傷的指標(biāo)。上述研究提示H-FABP作為AMI早期診斷的生化標(biāo)志物具有一定的優(yōu)越性，但是，如何與其他指標(biāo)配合使用未見報道。另外，在AMI檢測方法上，目前國內(nèi)常用的方法為酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法，該方法需要特定的儀器，成本高、操作較復(fù)雜、檢測時間長，不適宜于AMI患者自檢或初次就診的基層醫(yī)院和急診室進(jìn)行快速篩選診斷。因此，本領(lǐng)域迫切需要更靈敏、更具特異性的AMI早期診斷標(biāo)志物或標(biāo)志組合，以及用于快速診斷AMI的產(chǎn)品。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于將可用于急性心肌梗塞早期檢測的生化標(biāo)志物心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)和肌鈣蛋白I(CTnI)與成熟的膠體金免疫層析快速診斷技術(shù)結(jié)合起來，設(shè)計出一種快速診斷急性心肌梗塞檢測試紙，用于AMI的早期篩選診斷，以解決各級醫(yī)院，尤其是基層醫(yī)院的急診室缺乏快速、簡便篩查早期AMI有效手段的難題。本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于檢測急性心肌梗塞的免疫檢測試劑，包括針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的單克隆抗體；和針對人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的單克隆抗體。在一個優(yōu)選的方案中，針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的單克隆抗體選自7C8和2G4中的一種，其中7C8由保藏號為CGMCCNo.3428的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生，2G4由保藏號為CGMCCNo.3427的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生；針對人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的單克隆抗體選自3D2和2E5中的一種，其中3D2由保藏號為CGMCCNo.3425的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生，2E5由保藏號為CGMCCNo.3426的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。保藏單位為中國微生菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏日期為2009年11月9日。在一個優(yōu)選的方案中，上述用于檢測急性心肌梗塞的免疫檢測試劑，針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的單克隆抗體包括抗原表位不同的第一抗體和第二抗體；針對人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的單克隆抗體包括抗原表位不同的第一抗體和第二抗體。所述的針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的第一抗體選自7C8和2G4中的一種，第二抗體為另一種；所述的針對人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的第一抗體選自3D2和2E5中的一種，第二抗體為另一種。在更優(yōu)選的方案中，針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的第一抗體為非標(biāo)記抗體，第二抗體為標(biāo)記抗體；針對人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的第一抗體為非標(biāo)記抗體，第二抗體為標(biāo)記抗體。所述的標(biāo)記抗體的標(biāo)記方法為本領(lǐng)域常用的方法，如辣根過氧化物酶標(biāo)記、堿性磷酸酶標(biāo)記、膠體金標(biāo)記。本發(fā)明優(yōu)選膠體金標(biāo)記。本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于快速檢測早期急性心肌梗塞的免疫層析測試條，包括樣品墊、緊密連接于所述樣品墊的含有膠體金標(biāo)記抗體的金標(biāo)墊、與所述金標(biāo)墊緊密連接的纖維素膜和緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊；所述纖維素膜上遠(yuǎn)離金標(biāo)墊的一端設(shè)置質(zhì)控線，在質(zhì)控線和金標(biāo)墊之間的纖維素膜上設(shè)置兩條相互分離的檢測線.