專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)腦鈉肽的光學(xué)生物傳感器及試劑制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，是一種快速檢測(cè)心衰標(biāo)志物腦鈉肽微量蛋白濃度
的光學(xué)生物傳感器和所用試劑的制備方法，這種傳感器可以快速檢測(cè)總腦鈉肽的濃度。
背景技術(shù)：
腦鈉肽是心室分泌的激素樣短肽，活性肽是腦鈉肽-32，腦鈉肽-32氨基端第7位 和第23位氨基酸殘基(半胱氨酸)通過(guò)二硫鍵形成一個(gè)環(huán)型結(jié)構(gòu)，此即為腦鈉肽的功能 域。腦鈉肽通過(guò)此構(gòu)象與其相應(yīng)的受體結(jié)合，在諸多病理生理過(guò)程中發(fā)揮作用，腦鈉肽值與 美國(guó)紐約心臟學(xué)會(huì)(NYHA)對(duì)心功能不全(CHF)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)密切相關(guān)，健康人分泌的腦鈉肽 數(shù)量極少，心功能不全越嚴(yán)重腦鈉肽值越高。因此腦鈉肽的測(cè)定是心臟疾病的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng) 目之一。 目前，雖然腦鈉肽含量在心衰診斷中有很高的價(jià)值，但腦鈉肽水平的測(cè)定并沒(méi)有 得到很好的普及，主要原因是檢測(cè)方法的制約。腦鈉肽檢測(cè)的方法學(xué)研究一直是腦鈉肽研 究的熱點(diǎn)。檢測(cè)腦鈉肽的主要方法有免疫放射分析法(RIMA)，免疫熒光法等，RIMA法由于 半衰期短、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)不適合于心臟病的急性診斷和小樣本檢測(cè)。Biosite公司推出的免疫 熒光法測(cè)定腦鈉肽水平，達(dá)到了快速檢測(cè)的目的，但需專(zhuān)門(mén)的熒光分析儀，成本很高，不適 合發(fā)展中國(guó)家。Bayer Diagnostics公司、Abbott公司也推出了腦鈉肽測(cè)定試劑，但成本均 較高，每個(gè)測(cè)試費(fèi)用均在25美元以上。研究表明降低檢測(cè)成本，就會(huì)影響檢測(cè)速度和靈敏 度。目前國(guó)內(nèi)對(duì)腦鈉肽的研究主要是利用進(jìn)口試劑進(jìn)行腦鈉肽檢測(cè)的臨床應(yīng)用，未見(jiàn)腦鈉 肽光學(xué)生物傳感技術(shù)及試劑的制備方法研究。因此，研發(fā)檢測(cè)成本低、快速、高靈敏度的腦 鈉肽光學(xué)生物傳感器及試劑是近幾年腦鈉肽研究的熱點(diǎn)。研制一種快速檢測(cè)腦鈉肽濃度的 光學(xué)生物傳感器及試劑的制備方法，來(lái)降低腦鈉肽檢測(cè)成本，使腦鈉肽檢測(cè)易于在國(guó)內(nèi)普 及，該技術(shù)具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開(kāi)一種檢測(cè)腦鈉肽的光學(xué)生物傳感器及試劑制備方法，用于心 力衰竭的診斷、心力衰竭的康復(fù)判斷、心力衰竭治療的監(jiān)控、評(píng)價(jià)左心室功能不良程度等。 本發(fā)明光學(xué)生物傳感器，檢測(cè)快速、靈敏度高、使用方便，并可以與便攜式光子計(jì)數(shù)儀配套 使用，用于腦鈉肽水平的檢測(cè)。 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是 —種檢測(cè)腦鈉肽的光學(xué)生物傳感器，包括基座、反應(yīng)區(qū)、封裝層；其中，基座上表面 縱向設(shè)有弧形凹槽，凹槽上表面具有毛細(xì)作用的橫向微溝道，凹槽的兩端為塑料封裝層，凹 槽的頂部鍵合透光性極好的耐腐蝕絕緣封裝層，凹槽的底部有一出樣孔，出樣孔貫通基座； 絕緣封裝層上設(shè)有兩個(gè)進(jìn)樣孔；凹槽、端部塑料封裝層、頂部絕緣封裝層圍成的空間為傳感 器的樣品反應(yīng)區(qū)；其樣品反應(yīng)區(qū)內(nèi)，橫向微溝道表面有一親水納米材料層；反應(yīng)區(qū)外，在反 應(yīng)區(qū)縱軸上，與兩端塑料封裝層相隔一間隙的各設(shè)置一微型電磁鐵，兩微型電磁鐵的引出線并聯(lián)； 使用時(shí)，反應(yīng)區(qū)內(nèi)加有反應(yīng)試劑。 所述的光學(xué)生物傳感器，其所述親水納米材料層為高分子納米材料、硅烷、丙烯酸
