專利名稱：南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種分子生物技術(shù)領(lǐng)域核的苷酸序列，特別是一種按照酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成的南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列。
背景技術(shù)：
脂肪酶(EC.3.1.1.3)是在生物催化反應(yīng)中非常重要的一類酶，目前已被廣泛應(yīng)用于油化學(xué)、清潔劑、食品工業(yè)和精細(xì)化工產(chǎn)品制備等很多領(lǐng)域。在眾多脂肪酶中，CALB(Candida antarctica lipase B，南極假絲酵母脂肪酶B)的用途最為廣泛，它對(duì)非水溶性和水溶性物質(zhì)都有很強(qiáng)的催化活性。近幾年的研究成果表明CALB以及Novozym 435(吸附固定于大孔丙烯酸樹脂的CALB)在酯化、水解、轉(zhuǎn)酯以及其它類型的反應(yīng)中都顯示了較其它脂肪酶更為出色的催化性能。CALB良好的催化性能已引起了全世界的關(guān)注，目前諾維信公司生產(chǎn)的Novozym435價(jià)格在300元/克左右，所以降低成本已是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。目前從理論上降低CALB成本可以具有以下幾種途徑1)降低酶的發(fā)酵生產(chǎn)成本。由于大規(guī)模發(fā)酵存在單位酶產(chǎn)量降低和酶穩(wěn)定性降低的問題，所以在大規(guī)模發(fā)酵中很難降低成本。2)降低固定化成本。目前固定化采用吸附固定，機(jī)械攪拌或磁力攪拌都容易使Novozym435在反應(yīng)過程中出現(xiàn)酶脫落，甚至固定化顆粒破碎，這也是固定化酶面臨的普遍問題。3)利用異源重組表達(dá)來提高脂肪酶的產(chǎn)量。
在1994年，CALB的核苷酸序列被克隆和研究(Structure.1994，2293-308)，研究提供了CALB完整編碼區(qū)的核苷酸序列及其信號(hào)肽序列，并且與其它脂肪酶的核苷酸序列同源性的比較表明CALB與其它脂肪酶沒有明顯的同源性。盡管在1995年CALB在米曲霉中進(jìn)行了異源表達(dá)(Journal of Botany.1995，73869)，在一定程度上克服了野生型南極假絲酵母發(fā)酵培養(yǎng)成本高以及對(duì)脂肪酶B表達(dá)量低的問題，但是尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題有密切聯(lián)系文獻(xiàn)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種按畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成的南極假絲酵母脂肪酶基因，并利用基因工程的辦法，將該基因在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，以提高表達(dá)脂肪酶的含量，從而能夠?qū)崿F(xiàn)降低發(fā)酵的成本。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明按照畢赤酵母偏愛密碼子結(jié)構(gòu)，通過化學(xué)方法人工合成了CALB基因，人工合成的DNA分子，編碼具有與野生型CALB蛋白在氨基酸水平上具有相同功能的核苷酸序列，所述的編碼具有CALB脂肪酶活性的多肽的核苷酸序列，具有SEQID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列有至少85％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列雜交。
所述的“中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下”指核苷酸序列之間能在2×SSC(0.3M檸檬酸鈉，3M氯化鈉，pH 7.0)和0.1％SDS的條件下。
所述的“化學(xué)方法”指亞磷酸三酯法，用于核苷酸序列的固相合成。
所述的“人工合成”指在體外進(jìn)行的、使用核酸自動(dòng)合成儀合成核苷酸序列的方法。
所述的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明的南極假絲酵母脂肪酶基因按如下畢赤酵母偏愛密碼子對(duì)照表的優(yōu)先結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

用人工合成的方法獲得CALB基因核苷酸編碼序列后，就可以用重組法來大批量獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
用在畢赤酵母中產(chǎn)生和表達(dá)的方法能夠獲得所述的CALB基因，其方法步驟如下(1)將按畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)人工合成的編碼CALB蛋白活性多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成南極假絲酵母脂肪酶基因表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列有至少85％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列雜交。
本發(fā)明可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒、粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的脂肪酶多肽時(shí)，可以將脂肪酶編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成脂肪酶蛋白表達(dá)載體。
本發(fā)明所說“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母，在28-30℃條件下，在抗生素平板上培養(yǎng)2-4天，獲得含有CALB蛋白基因的重組細(xì)胞。
(3)再生重組細(xì)胞，獲得表達(dá)CALB蛋白基因的重組酵母菌株。
所述的CALB基因，是指編碼具有與南極假絲酵母脂肪酶催化活性相同的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第1-957位核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還指能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列的同源性至少85％，較佳地至少90％，更佳地至少95％，最佳地至少98％的核苷酸序列。