一入，其中所述的兩條檢測線由分別針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)、人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的特異性抗體組成；所述的膠體金標(biāo)記抗體由抗原表位不同的分別針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)、人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的特異性抗體組成；所述的質(zhì)控線由特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記抗體的二抗、鏈球菌G蛋白(SPG)或金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)組成。在一個優(yōu)選的方案中，針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的特異性抗體為抗原表位不同的單克隆抗體7C8和2G4，其中7C8由保藏號為CGMCCNo.3428的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生，2G4由保藏號為CGMCCNo.3427的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生；針對人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的特異性抗體為抗原表位不同的單克隆抗體3D2和2E5，其中3D2由保藏號為CGMCCNo.3425的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生，2E5由保藏號為CGMCCNo.3426的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。在更優(yōu)選的方案中，所述的兩條檢測線，一條檢測線由抗人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的單克隆抗體7C8組成，另一條檢測線由抗人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)單克隆抗體3D2組成；所述的膠體金標(biāo)記抗體由抗原表位不同的抗心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的單克隆抗體2G4和抗人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)單克隆抗體2E5組成；所述的質(zhì)控線由特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記抗體的二抗、鏈球菌G蛋白或或金黃色葡萄球菌A蛋白組成。在更優(yōu)選的方案中，所述檢測線的特異性抗體終濃度為14mg/ml，按每ul噴涂成1cm長度噴涂到纖維素膜上形成檢測線；所述金標(biāo)墊是用膠體金標(biāo)記抗體溶液充分浸泡玻璃纖維膜，再晾干形成金標(biāo)墊；所述質(zhì)控線的特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記抗體的二抗、鏈球菌G蛋白或金黃色葡萄球菌A蛋白終濃度分別為14mg/ml、0.25lmg/ml、0.25lmg/ml，按每ul噴涂成1cm長度噴涂到纖維素膜上形成質(zhì)控線。在最優(yōu)選的方案中，所述檢測線終濃度為2mg/ml；所述質(zhì)控線的特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記抗體的二抗、鏈球菌G蛋白或金黃色葡萄球菌A蛋白終濃度分別為2mg/ml、0.5mg/ml、0.5mg/ml。本發(fā)明所述的用于快速檢測早期急性心肌梗塞的免疫層析測試條，其中支持檢測線和質(zhì)控線的纖維素膜可為硝酸纖維素膜(NC膜)或醋酸纖維素膜或混合膜；支持膠體金標(biāo)記抗體的金標(biāo)墊為玻璃纖維膜或聚脂膜；所述樣品墊可以是全血濾膜，所述的全血濾膜是棉籽絨和纖維素的混合物或者玻璃纖維和纖維素的混合物，也可以在全血濾膜上設(shè)一覆蓋膜，所述的覆蓋膜為璃纖維或吸水紙；該樣品墊適合于全血、血漿和血清樣品；所述吸水墊由吸水材料制備，如吸水紙。在一個優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的免疫層析測試條切成5mm寬度，其中纖維素膜長25mm,金標(biāo)墊長5mm，全血濾膜長度18mm，覆蓋在全血濾膜上的覆蓋膜長度20mm，吸水墊長度20mm。在一個優(yōu)選的方案中，本發(fā)明所述的用于快速檢測早期急性心肌梗塞的免疫層析測試條還包括一個起支持作用的底板和保護(hù)作用的外殼；所述的外殼在相對于檢測線、質(zhì)控線的位置設(shè)有觀察窗，相對于樣品墊的位置設(shè)置有加樣孔；所述的底板、外殼材質(zhì)為塑料。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于本發(fā)明的快速檢測急性心肌梗塞免疫層析測試條，選用H-FABP和cTnI兩個心肌損傷生化標(biāo)志物作為檢測指標(biāo)，合理利用H-FABP在急性心肌梗塞患者外周血中出現(xiàn)早、窗口期短；cTnl出現(xiàn)較H-FABP遲、但窗口期長的特點，做到即可對急性心肌梗塞患者早期診斷，又可防止對長期、癥狀輕微慢性心梗病人的漏診，在提高急性心肌梗塞早期檢測的靈敏度與特異性的基礎(chǔ)上，比較好的解決了檢測時間存在差異帶來的影響，為特異、靈敏的在不同時段對急性心肌梗塞作出診斷提供了有效手段。本發(fā)明的快速檢測急性心肌梗塞免疫層析測試條，可將心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白、心肌肌鈣蛋白I用一份樣品同時檢測，不需任何儀器設(shè)備，用肉眼即可觀察結(jié)果，檢測全過程僅需數(shù)分鐘，靈敏度與ELISA法相仿。