非磁性材料中的一種，以獲取低磁化強(qiáng)度和高比表面積的微溝道，該溝道不受磁場(chǎng)影響；端
部塑料封裝層為聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)中的一種，兩微型電磁鐵通過(guò)兩
端的塑料封裝層對(duì)反應(yīng)試劑中的磁納米探針及其復(fù)合物進(jìn)行磁化和富集。 所述的光學(xué)生物傳感器，其所述微溝道長(zhǎng)為0. 3 4. 0cm，寬為0. 1 20mm，深度
為0. 1 16mm ;微型電磁鐵尺寸為6mmX6mmX6. 4mm。 所述的光學(xué)生物傳感器，其所述反應(yīng)試劑，包括腦鈉肽磁納米探針、偶聯(lián)反應(yīng)組合 試劑、緩沖液、封閉液、標(biāo)記物標(biāo)記的特異性抗體、底物顯色液。 所述的光學(xué)生物傳感器，其所述偶聯(lián)反應(yīng)組合試劑，包括l-乙基3-(3-二甲氨 基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) ;N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS);戊二醛(glutardehyde)中的 一種或多種；其中，1-乙基3-(3_ 二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的濃度范圍為1. 5 9. Omg/ml ;N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)的濃度范圍為3. 0 10. Omg/ml ;戊二醛的濃度范 圍為5 30%。 所述的光學(xué)生物傳感器，其所述緩沖液為甘氨酸_鹽酸緩沖液(0. 05mol/L ;pH = 2. 2 5. 0)、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH = 2. 2 8. 0)、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩 沖液(0. 2mol/L;pH = 5. 8 8. 0)、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液(1/15mol/L ;pH = 4. 92 8. 18)、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液(0. 05mol/L ;pH = 5. 8 8. 0) 、 Tris-HCl緩 沖液(0. 05mol/L ;pH = 7. 10 9. 00)、甘氨酸_氫氧化鈉緩沖液(0. 05mol/L ;pH = 8. 6 10.6)、乙磺酸(MES)緩沖液中的任一種或幾種。 所述的光學(xué)生物傳感器，其所述封閉液為1 10%的脫脂奶粉，5 15%的賴(lài)氨 酸，或1 15%的牛血清白蛋白中的一種或它們的混合物。 所述的光學(xué)生物傳感器，其所述標(biāo)記物標(biāo)記的特異性抗體為辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的 腦鈉肽抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記的腦鈉肽抗體，熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的腦鈉肽抗體，生物素標(biāo)記的 腦鈉肽抗體中的一種； 其中熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的腦鈉肽抗體中使用的量子點(diǎn)是CdSe、 CdS、 ZnS、 InP、 InAs 及其核殼結(jié)構(gòu)中的一種或幾種。 所述的光學(xué)生物傳感器，其所述底物顯色液為1， 2 二氧環(huán)己烷衍生物(AMPPD)，或 底物液A、B套液中的一種；底物液A為魯米諾與其增強(qiáng)劑體系，底物液B為雙氧水緩沖液。
所述的光學(xué)生物傳感器，其所述腦鈉肽磁納米探針的濃度范圍0. 10 3. 00mg/ ml ;緩沖液濃度范圍0. 03 3. 0mo1/1 ;封閉液濃度范圍0. 03 2. 00mol/l ;標(biāo)記物標(biāo)記 的腦鈉肽特異性抗體濃度范圍0. 12 3. Omg/ml ;底物顯色液濃度范圍0. 8 3. 0mmo1/ L。 所述的光學(xué)生物傳感器，其檢測(cè)系統(tǒng)采用光子計(jì)數(shù)法檢測(cè)，加入底物催化發(fā)光或 激發(fā)熒光量子點(diǎn)發(fā)光。 —種所述的光學(xué)生物傳感器反應(yīng)試劑的制備方法，其包括以下步驟 a)首先，在離心管中將1000 iil濃度為0. 5 3mg/ml的表面修飾有不同功能基