本發(fā)明所說的“CALB”指具有脂肪酶催化活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。
本發(fā)明按照畢赤酵母偏愛密碼子的優(yōu)先結(jié)構(gòu)，人工合成了南極假絲酵母的脂肪酶基因，并利用基因工程的辦法，使之在畢赤酵母中高度表達(dá)，提高了脂肪酶的表達(dá)量，從而降低了工業(yè)發(fā)酵的成本，在工業(yè)上具有廣闊的產(chǎn)業(yè)化前景。
具體實(shí)施例方式
為更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，以下通過具體的實(shí)施例來進(jìn)一步詳細(xì)說明。下列實(shí)施例中按照常規(guī)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1CALB蛋白基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明根據(jù)南極假絲酵母脂肪酶CALB蛋白質(zhì)氨基酸序列，按畢赤酵母偏愛密碼子對(duì)照表設(shè)計(jì)合成了南極假絲酵母脂肪酶CALB基因，全長(zhǎng)為957bp，即為開放閱讀框，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.1。據(jù)此推導(dǎo)出，除了一個(gè)終止密碼子外，共編碼318個(gè)氨基酸殘基，分子量為33.3KD，等電點(diǎn)(pI)為5.26，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.2。
按畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)人工合成的CALB基因序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與野生型南極假絲酵母CALB具有一定的同源性。在核苷酸水平上，它與野生型南極假絲酵母脂肪酶CALB的核苷酸序列(GenBankAccession No.Z30645)的全編碼序列具有一定的同源性，其中同源性較高的部分見同源比較(GAP)圖表1；在氨基酸水平上，它與野生型南極假絲酵母CALB(GenPept Accession No.P41365)氨基酸殘基的同源性達(dá)到100％，見氨基酸序列同源比較(FASTA)圖表2。由此可見，設(shè)計(jì)合成的CALB與野生型南極假絲酵母脂肪酶CALB在蛋白水平上一致同源，可以認(rèn)為兩者在功能上也相同。
表178％ identity in 281nt overlapQuery 133 ggtccacaatctttcgactctaactggattccattgtctactcaattgggttacactcca 192|||||||| || |||||||| |||||||| || | || || || ||||||||||| |||Sbjct 205 ggtccacagtcgttcgactcgaactggatccccctctcaacgcagttgggttacacaccc 264Query 193 tgttggatttctccaccacctttcatgttgaacgacactcaagttaacactgaatacatg 252|| ||||| || || || || |||||| | |||||||| || || ||||| || ||||||Sbjct 265 tgctggatctcacccccgccgttcatgctcaacgacacccaggtcaacacggagtacatg 324
Query 253 gttaacgctattactgctttgtacgctggttctggtaacaacaagttgccagttttgact 312|| ||||| || || || | ||||||||||| || ||||||||| | || || | ||Sbjct 325 gtcaacgccatcaccgcgctctacgctggttcgggcaacaacaagcttcccgtgcttacc 384Query 313 tggtctcaaggtggtttggttgctcaatggggtttgactttcttcccatctattagatct 372||||| || |||||| ||||||| || | |||| |||| |||||||| ||| || ||Sbjct 385 tggtcccagggtggtctggttgcacagtggggtctgaccttcttccccagtatcaggtcc 444Query 373 aaggttgatagattgatggcttttgctccagactacaaggg 413||||| ||| || | ||||| ||||| || |||||||||||Sbjct 445 aaggtcgatcgacttatggcctttgcgcccgactacaaggg 485Query按畢赤酵母密碼子偏愛設(shè)計(jì)人工合成的CALB基因的核酸序列sbjct南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)的核酸序列(z30645)表2按畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)人工合成的CALB與南極假絲酵母CALB核苷酸序列的同源比較(GAP)。其中，相同的核苷酸在兩個(gè)序列之間用豎線符標(biāo)出。
表2100％ identity in 317aa overlapQuery 2 LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLG 61LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGSbjct 26 LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLG 85Query 62 YTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPS 121YTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSSbjct 86 YTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPS 145Query 122 IRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTT 181IRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTTSbjct 146 IRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTT 205Query 182 NLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSA 241NLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSASbjct 206 NLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSA 265Query 242 LRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPY 301LRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPYSbjct 266 LRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPY 325Query 302 ARPFAVGKRTCSGIVTP 318ARPFAVGKRTCSGIVTPSbjct 326 ARPFAVGKRTCSGIVTP 342Query按畢赤酵母密碼子偏愛設(shè)計(jì)人工合成的CALB的氨基酸序列sbjct南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)的氨基酸序列(P41365)