本發(fā)明的快速檢測急性心肌梗塞免疫層析測試條具有單一試劑、一步操作、全部試劑可在室溫長期保存的特點?？傮w而言，本發(fā)明的快速檢測急性心肌梗塞免疫層析測試條診斷急性心肌梗塞提供了快速、方便、價廉、實用的檢測工具，可望在將來廣泛應(yīng)用于臨床，尤其是基層醫(yī)院、急診室等，也可用于病人的自我監(jiān)測，提高早期AMI診斷準(zhǔn)確率，進(jìn)而提高AMI的搶救成功率。圖1為快速診斷急性心肌梗塞免疫層析試條的正面示意圖。圖2為快速診斷急性心肌梗塞免疫層析試條的縱截面示意圖。圖3為快速診斷急性心肌梗塞的試劑盒示意圖。其中1為樣品墊(全血濾膜)；2為金標(biāo)墊；3為纖維素膜；4為吸水墊；5、6為檢測線；7為質(zhì)控線；8為背板；9為外殼；10為觀察窗；11為加樣孔。具體實施例方式H-FABP和cTnI抗原本發(fā)明采用從GENBANK查閱的H-FABP和cTnI的DNA序列，并依據(jù)其DNA序列分別設(shè)計上下游引物，利用分子克隆的方法制備H-FABP和cTnI重組抗原。7作為檢測靶標(biāo)的H-FABP和cTnI抗原急性心肌梗塞病人心肌缺氧壞死會釋放H-FABP和cTnI進(jìn)入血液中，使得病人血液中H-FABP和cTnI水平高于正常人。病人血液樣品中包含的內(nèi)源性H-FABP和cTnI作為待檢抗原，可以與本發(fā)明診斷試劑中的特異性抗體反應(yīng)。出現(xiàn)閾值之上的檢測結(jié)果可以作為判斷病人患有AMI的初步依據(jù)。抗H-FABP和cTnI的單克隆抗體單克隆抗體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法制備，例如，可利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明在采用H-FABP抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞按常規(guī)方法制備雜交瘤時，篩選到兩株分泌特異性抗H-FABP的單克隆細(xì)胞株(1)7C8(保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.3428，保藏日期為2009年11月09日)，該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體經(jīng)鑒定為IgG2a型；(2)2G4(保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.3427，保藏日期為2009年11月09日)，該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體經(jīng)鑒定為IgGl型。本發(fā)明在采用cTnI抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞S/P20細(xì)胞按常規(guī)方法制備雜交瘤時，篩選到兩株分泌特異性抗cTnl的單克隆細(xì)胞株(1)3D2(保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.3425，保藏日期為2009年11月09日)，該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體經(jīng)鑒定為IgGl型；(2)2E5(保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.3426，保藏日期為2009年11月09日)，該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體經(jīng)鑒定為IgG2a型。固定相抗體、流動相標(biāo)記抗體的設(shè)置可以將一株針對H-FABP抗原的特異性單克隆抗體標(biāo)記于粒徑在520530nm之間的膠體金顆粒上，噴涂于玻璃纖維膜或聚脂膜上，經(jīng)干燥制成金標(biāo)墊作為流動相抗體，將另一株抗原表位不同的抗H-FABP特異性單克隆抗體固定在硝酸纖維素膜上作為固定相抗體(檢測線)，用以捕獲已經(jīng)與膠體金標(biāo)記抗體結(jié)合的待檢血樣中的H-FABP抗原。同理，將一株針對cTnI抗原的特異性單克隆抗體標(biāo)記于粒徑在520530nm之間的膠體金顆粒上，噴涂于玻璃纖維膜或聚脂膜上，經(jīng)干燥制成金標(biāo)墊作為流動相抗體，將另一株抗原表位不同的抗cTnI特異性單克隆抗體固定在硝酸纖維素膜上作為固定相抗體(檢測線)，用以捕獲已經(jīng)與膠體金標(biāo)記抗體結(jié)合的待檢血樣中的的cTnI抗原。在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)體系中，當(dāng)樣品中H-FABP、cTnI抗原存在時，該抗原可以同時與固定相抗體、膠體金標(biāo)記抗體結(jié)合，形成“三明治”形式的抗原抗體復(fù)合物，使得該抗原被固定到固定相抗體(檢測線)位置，在檢測線位置出現(xiàn)膠體金顆粒特有的色帶，以顯示待檢抗原的存在。在本發(fā)明一個優(yōu)選的方案中，固定相抗體為兩株針對H-FABP、cTnI的特異性單克隆抗體，產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞株保藏號分別為CGMCCNo.3428、CGMCCNo.3425。