團(tuán)的磁納米粒子溶液、800ii1濃度為0. 1 0. 2mg/ml的腦鈉肽抗體溶液或濃度為0. 1 0. 2mg/ml的生物素標(biāo)記的腦鈉肽抗體溶液混合均勻，在37t:下孵育10 60min，使其發(fā)生 縮合反應(yīng)或通過(guò)生物素_親和素作用發(fā)生反應(yīng)，完成磁納米粒子與腦鈉肽抗體的偶聯(lián)，經(jīng) 過(guò)洗滌、沉淀、磁分離后得到具有高特異性的腦鈉肽磁納米探針。 b)將50iU腦鈉肽磁納米探針溶液活化后從進(jìn)樣孔2加入光學(xué)生物傳感器； 80 ii 1腦鈉肽待測(cè)樣品從進(jìn)樣孔8加入光學(xué)生物傳感器，通過(guò)控制電磁鐵來(lái)實(shí)現(xiàn)磁納米粒 子的運(yùn)動(dòng)，將兩者混勻，然后從進(jìn)樣孔2加入20 ii 1標(biāo)記物標(biāo)記的腦鈉肽特異性抗體溶液， 通過(guò)控制磁粒子的運(yùn)動(dòng)來(lái)混勻溶液，放在溫度為35 37t:的恒溫箱中放置20 30min。
c)通過(guò)磁分離，用PBS洗滌去掉多余的未參與反應(yīng)的標(biāo)記物標(biāo)記的腦鈉肽特異性 抗體溶液，洗滌液從出樣孔10流出； d)向光學(xué)生物傳感器內(nèi)加入底物，通過(guò)酶催化底物發(fā)光或激發(fā)熒光量子點(diǎn)發(fā)光， 通過(guò)對(duì)光強(qiáng)的測(cè)定，達(dá)到對(duì)待測(cè)腦鈉肽樣品定量檢測(cè)的目的。 所述的反應(yīng)試劑的制備方法，其所述a)步中的腦鈉肽磁納米探針，其直徑為30 500nm，其中制備腦鈉肽磁納米探針的磁納米粒子表面修飾的活性基團(tuán)有羥基、羧基、氨基、 巰基、親和素中的任一種。 所述的反應(yīng)試劑的制備方法，其所述b)步中的腦鈉肽磁納米探針與標(biāo)記物標(biāo)記
的腦鈉肽特異性抗體，能識(shí)別腦鈉肽抗原的不同表位，并能同時(shí)與腦鈉肽抗原結(jié)合來(lái)進(jìn)行
腦鈉肽含量檢測(cè)。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于 本發(fā)明的光學(xué)生物傳感器和反應(yīng)試劑的制備方法與已經(jīng)商業(yè)化的系列便攜式光 子計(jì)數(shù)儀是兼容的，因此可以使檢測(cè)簡(jiǎn)單快捷；由于該傳感器的生產(chǎn)工藝采用先進(jìn)的MEMS 工藝，既保證了檢測(cè)的可靠性和靈敏度，又降低了檢測(cè)成本；該傳感器采用微溝道設(shè)計(jì)，使 進(jìn)樣更快，所需待測(cè)樣品溶液少(20iU)。采用本發(fā)明的腦鈉肽光學(xué)生物傳感器測(cè)定腦鈉肽 的靈敏度達(dá)到pg/mL。本發(fā)明提供的測(cè)定方法從檢測(cè)腦鈉肽樣品開(kāi)始，只需要20 30min， 可以得到檢測(cè)結(jié)果；本發(fā)明的光學(xué)生物傳感器操作步驟少，操作方便、簡(jiǎn)單，易于推廣。


圖1是本發(fā)明一種基于磁納米探針的腦鈉肽光學(xué)生物傳感器立體示意圖；
圖2是本發(fā)明一種基于磁納米探針的腦鈉肽光學(xué)生物傳感器三視圖；其中圖 2(a)是主視圖；圖2(b)是側(cè)視圖；圖2(C)是俯視圖；
圖3是本發(fā)明中磁納米探針制備示意圖； 圖4是本發(fā)明中待測(cè)抗原_熒光量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的磁納米探針復(fù)合物制備示意 圖。
具體實(shí)施例方式
見(jiàn)圖1、圖2，是本發(fā)明一種基于磁納米探針的腦鈉肽光學(xué)生物傳感器，其中，微型 電磁鐵1、7，進(jìn)樣孔2、8，絕緣封裝層3，硅質(zhì)基座4，塑料封裝層5，微型電磁鐵引線6，親水 納米材料層9，出樣孔10。圖2a為光學(xué)生物傳感器主視圖；圖2b為光學(xué)生物傳感器側(cè)視 圖；圖2c為光學(xué)生物傳感器俯視圖。 本發(fā)明的一種基于磁納米探針的腦鈉肽光學(xué)生物傳感器，包括基座4、反應(yīng)區(qū)、封