表2按畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)的CALB與南極假絲酵母CALB的氨基酸序列同源比較(FASTA)。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。
實(shí)施例2將實(shí)施例1合成的CALB基因在畢赤酵母中的產(chǎn)生畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建在保證閱讀框正確的前提下，將含有合成基因CALB的pPICZαA質(zhì)粒載體的大腸桿菌，接種到含Zeocin抗生素的LB培養(yǎng)基中，在37℃的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)過夜，過夜的細(xì)菌按照分子克隆所提供的方法抽提質(zhì)粒。
再采用電擊法(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母(如GS115，或KM71)。
實(shí)施例3CALB基因在畢赤酵母細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定CALB基因在畢赤酵母細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)1.將實(shí)施例2所獲得的含有CALB基因的重組酵母細(xì)胞用無(wú)菌牙簽挑取，接種于25ml BMGY培養(yǎng)基中，28℃，250rpm振蕩培養(yǎng)至光密度值OD600＝2-6(一般需要16-18小時(shí))，使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
2.培養(yǎng)細(xì)胞在室溫下1500-3000g離心5min，棄上清。
3.菌體用BMMY培養(yǎng)基懸浮，使菌液的0D600＝1.0，菌液在28℃，250rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔24小時(shí)加入純甲醇至終濃度是0.5％，以補(bǔ)充揮發(fā)的甲醇來保證正常誘導(dǎo)。
4.按照時(shí)間點(diǎn)(0，6，12，24，48，72，96小時(shí))分別取出1ml培養(yǎng)液，測(cè)定OD600。
CALB誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定各時(shí)間點(diǎn)取樣在室溫下12000rpm離心2-3分鐘，測(cè)定上清水解對(duì)硝基苯酚葵酸酯的活力取4μl表達(dá)上清加至對(duì)硝基苯酚酯測(cè)定脂肪酶活反應(yīng)體系含192μl 1M TrisCl，pH8.0，4μl25mM對(duì)硝基苯酚葵酸酯(用DMSO配制)，混勻室溫反應(yīng)10min，加100μl無(wú)水乙醇終止反應(yīng)，反應(yīng)生成的對(duì)硝基苯酚是黃色物質(zhì)，從而確定上清中表達(dá)脂肪酶。同時(shí)終止反應(yīng)后，測(cè)光吸收A405nm，根據(jù)對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)濃度的光吸收A405nm曲線計(jì)算反應(yīng)體系生成的對(duì)硝基苯酚，再計(jì)算樣品每分鐘分解硝基苯酚葵酸酯產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚的μg數(shù)，即酶活力單位(U)。根據(jù)OD600和水解酶活力(U)繪制重組脂肪酶酵母菌的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明重組脂肪酶酵母菌在誘導(dǎo)表達(dá)48小時(shí)后，酶活力達(dá)到最高1.5×103U/ml，光密度值OD600是10.8。
本發(fā)明利用PCR方法分析確認(rèn)了畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)含有目的基因CALB，利用SDS-PAGE電泳和水解對(duì)硝基苯酚葵酸酯的顏色反應(yīng)鑒定了CALB的表達(dá)，利用仿生親和分離方法對(duì)CALB進(jìn)行的純化，利用Lowry法測(cè)定蛋白含量(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)。結(jié)果表達(dá)的脂肪酶蛋白量達(dá)到21.6mg/L。而野生型南極假絲酵母的脂肪酶表達(dá)量非常低，酶蛋白表達(dá)量的增加對(duì)解決酶成本高、滿足工業(yè)大規(guī)模工廠化生產(chǎn)需要具有重要意義。
本發(fā)明涉及的序列和記號(hào)分列如下SEQ ID NO.1的信息<110>上海交通大學(xué)<120>南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列<140>
<141>2006-03-25<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>957<212>DNA<213>人工合成<400>11atgttgcctt ctggttctga ccctgctttt tctcaaccaa agtctgtttt ggatgctggt61 ttgacttgtc aaggtgcttc tccatcttct gtttctaaac caattttgtt ggttccaggt