用上述兩株針對H-FABP、cTnl的特異性單克隆抗體包被硝酸纖維素膜，形成兩條互相分離的檢測線。流動相標(biāo)記抗體為另外兩株抗原表位不同的抗H-FABP、抗cTnl的特異性單克隆抗體，產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞株保藏號保藏號分別為CGMCCNo.3427、CGMCCNo.3426，該抗體用于標(biāo)記粒徑在520530nm膠體金顆粒。質(zhì)控線可以將與標(biāo)記抗體特異性結(jié)合的二抗或其他蛋白固定在纖維素膜上作為質(zhì)控線，例如鏈球菌G蛋白或金黃色葡萄球菌A蛋白。本發(fā)明的膠體金標(biāo)記抗體是小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體，相應(yīng)的，質(zhì)控線可采用羊/兔抗鼠IgG的多抗、鏈球菌G蛋白或金黃色葡萄球菌A蛋白。無論待檢樣品中是否含有H-FABP、cTnI抗原，本發(fā)明的快速檢測急性心肌梗塞免疫層析試條中質(zhì)控線位置總能形成色帶，該條色帶是判定檢測過程是否正常和免疫層析試條是否變質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。免疫層析試條如圖1、2所示，圖1為快速診斷急性心肌梗塞的免疫層析試條的正面結(jié)構(gòu)圖，圖2為快速診斷急性心肌梗塞的免疫層析試條的縱截面結(jié)構(gòu)圖?？焖僭\斷急性心肌梗塞的免疫層析試條由吸水墊4、硝酸纖維素膜(NC膜)3、金標(biāo)墊2和樣品墊(全血濾膜)1四部分粘貼在PVC底板8上組成；硝酸纖維素膜3上設(shè)有檢測線5、6和質(zhì)控線7。檢測過程與結(jié)果判斷測定時將待檢全血樣品150uL，血清或血漿樣品100uL加在加樣孔中，樣品依次按樣品墊1、金標(biāo)墊2、硝酸纖維素膜3、吸水墊4的方向移動，流經(jīng)金標(biāo)墊2時使金標(biāo)墊2上的膠體金標(biāo)記抗體復(fù)溶，并帶動其向硝酸纖維素膜3、吸水墊4移動。膠體金標(biāo)記抗體可與樣品中的H-FABP、cTnI抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。此免疫復(fù)合物流至檢測線5(本發(fā)明實施例為特異性結(jié)合H-FABP的單克隆抗體)和檢測線6(本發(fā)明實施例為特異性結(jié)合cTnI單克隆抗體)時，即被檢測線5和檢測線6的特異性固相抗體所捕獲，在硝酸纖維素膜3上的檢測線5和6位置顯出膠體金顆粒特有的色帶檢測線條；此免疫復(fù)合物或者金標(biāo)抗體本身流經(jīng)質(zhì)控線7時，即被質(zhì)控線7的固相抗體(本發(fā)明實施例為兔抗鼠抗體)所捕獲，在硝酸纖維素膜3上的質(zhì)控線7位置顯出膠體金顆粒特有色帶質(zhì)控線條。檢測線5的陽性閾值設(shè)定為被測樣品中的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白抗原濃度大于或者等于lOng/ml，這是因為通過臨床試驗發(fā)現(xiàn)心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白用于急性心肌梗塞早期篩選診斷時，其檢測值以lOng/ml為最佳，當(dāng)血液中的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白抗原濃度大于或等于lOng/ml時，檢測結(jié)果為陽性，否則為陰性。檢測線6的陽性閾值設(shè)定為被測樣品中的心肌肌鈣蛋白抗原濃度大于或者等于1.5ng/ml，這是因為通過臨床試驗發(fā)現(xiàn)心肌肌鈣蛋白用于急性心肌梗塞篩選診斷時，其檢測值以1.5ng/ml為最佳，當(dāng)血液中的肌鈣蛋白抗原濃度大于或等于1.5ng/ml時，檢測結(jié)果為陽性，否則為陰性。圖3為快速診斷急性心肌梗塞的試劑盒示意圖。其中，9為外殼；10為觀察窗；11為加樣孔。陽性標(biāo)本既顯示檢測線，又顯示質(zhì)控線，如圖3a；陰性標(biāo)本沒有檢測線，僅顯示質(zhì)控線，如圖3b。如果質(zhì)控帶不顯色，不論檢測線是否顯色，均判為試條失效。以下結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法；所述百分含量如無特別說明均為質(zhì)量/體積百分含量或體積/體積百分含量。實施例1.H-FABP、cTnI重組抗原的制備H-FABP重組抗原的制備根據(jù)GENBANK公開的人H-FABPDNA序列，設(shè)計合成兩條兩端包含限制性內(nèi)切酶位點的PCR引物，序列為5'-AGCTGGATCCATGGTGGACGCTTTCCTGGGC-3'；5'-CTAGGAATTCTGCCTCTTTCTCATAAGTGCG-3'。從心臟組織用RT-PCR方法擴(kuò)增得到H-FABPcDNA序列，插入表達(dá)載體pET16b，經(jīng)測序確認(rèn)基因序列正確后，轉(zhuǎn)入到E.coliBL/21(LysE)菌株，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的H-FABP利用Ni-Agarose親和層析柱分離純化，得到H-FABP重組抗原。具體操作按《分子克隆》及產(chǎn)品說明書教導(dǎo)的方法進(jìn)行。cTnI重組抗原的制備根據(jù)GENBANK公開的人cTnI的DNA序列，設(shè)計合成兩條兩端包含限制性內(nèi)切酶位點的PCR引物，序列為5'-GACTGGATCCATGGCGGATGGGAGCAGCGAT-3'；5'-ACTGGAATTCGCTCTCAAACTTTTTCTTGCG-3。