6裝層；其中，基座4上表面縱向設(shè)有弧形凹槽，凹槽上表面具有毛細(xì)作用的橫向微溝道，微 溝道長(zhǎng)為0. 3 4. 0cm，寬為0. 1 20mm，深度為0. 1 16mm。凹槽的兩端為塑料封裝層 5，端部塑料封裝層5為聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)中的一種。凹槽的頂部鍵 合透光性極好的耐腐蝕絕緣封裝層3，凹槽的底部有一出樣孔10，出樣孔10貫通基座4 ;絕 緣封裝層3上設(shè)有兩個(gè)進(jìn)樣孔2、8 ;凹槽、端部塑料封裝層5、頂部絕緣封裝層3圍成的空間 為傳感器的樣品反應(yīng)區(qū)；其樣品反應(yīng)區(qū)內(nèi)，橫向微溝道表面有一親水納米材料層9，親水納 米材料層9為高分子納米材料、硅烷、丙烯酸非磁性材料中的一種；反應(yīng)區(qū)外，在反應(yīng)區(qū)縱 軸上，與兩端塑料封裝層5相隔一間隙的各設(shè)置一微型電磁鐵1、7，兩微型電磁鐵1、7的引 出線6并聯(lián)； 使用時(shí)，反應(yīng)區(qū)內(nèi)加有反應(yīng)試劑。 本發(fā)明光學(xué)生物傳感器，在反應(yīng)區(qū)的橫向毛細(xì)溝道內(nèi)表面組裝一層親水納米材料 的方法是通過(guò)在橫向溝道內(nèi)表面均勻滴加不同濃度的親水性大分子高分子羧甲基纖維素 鈉，37t:溫度條件下干燥，獲得凸凹相間的親水納米表面層。該方法進(jìn)一步加強(qiáng)了溝道表面 的親水性，增大了溝道的有效表面積，不僅有利于反應(yīng)試劑的混合，而且可以有效保持鈉尿 肽(B-typenatriuretic p印tide， BNP)光學(xué)生物試劑的生物活性。 本發(fā)明的腦鈉肽光學(xué)生物傳感器相應(yīng)的反應(yīng)試劑包括偶聯(lián)緩沖液、清洗緩沖液、 封閉液、標(biāo)記物標(biāo)記的腦鈉肽抗體和底物發(fā)光液。
反應(yīng)試劑的制作是 首先將表面修飾有不同功能基團(tuán)的磁性納米粒子、腦鈉肽抗體或生物素標(biāo)記的腦
鈉肽抗體混合制備成溶液，37t:孵育一定時(shí)間使其發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)或通過(guò)生物素_親和素相
互作用，完成磁納米粒子與腦鈉肽抗體的偶聯(lián)，組成具有高特異性的腦鈉肽磁納米探針。
將腦鈉肽磁納米探針溶液、待測(cè)腦鈉肽樣品溶液與標(biāo)記物標(biāo)記的腦鈉肽特異性抗 體，通過(guò)電磁鐵控制磁粒子的運(yùn)動(dòng)使溶液混合均勻，置于37t:孵育20min。通過(guò)洗滌、磁分 離去掉多余的未參與反應(yīng)的標(biāo)記物標(biāo)記的腦鈉肽特異性抗體，加入底物催化發(fā)光或激發(fā)熒 光量子點(diǎn)發(fā)光，能產(chǎn)生與被分析物腦鈉肽的濃度對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)，從而達(dá)到對(duì)待測(cè)腦鈉肽定量 檢測(cè)的目的。 本發(fā)明的上述各目的、方法、特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)下面結(jié)合附圖和實(shí)施例可以得到更
加詳細(xì)的說(shuō)明。
實(shí)施例1 圖1、圖2 (a) 、 (b) 、 (c)是本發(fā)明設(shè)計(jì)的基于磁納米探針的腦鈉肽光學(xué)生物傳感器 示意圖。首先，采用微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)工藝在硅質(zhì)基座上刻蝕出一個(gè)長(zhǎng)為20mm，寬為5mm， 深度為4mm的微溝道，溝道的頂部鍵合透光性極好的玻璃(蓋片)3，玻璃(蓋片)3上有進(jìn) 樣孔2與進(jìn)樣孔8，硅質(zhì)基座4的底部有一與微溝道相通的出樣孔10。在反應(yīng)區(qū)的溝道內(nèi) 表面組裝一層高分子羧甲基纖維素(CMC)納米材料層9，置于37t:的干燥箱中干燥30min， 取出備用。 然后添加反應(yīng)試劑，從進(jìn)樣孔2滴加50 ii 1腦鈉肽磁納米探針溶液，從進(jìn)樣孔8滴 加20 iU腦鈉肽待測(cè)樣品溶液，接通電磁鐵7，該探針在電磁鐵7和毛細(xì)溝道的共同作用下， 向右移動(dòng)與待測(cè)腦鈉肽樣品溶液混合。