121 actggtacta ctggtccaca atctttcgac tctaactgga ttccattgtc tactcaattg181 ggttacactc catgttggat ttctccacca cctttcatgt tgaacgacac tcaagttaac241 actgaataca tggttaacgc tattactgct ttgtacgctg gttctggtaa caacaagttg301 ccagttttga cttggtctca aggtggtttg gttgctcaat ggggtttgac tttcttccca361 tctattagat ctaaggttga tagattgatg gcttttgctc cagactacaa gggtactgtt421 ttggctggtc ctttggatgc tttggctgtt tctgctccat ctgtttggca acaaactact481 ggttctgctt tgactactgc tttgagaaac gctggtggtt tgactcaaat tgttccaact541 actaacttgt actctgctac tgacgaaatt gttcaacctc aagtttctaa ctctccattg601 gactcttctt acttgttcaa cggtaagaac attcaagctc aagctgtttg tggtccattg661 ttcgttattg accatgctgg ttctttgact tctcaattct cttacgttgt tggtagatct721 gctttgagat ctactactgg tcaagctaga tctgctgact atggtattac tgactgtaac781 cctttgccag ctaatgattt gactccagaa caaaaggttg ctgctgctgc tttgttggct841 ccagaagctg ctgctattgt tgctggtcca aagcaatact gtgaaccaga cttgatgcca901 tacgctagac catttgctgt tggtagaaga acttgttctg gtattgttac tccataaSEQ ID NO.2的信息<210>2<211>318<212>PRT<213>人工序列<400>21MLPSGSDPAF SQPKSVLDAG LTCQGASPSS VSKPILLVPG TGTTGPQSFD SNWIPLSTQL61 GYTPCWISPP PFMLNDTQVN TEYMVNAITA LYAGSGNNKL PVLTWSQGGL VAQWGLTFFP121 SIRSKVDRLM AFAPDYKGTV LAGPLDALAV SAPSVWQQTT GSALTTALRN AGGLTQIVPT181 TNLYSATDEI VQPQVSNSPL DSSYLFNGKN VQAQAVCGPL FVIDHAGSLT SQFSYVVGRS241 ALRSTTGQAR SADYGITDCN PLPANDLTPE QKVAAAALLA PAAAAIVAGP KQNCEPDLMP301 YARPFAVGKR TCSGIVTP
權(quán)利要求
1.一種南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征在于，按照畢赤酵母偏愛密碼子結(jié)構(gòu)，通過化學(xué)方法人工合成了CALB基因，人工合成的DNA分子，編碼具有與野生型CALB蛋白在氨基酸水平上具有相同功能的核苷酸序列，所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的編碼具有CALB脂肪酶活性的多肽的核苷酸序列，具有SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列有至少85％的同源性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，指核苷酸序列之間能在0.3M檸檬酸鈉，3M氯化鈉，pH7.0的2×SSC和0.1％SDS的條件下。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的化學(xué)方法，指亞磷酸三酯法，用于核苷酸序列的固相合成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的人工合成，指在體外進(jìn)行的、使用核酸自動(dòng)合成儀合成核苷酸序列的方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，用如下在畢赤酵母中產(chǎn)生和表達(dá)的方法能夠獲得所述的CALB基因(1)將按畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)人工合成的編碼CALB蛋白活性多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成南極假絲酵母脂肪酶基因表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列有至少85％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列雜交；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母，在28-30℃條件下，在抗生素平板上培養(yǎng)2-4天，獲得含有CALB蛋白基因的重組細(xì)胞；(3)再生重組細(xì)胞，獲得表達(dá)CALB蛋白基因的重組酵母菌株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種按畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成在畢赤酵母中表達(dá)的南極假絲酵母脂肪酶基因，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。按照畢赤酵母偏愛密碼子結(jié)構(gòu)，通過化學(xué)方法人工合成了CALB基因，人工合成的DNA分子，編碼具有與野生型CALB蛋白在氨基酸水平上具有相同功能的核苷酸序列，所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1－957位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明所說基因在畢赤酵母細(xì)胞中高效表達(dá)，所表達(dá)的脂肪酶量達(dá)到21.6mg/l，從而提供了一種按畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成在畢赤酵母中表達(dá)的南極假絲酵母脂肪酶基因，為解決酶成本高、滿足工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)需要具有重要意義。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1958797SQ20061011867
公開日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2006年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月23日
發(fā)明者唐克軒, 姚紅艷 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)