從心臟組織用RT-PCR方法擴(kuò)增得到cTnIcDNA序列，插入表達(dá)載體pET22b，經(jīng)測序確認(rèn)基因序列正確后，轉(zhuǎn)入到E.coliBL/21(LysE)菌株，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的H-FABP利用Ni-Agarose親和層析柱分離純化，得到H-FABP重組抗原。具體操作按《分子克隆》及產(chǎn)品說明書教導(dǎo)的方法進(jìn)行。實施例2.H-FABP、cTnI單克隆抗體的制備免疫每只BALB/c小鼠首次腹腔注射100ug上述純化的重組蛋白+福氏完全佐劑的混懸液，以后每隔1月注射100ug純化的重組蛋白+福氏不完全佐劑的混懸液1次，共3次，并于殺鼠取脾進(jìn)行細(xì)胞融合的前3d經(jīng)尾靜脈直接注射抗原加強(qiáng)免疫1次。雜交瘤細(xì)胞的產(chǎn)生與篩選SP2/0瘤細(xì)胞與免疫鼠脾細(xì)胞的融合及雜交瘤細(xì)胞的克隆按本實驗室常規(guī)方法進(jìn)行。以上述純化的重組蛋白抗原包被酶標(biāo)板，用間接ELISA法對雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測篩選陽性孔，對陽性孔三次克隆化培養(yǎng)，選取穩(wěn)定分泌特異抗以上重組蛋白抗原的雜交瘤細(xì)胞株，作為研發(fā)生產(chǎn)該試劑的雜交瘤細(xì)胞株。單克隆抗體(McAb)免疫球蛋白亞類鑒定經(jīng)濃縮的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液與羊抗鼠IgG、IgM、IgA、IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3在1%生理鹽水瓊脂板上進(jìn)行免疫雙擴(kuò)散以鑒定McAb免疫球蛋白亞類。腹水生產(chǎn)與腹水效價決定每只BALB/c小鼠腹腔注射5X106雜交瘤細(xì)胞，1周后隨時觀察并取腹水。以純化的重組蛋白包被酶標(biāo)板，腹水進(jìn)行倍比稀釋，第1稀釋度為11000，用常規(guī)ELISA法確定腹水效價。免疫印跡實驗取重組表達(dá)的H-FABP、cTnI抗原進(jìn)行SDS-PAGE電泳，而后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜上。轉(zhuǎn)移完畢后硝酸纖維素膜用含5%脫脂奶粉的PBS溶液室溫封閉1小時，用PBS含0.5%TritonX-lOO(PBS-T)洗滌3次，按120000稀釋度加入單克隆抗體，4°C過夜，用PBS-T洗滌3次，加入用PBS稀釋(15000)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠抗體室溫?fù)u2小時，同法洗滌3次，再用PBS洗滌1次，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物系統(tǒng)(DAB50mg,PBS100ml,30%H20210uL)顯色。篩選到兩株分泌特異性抗H-FABP的單克隆細(xì)胞株(1)7C8(保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號為CGMCCNo.3428，保藏日期為2009年11月09日，分類命名抗-人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(HFABP)雜交瘤細(xì)胞株)，該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體經(jīng)鑒定為IgG2a型；(2)2G4(保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號為CGMCCNo.3427，保藏日期為2009年11月09日，分類命名抗-人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(HFABP)雜交瘤細(xì)胞株)，該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體經(jīng)鑒定為IgGl型。篩選到兩株分泌特異性抗cTnI的單克隆細(xì)胞株(1)3D2(保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號為CGMCCNo.3425，保藏日期為2009年11月09日，分類命名抗-人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)雜交瘤細(xì)胞株)，該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體經(jīng)鑒定為IgGl型；(2)2E5(保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號為CGMCCNo.3426，保藏日期為2009年11月09日，分類命名抗-人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)雜交瘤細(xì)胞株)，該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體經(jīng)鑒定為IgG2a型。