然后從進(jìn)樣孔8加入60 ii 1辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記腦鈉 肽抗體溶液，通過(guò)控制左右兩電磁鐵1、7并在毛細(xì)溝道的共同作用下，來(lái)實(shí)現(xiàn)磁納米探針的移動(dòng)，從而達(dá)到混勻反應(yīng)物的目的。形成磁納米探針_待測(cè)物_酶標(biāo)抗體的磁納米探針 復(fù)合物后，在磁場(chǎng)作用下，用200 ii 1 PBS緩沖液(含0. 5% Tween-20 ;0. 1 0. 5% BSA)清 洗3次，清洗液從底部出樣孔10流出。然后加入50 化學(xué)發(fā)光液A(魯米諾與增強(qiáng)劑體 系)和50ia化學(xué)發(fā)光底物液B(雙氧水緩沖液)，混勻，置于暗處室溫放置5min。用實(shí)驗(yàn)
室自制光子計(jì)數(shù)儀測(cè)其發(fā)光強(qiáng)度，從而測(cè)出待測(cè)樣品溶液的濃度。
實(shí)施例2 1)腦鈉肽特異性探針的制備 取200 ill氨基末端磁納米粒子置于2ml離心管中，加入600 ii 10. 03mol/L吡啶溶 液，振蕩混勻。用磁力架磁性分離除去上清液，重復(fù)上述操作兩次。然后在離心管中加入 200 ill的10%戊二醛，置于37t:恒溫?fù)u床中220rpm振蕩反應(yīng)30min，使之混合均勻。磁 性分離，除去未反應(yīng)的戊二醛，最后用200 ii 1 Tris-HCl緩沖液(0. 05mol/L ;pH = 7. 10 9. 00)清洗三次。 將腦鈉肽抗體溶于PBS緩沖液中，配置濃度為0. 22 2. Omg/mL的抗體溶液。取 腦鈉肽抗體溶液400iU加入到200 iil上述處理過(guò)的磁納米粒子中，在37t:恒溫?fù)u床中 180rpm振蕩反應(yīng)6小時(shí)。置于磁力架，進(jìn)行磁性分離，加入1000 iU甘氨酸_氫氧化鈉緩 沖液(0. 05mol/L ;pH = 8. 6 10. 6)，將反應(yīng)物置于37。C恒溫?fù)u床中200rpm振蕩反應(yīng)1小 時(shí)，終止偶聯(lián)反應(yīng)，制備得到腦鈉肽特異性探針。將該磁納米探針溶于200 ii 1 PBS緩沖液 中。 2)被分析物腦鈉肽抗原濃度的測(cè)定 將磁納米探針50 ii 1、待測(cè)樣品溶液20 ii 1、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記腦鈉肽抗體溶液 80 iU按照實(shí)施例1的步驟加入到腦鈉肽光學(xué)生物傳感器中，通過(guò)電磁鐵控制磁粒子運(yùn)動(dòng) 將反應(yīng)試劑混勻，將該傳感器置于37t:恒溫箱中孵育30min，形成磁納米探針_待測(cè)物_酶 標(biāo)抗體的磁納米探針復(fù)合物。用200ii1 PBS緩沖液(含O. 5%Tween-20 ;0. l 0.5% BSA) 清洗3次，用電磁鐵7將探針復(fù)合物吸到傳感器右端，洗脫液從左端出樣孔10流出，關(guān)閉出 樣孔。 向上述磁納米探針_待測(cè)抗原_酶標(biāo)抗體的磁納米探針復(fù)合物中加入50 ii 1化學(xué) 發(fā)光液A(魯米諾與增強(qiáng)劑體系)和50iU化學(xué)發(fā)光底物液B(雙氧水緩沖液)混勻后，置 于暗處，室溫放置5min。用實(shí)驗(yàn)室自制光子計(jì)數(shù)儀測(cè)其發(fā)光強(qiáng)度。
實(shí)施例3 1)腦鈉肽特異性探針的制備 如圖3，用移液器移取200iU(相當(dāng)于lmg)表面標(biāo)記親和素的磁納米粒子，置于 2ml離心管中，加入1000 ii 1 Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含lmmol/LEDTA、lmol/L NaCl， pH = 7. 4)，輕搖混勻磁粒，磁性分離，清洗2次。用100 iU PBS緩沖液將上述磁粒子溶解。
將100 ii 1生物素標(biāo)記腦鈉肽抗體溶于800 ii 1Tris-HCl緩沖液中，此時(shí)抗體濃度 為0. 1875mg/mL。將上述抗體溶液加入經(jīng)過(guò)活化的磁粒中，置37°C 、 150rpm搖床中振蕩反 應(yīng)30min，磁性分離，除去上清液。在經(jīng)過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)的離心管中加入PBS緩沖液(含0. 05% Tween-20及0. 1 % BSA) lml，輕搖混勻，磁性分離，操作2次。 在上述離心管中加入lml封閉液(0. 5%雞卵清蛋白，pH = 7.4PBS緩沖液)，在 恒溫?fù)u床中37 °C 、 180rpm振蕩反應(yīng)30min，磁性分離。在離心管中加入PBS (含0. 05 %Tween-20及0. 1% BSA)緩沖液lml，輕搖混勻，磁性分離。抽除上清液，重復(fù)清洗3次。加 入PBS緩沖液配制成濃度為2. 5mg/mL磁納米探針溶液。
2)被分析物腦鈉肽抗原濃度的測(cè)定 取上述制備的腦鈉肽磁納米探針50 1、待測(cè)樣品溶液20 1、堿性磷酸酶標(biāo)記抗 體溶液80iU混勻，按照實(shí)施例1的步驟加入到腦鈉肽光學(xué)生物傳感器中，通過(guò)電磁鐵將反 應(yīng)試劑混勻，將該傳感器置于37t:恒溫箱中孵育30min，形成磁納米探針_待測(cè)物_酶標(biāo)抗 體的磁納米探針復(fù)合物。用200 ill PBS緩沖液(含0. 5% Tween-20 ;0. 1 0. 5% BSA)清 洗3次，用電磁鐵7將探針復(fù)合物吸到傳感器右端，洗脫液從左端出樣孔10流出，關(guān)閉出樣 孔。 向上述形成的磁納米探針-待測(cè)抗原-酶標(biāo)抗體的磁納米探針復(fù)合物中加入 50 1底物發(fā)光液1， 2 二氧環(huán)己烷衍生物(AMPPD)，混勻，置于暗處室溫放置15min。用實(shí)驗(yàn)
室自制光學(xué)傳感器測(cè)其發(fā)光強(qiáng)度。
實(shí)施例4 1)熒光量子點(diǎn)標(biāo)記腦鈉肽抗體制備 取表面修飾羧基的水溶性熒光量子點(diǎn)(QDs)，用PBS緩沖液(pH = 7. 4)將其稀釋 到lnmol/L，將EDC的PBS溶液加入到該QDs中，然后加入5. Omg/ml腦鈉肽的PBS溶液， 20。C反應(yīng)2小時(shí)，再加入200 ii 1 Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含lmmol/L EDTA、lmol/L NaCl， pH =7. 4)，輕搖混勻磁粒，終止反應(yīng)，透析30min，制備出熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的腦鈉肽抗體。
2)羧基修飾磁納米粒子制備腦鈉肽磁納米探針 取200 ii 1，濃度為10mg/ml的表面修飾羧基的磁納米粒子，加2mlPBS緩沖液進(jìn)行 洗滌，磁性分離，除去上清液，重復(fù)操作2次，加入lmlPBS緩沖液將該羧基修飾磁納米粒子 溶解備用。 在上述溶液中加入400 ii 1，濃度為0. 2mol/L的MES緩沖液，再加入600 ii 1，濃度 為5. Omg/mL的EDC溶液，將上述溶液混勻，在恒溫?fù)u床中37°C 、 180rpm振蕩反應(yīng)30min。
在上述溶液中加入腦鈉肽抗體溶液300 ii 1，在恒溫?fù)u床中37°C 、220rpm振蕩反應(yīng) 8小時(shí)。通過(guò)磁性分離去掉上層清液，再加入甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(0. 05mol/L ;pH = 9)進(jìn)行封閉。用PBS緩沖液對(duì)該偶聯(lián)復(fù)合物進(jìn)行洗滌后，加入PBS緩沖液將該復(fù)合物配制 成濃度為1. 3mg/ml的磁納米探針溶液。
3)被分析物腦鈉肽抗原濃度的測(cè)定 如圖4，取上述制備好的腦鈉肽磁納米探針50ia、待測(cè)樣品溶液20iil、熒光量 子點(diǎn)標(biāo)記抗體溶液80iU按照實(shí)施例1的步驟加入到腦鈉肽光學(xué)生物傳感器中，通過(guò)電磁 鐵將反應(yīng)試劑混勻，將該傳感器置于37t:恒溫箱中孵育30min，形成磁納米探針-待測(cè)抗 原-熒光量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的磁納米探針復(fù)合物。用200 ii 1 PBS緩沖液(含O. 5% Tween-20 ; 0. 1 0.5%BSA)清洗3次，用電磁鐵7將探針復(fù)合物吸到傳感器右端，洗脫液從出樣孔10 流出，關(guān)閉出樣孔。加入PBS緩沖液，形成磁納米探針_待測(cè)物_熒光量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的磁 納米探針復(fù)合物的PBS緩沖液。在激發(fā)光照射下，用實(shí)驗(yàn)室自制光學(xué)傳感器測(cè)其發(fā)射光強(qiáng)， 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腦鈉肽樣品溶液濃度的定量檢測(cè)。