單克隆抗體的純化將含H-FABP、cTnI單克隆抗體的小鼠腹水，先使用正辛酸_硫酸銨沉淀法抽提，然后再用G蛋白層析柱(美國GenScript產(chǎn)品)按產(chǎn)品說明書純化單克隆抗體。實施例3.膠體金標(biāo)記抗體溶液的制備用以下方法制備H-FABP、cTnI特異性抗體標(biāo)記的膠體金金標(biāo)探針溶液和金標(biāo)抗體墊用檸檬酸還原法制備膠體金將質(zhì)量百分比濃度為0.01%的HAuC14(滬試牌購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)水溶液煮沸，攪拌下加入2mL質(zhì)量百分比濃度為的檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)煮沸，直到液體呈深紅色，得到膠體金溶液。確定膠體金偶聯(lián)抗體飽和度用0.1MK2C03溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5，準(zhǔn)備96孔酶標(biāo)板，在孔中用0.05M硼酸緩沖液倍比稀釋抗H-FABP、cTnI的特異性抗體，做一個稀釋度梯度，分別加入相同體積膠體金混勻，再加入相同體積的10%NaCl溶液，混勻，觀察液體顏色變化，顏色沒有變化最低的抗體量就是最適濃度。結(jié)果確定保持穩(wěn)定的抗體終濃度為20yg/mL0抗H-FABP、cTnI特異性單克隆抗體的膠體金溶液及金標(biāo)抗體墊的制備用0.1MK2C03溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5，每100mL膠體金溶液加入純化的抗H-FABP單克隆抗體使終濃度為20ug/mL,4°C、150200rpm攪拌4小時，再加入PEG20000使終濃度為0.05%，攪拌1小時，lOOOOrpm離心30分鐘，棄上清，用20mM硼酸緩沖液洗滌沉淀，并將其保存于20mL含5%蔗糖的20mM硼酸緩沖液中，得到抗H-FABP單克隆抗體膠體金溶液。同樣方法制備抗cTnI單克隆抗體膠體金溶液。將制備的兩種膠體金溶液按照體積比11的比例混合，用于浸泡玻璃纖維墊。浸泡的玻璃纖維墊在37°C下干燥5小時，得到金標(biāo)抗體墊。實施例4.快速診斷急性心肌梗塞膠體金免疫層析試條的制備如圖1所示，圖中A為快速診斷急性心肌梗塞膠體金免疫層析試條的正面結(jié)構(gòu)圖，圖中B為快速診斷急性心肌梗塞膠體金免疫層析試條的縱截面結(jié)構(gòu)圖?？焖僭\斷急性心肌梗塞膠體金免疫層析試條由吸水墊4、硝酸纖維素膜(NC膜)3、金標(biāo)抗體墊2和樣品墊1四部分粘貼在PVC底板8上組成；硝酸纖維素膜3上設(shè)有檢測帶5、6和質(zhì)控帶7，該試紙的制備方法包括以下步驟NC膜的包被兩株特異性結(jié)合H-FABP、cTnI的單克隆抗體分別用10mMpH9.0的CBS緩沖液稀釋到2mg/mL，用于包被兩條檢測帶；兔抗鼠IgG由蘭州生物制品研究免疫家兔、檢測、純化制備，用10mMpH9.0的CBS緩沖液稀釋到2mg/mL，用于包被一條質(zhì)控帶。用XYZ-3050型噴點系統(tǒng)分別噴涂于300mm長、25mm寬的NC膜(購于MILLIPORE公司)上，形成互相分離的檢測線。37°C下干燥2小時。膠體金免疫層析試條的制備用一塊單面涂了不干膠的PVC底板，中間粘貼上處理好的NC膜；NC膜靠近質(zhì)控線的一端緊密粘貼吸水墊(購于MILLIPORE公司)；NC膜靠近檢測線的一端緊密粘貼金標(biāo)抗體墊；金標(biāo)抗體墊另一端緊密粘貼樣品墊(全血濾膜；購于MILLIPORE公司)；將組裝成的試紙條用CM24000型切條系統(tǒng)切成5.0mm寬度，裝入塑料外殼中，再將組裝好的試紙條裝入加干燥劑的包裝袋中。實施例5.快速診斷急性心肌梗塞膠體金免疫層析試條靈敏度的測試按照實施例4的方法，調(diào)整質(zhì)控線抗體、金標(biāo)抗體濃度，制備快速診斷急性心肌梗塞膠體金免疫層析試條。將基因工程表達(dá)的H-FABP與cTnI抗原經(jīng)親和層析法純化、紫外分光法測定蛋白含量。用含70mg/ml人血白蛋白的PB(0.15M，pH7.4)緩沖液定量稀釋H-FABP純化抗原4份(S1-S4)，其中SI:H-FABP含量10ng/ml；S2:H_FABP含量20ng/ml；S3:H_FABP含量40ng/ml；S4H-FABP含量80ng/ml。用于控制對H-FABP陽性樣本的檢出能力。用含70mg/ml人血白蛋白的PB(0.15M，pH7.4)緩沖液定量稀釋cTnI純化抗原4份(S1'S4')，其中SI':cTnI含量1.5ng/ml;S2':cTnI含量3.0ng/ml;S3‘:cTnI含量6.Ong/ml；S4':cTnI含量12.Ong/ml。用于控制對cTnI陽性樣本的檢出能力。分別測試，結(jié)果如表1所示表1、靈敏度測試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例6.快速診斷急性心肌梗塞膠體金免疫層析試條的實驗檢測應(yīng)用本急性心肌梗塞早期快速檢測試紙對臨床收集的樣品進(jìn)行初步實驗，結(jié)果顯示，該試紙對于早期AMI檢測的敏感性和特異性較高。其檢測結(jié)果如下早期急性心肌梗塞病人25例，陽性25例；穩(wěn)定性心絞痛病人24例，弱陽性1例，余者均為陰性；不穩(wěn)定性心絞痛病人20例，弱陽性2例，余者均為陰性；非心源性胸痛病人16例，陽性2例(2例為外傷病人)。實施例7.快速診斷急性心肌梗塞膠體金免疫層析試劑盒的穩(wěn)定性考核考核方法用實施例1制備的快速診斷急性心肌梗塞膠體金免疫層析試劑盒分別在室溫(535°C不放冰箱，不開空調(diào))下和37°C培養(yǎng)箱保存，進(jìn)行老化試驗。