9
權(quán)利要求
一種檢測(cè)腦鈉肽的光學(xué)生物傳感器，包括基座、反應(yīng)區(qū)、封裝層；其中，基座上表面設(shè)有縱向弧形凹槽，凹槽上表面是具有毛細(xì)作用的橫向微溝道，凹槽的兩端為塑料封裝層，凹槽的頂部鍵合透光性極好的耐腐蝕絕緣封裝層，凹槽的底部有一出樣孔，出樣孔貫通基座；絕緣封裝層上設(shè)有兩個(gè)進(jìn)樣孔；凹槽、端部塑料封裝層、頂部絕緣封裝層圍成的空間為傳感器的樣品反應(yīng)區(qū)；其特征在于樣品反應(yīng)區(qū)內(nèi)，橫向微溝道表面有一親水納米材料層；反應(yīng)區(qū)外，在反應(yīng)區(qū)縱軸上，與兩端塑料封裝層相隔一間隙各設(shè)置一微型電磁鐵，兩微型電磁鐵的引出線并聯(lián)；使用時(shí)，反應(yīng)區(qū)內(nèi)加有反應(yīng)試劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的光學(xué)生物傳感器，其特征在于所述親水納米材料層為高分子 納米材料、硅烷、丙烯酸非磁性材料中的一種，以獲取低磁化強(qiáng)度和高比表面積的微溝道， 該溝道不受磁場(chǎng)影響；端部塑料封裝層為聚乙烯，聚碳酸酯，聚丙烯中的一種，兩微型電磁 鐵通過(guò)兩端的塑料封裝層對(duì)反應(yīng)試劑中的磁納米探針進(jìn)行磁化和富集。
3. 如權(quán)利要求1所述的光學(xué)生物傳感器，其特征在于所述微溝道長(zhǎng)為0. 3 4. 0cm， 寬為0. 1 20mm，深度為0. 1 16mm ;微型電磁鐵尺寸為6mmX6mmX6. 4mm。
4. 如權(quán)利要求1所述的光學(xué)生物傳感器，其特征在于所述反應(yīng)試劑，包括腦鈉肽磁納 米探針、偶聯(lián)反應(yīng)組合試劑、緩沖液、封閉液、標(biāo)記物標(biāo)記的特異性抗體、底物顯色液。
5. 如權(quán)利要求4所述的光學(xué)生物傳感器，其特征在于所述偶聯(lián)反應(yīng)組合試劑，包括 1-乙基3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽；N-羥基硫代琥珀酰亞胺；戊二醛中的一種或多 種；其中，l-乙基3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽的濃度范圍為1.5 9. Omg/ml ;N-羥 基硫代琥珀酰亞胺的濃度范圍為3. 0 10. Omg/ml ;戊二醛的濃度范圍為5 30%。
6. 如權(quán)利要求4所述的光學(xué)生物傳感器，其特征在于所述緩沖液為甘氨酸-鹽酸緩 沖液、磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖液、磷酸氫二鈉_磷酸二氫鈉緩沖液、磷酸氫二鈉_磷酸二 氫鉀緩沖液、磷酸二氫鉀_氫氧化鈉緩沖液、Tris-HCl緩沖液、甘氨酸_氫氧化鈉緩沖液、 乙磺酸緩沖液中的任_種或幾種。
7. 如權(quán)利要求4所述的光學(xué)生物傳感器，其特征在于所述封閉液為1 10%的脫脂 奶粉，5 15%的賴(lài)氨酸，或1 15%的牛血清白蛋白中的一種或它們的混合物。
8. 如權(quán)利要求4所述的光學(xué)生物傳感器，其特征在于所述標(biāo)記物標(biāo)記的特異性抗體 為辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的腦鈉肽抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記的腦鈉肽抗體，熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的腦 鈉肽抗體，生物素標(biāo)記的腦鈉肽抗體中的一種；其中熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的腦鈉肽抗體中使用的熒光量子點(diǎn)是CdSe、 CdS、 ZnS、 InP、 InAs 及其核殼結(jié)構(gòu)中的一種或幾種。
9. 如權(quán)利要求4所述的光學(xué)生物傳感器，其特征在于所述底物顯色液為1，2 二氧環(huán) 己烷衍生物，或底物液A、B套液中的一種；套液中，底物液A為魯米諾與其增強(qiáng)劑體系，底物 液B為雙氧水緩沖液。
10. 如權(quán)利要求4所述的光學(xué)生物傳感器，其特征在于所述腦鈉肽磁納米探針的濃 度范圍0. 10 3. 00mg/ml ;緩沖液濃度范圍0. 03 3. Omo1/1 ;封閉液濃度范圍0. 03 2. OOmol/1 ;標(biāo)記物標(biāo)記的腦鈉肽特異性抗體濃度范圍0. 12 3. Omg/ml ;底物顯色液濃度 范圍0. 8 3. Ommol/L。
11. 如權(quán)利要求1所述的光學(xué)生物傳感器，其特征在于檢測(cè)系統(tǒng)采用光子計(jì)數(shù)法檢測(cè)，加入底物催化發(fā)光或激發(fā)熒光量子點(diǎn)發(fā)光。
12. —種如權(quán)利要求1所述的光學(xué)生物傳感器反應(yīng)試劑的制備方法，其特征在于包括 以下步驟a) 首先，在離心管中將1000iU、濃度為0. 5 3mg/ml的表面修飾有不同功能基團(tuán)的 磁納米粒子溶液、800 ii 1濃度為0. 1 0. 2mg/ml的腦鈉肽抗體溶液或濃度為0. 1 0. 2mg/ ml的牛物素標(biāo)記的腦鈉肽抗體溶液混合均勻，在37"C下孵育10 60min,使其發(fā)?？s合反 應(yīng)或通過(guò)生物素_親和素作用發(fā)生反應(yīng)，完成磁納米粒子與腦鈉肽抗體的偶聯(lián)，經(jīng)過(guò)洗滌、 沉淀、磁分離后得到具有高特異性的腦鈉肽磁納米探針；b) 對(duì)50 iil腦鈉肽磁納米探針溶液活化后從進(jìn)樣孔2加入光學(xué)生物傳感器；80 ill腦 鈉肽待測(cè)樣品從進(jìn)樣孔8加入光學(xué)生物傳感器，通過(guò)控制電磁鐵來(lái)實(shí)現(xiàn)磁納米粒子的運(yùn) 動(dòng)，將兩者混勻，然后從進(jìn)樣孔2加入20 iU標(biāo)記物標(biāo)記的腦鈉肽特異性抗體溶液，通過(guò)磁 粒子的運(yùn)動(dòng)來(lái)混勻溶液，放在溫度為35 37t:的恒溫箱中放置20 30min。c) 通過(guò)磁分離，用PBS洗滌去掉多余的未參與反應(yīng)的標(biāo)記物標(biāo)記的腦鈉肽特異性抗體 溶液，洗滌液從出樣孔10流出；d) 向光學(xué)生物傳感器內(nèi)加入底物，通過(guò)酶催化底物發(fā)光或激發(fā)熒光量子點(diǎn)發(fā)光，通過(guò) 對(duì)光強(qiáng)的測(cè)定，達(dá)到對(duì)待測(cè)腦鈉肽樣品定量檢測(cè)的目的。
13. 如權(quán)利要求12所述的試劑的制備方法，其特征在于所述a)步中的腦鈉肽磁納米 探針，其直徑為30 500nm，其中制備腦鈉肽磁納米探針的磁納米粒子表面修飾的活性基 團(tuán)有羥基、羧基、氨基、巰基、親和素中的任一種。
14. 如權(quán)利要求12所述的試劑的制備方法，其特征在于所述b)步中的腦鈉肽磁納米 探針與標(biāo)記物標(biāo)記的腦鈉肽特異性抗體，能識(shí)別腦鈉肽抗原的不同表位，并能同時(shí)與腦鈉 肽抗原結(jié)合來(lái)進(jìn)行腦鈉肽含量檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明一種檢測(cè)腦鈉肽的光學(xué)生物傳感器及試劑制備方法，涉及生物傳感技術(shù)，該傳感器反應(yīng)區(qū)為充有磁納米探針溶液的毛細(xì)溝道，溝道內(nèi)表面組裝一層親水納米材料，溝道上表面為帶有進(jìn)樣孔的透光絕緣封裝層，溝道側(cè)面封裝塑料，在側(cè)封塑料的兩端安裝有可控電磁鐵。其試劑制備方法，是先制備磁納米探針，然后將磁納米探針、待測(cè)腦鈉肽樣品、標(biāo)記物標(biāo)記的特異性腦鈉肽抗體通過(guò)電磁鐵和毛細(xì)溝道的共同作用充分反應(yīng)，形成磁納米探針-待測(cè)腦鈉肽抗原-標(biāo)記抗體的復(fù)合物。加入底物催化發(fā)光或激發(fā)熒光量子點(diǎn)發(fā)光。通過(guò)傳感器檢測(cè)系統(tǒng)，快速檢測(cè)出腦鈉肽濃度。本發(fā)明傳感器可快速檢測(cè)樣品中腦鈉肽濃度，具有特異性高、靈敏度高、節(jié)省大量生物試劑等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101793899SQ200910077950
公開(kāi)日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日
發(fā)明者劉儒平, 劉軍濤, 劉春秀, 王蜜霞, 羅金平, 蔡新霞 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院電子學(xué)研究所