每隔2周抽樣，按使用說明檢測血樣。實驗結(jié)果用本發(fā)明的快速診斷急性心肌梗塞膠體金免疫層析試條進(jìn)行穩(wěn)定性考核結(jié)果，室溫下可以至少穩(wěn)定18個月，37°C下老化試驗至少穩(wěn)定8個月，檢測結(jié)果仍符合要求。權(quán)利要求一種用于免疫學(xué)方法檢測急性心肌梗塞的試劑，包括以下組分針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的單克隆抗體；和針對人心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的單克隆抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述的針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的單克隆抗體選自7C8和2G4中的一種，其中7C8由保藏號為CGMCCNo.3428的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生，2G4由保藏號為CGMCCNo.3427的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生；所述針對人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的單克隆抗體選自3D2和2E5中的一種，其中3D2由保藏號為CGMCCNo.3425的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生，2E5由保藏號為CGMCCNo.3426的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述的針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的單克隆抗體包括抗原表位不同的第一抗體和第二抗體；所述的針對人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的單克隆抗體包括抗原表位不同的第一抗體和第二抗體。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑，其特征在于，所述的針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的第一抗體為非標(biāo)記抗體，第二抗體為用常規(guī)方法標(biāo)記的抗體；所述的人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的第一抗體為非標(biāo)記抗體，第二抗體為常規(guī)方法標(biāo)記的抗體。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑，其特征在于，所述的針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的第二抗體和所述的針對人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的第二抗體用膠體金標(biāo)記。6.根據(jù)權(quán)利要求3的任一項所述的試劑，其特征在于，所述的針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的第一抗體選自7C8和2G4中的一種，第二抗體為另一種；所述的針對人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的第一抗體選自3D2和2E5中的一種，第二抗體為另一種。7.一種用于免疫學(xué)方法檢測急性心肌梗塞的測試條，包括以下組分樣品墊、緊密連接于所述樣品墊的含有膠體金標(biāo)記抗體的金標(biāo)墊、與所述金標(biāo)墊緊密連接的纖維素膜和緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊；所述纖維素膜上遠(yuǎn)離金標(biāo)墊的一端設(shè)置質(zhì)控線，在質(zhì)控線和金標(biāo)墊之間的纖維素膜上設(shè)置兩條相互分離的檢測線；其中所述的兩條檢測線由分別針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)、人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的特異性抗體組成；所述的膠體金標(biāo)記抗體由抗原表位不同的分別針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)、人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的特異性抗體組成；所述的質(zhì)控線由特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記抗體的二抗、鏈球菌G蛋白(SPG)或金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)組成。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的測試條，其特征在于，所述的針對人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的特異性抗體為抗原表位不同的單克隆抗體7C8和2G4，其中7C8由保藏號為CGMCCNo.3428的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生，2G4由保藏號為CGMCCNo.3427的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生；所述針對人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的特異性抗體為抗原表位不同的單克隆抗體3D2和2E5，其中3D2由保藏號為CGMCCNo.3425的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生，2E5由保藏號為CGMCCNo.3426的小鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的測試條，其特征在于，所述的兩條檢測線，一條檢測線由抗人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的單克隆抗體7C8組成，另一條檢測線由抗人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)單克隆抗體3D2組成；所述的膠體金標(biāo)記抗體由抗原表位不同的抗人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)的單克隆抗體2G4和抗人心肌肌鈣蛋白I(cTnl)單克隆抗體2E5組成；所述的質(zhì)控線由特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記抗體的二抗、鏈球菌G蛋白或金黃色葡萄球菌A蛋白組成。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的測試條，其特征在于，所述檢測線的特異性抗體終濃度為14mg/ml，按每ul噴涂成Icm長度噴涂到纖維素膜上形成檢測線；所述金標(biāo)墊是用膠體金標(biāo)記抗體溶液充分浸泡玻璃纖維膜；所述質(zhì)控線的特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記抗體的二抗、鏈球菌G蛋白或金黃色葡萄球菌A蛋白終濃度分別為14mg/ml、0.25lmg/ml、0.25lmg/ml，按每ul噴涂成Icm長度噴涂到纖維素膜上形成質(zhì)控線。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的測試條，其特征在于，所述檢測線終濃度為2mg/ml；所述質(zhì)控線的特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記抗體的二抗、鏈球菌G蛋白或金黃色葡萄球菌A蛋白終濃度分別為2mg/ml、0.5mg/ml、0.5mg/ml。12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的測試條，其特征在于，所述支持檢測線和質(zhì)控線的纖維素膜為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜或混合膜；所屬支持膠體金標(biāo)記抗體的金標(biāo)墊為玻璃纖維膜或聚脂膜；所述樣品墊是全血濾膜或全血濾膜上覆蓋一層覆蓋膜的雙層膜，其中全血濾膜是棉籽絨和纖維素的混合物或者玻璃纖維和纖維素混合物，覆蓋膜是玻璃纖維或吸水紙；所述吸水墊為吸水紙。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的測試條，其特征在于，免疫層析測試條各部分寬度均為5mm，其中纖維素膜長25mm，金標(biāo)墊長5mm，全血濾膜長度18mm，覆蓋膜長度20mm，吸水墊長度20mm。14.根據(jù)權(quán)利要求712的任一項所述的測試條，其特征在于，用于快速檢測早期急性心肌梗塞的免疫層析測試條還包括一個起支持作用的底板和保護(hù)作用的外殼；所述的外殼在相對于檢測線、質(zhì)控線的位置設(shè)有觀察窗，相對于樣品墊的位置設(shè)置有加樣孔；所述的底板、外殼材質(zhì)為塑料。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)診斷試劑，尤其涉及用于急性心肌梗塞早期診斷的快速檢測試劑及測試條。本發(fā)明提供了一種雙指標(biāo)聯(lián)合檢測試劑，包含抗人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白H-FABP和抗人心肌肌鈣蛋白cTnI的特異性抗體。本發(fā)明還提供了一種包含抗H-FABP和cTnI特異性抗體的膠體金標(biāo)記免疫層析測試條，用于快速檢測急性心肌梗塞。本發(fā)明的雙指標(biāo)聯(lián)合檢測試劑，即可對急性心肌梗塞患者早期診斷，又可防止對長期、癥狀輕微的慢性心梗病人的漏診，比較好的解決了檢測時間存在差異帶來的影響。本發(fā)明的膠體金標(biāo)記免疫層析測試條為急性心肌梗塞的早期診斷提供了快速、方便、價廉、實用的檢測工具，可望用于各級醫(yī)院，也可用于病人的自我監(jiān)測。文檔編號C07K16/18GK101806804SQ20101002255公開日2010年8月18日申請日期2010年1月8日優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日發(fā)明者席仲興,張云濤,張正雷,張甲菊,彭林峰,楊福軍申請人:蘭州生物制品研究所