專利名稱：：編碼IgE信號(hào)肽和/或IL－15的核酸序列與包含IgE信號(hào)肽和/或IL－15的組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及改良疫苗、用于針對(duì)免疫原的預(yù)防性和/或治療性免疫個(gè)體的改進(jìn)方法，并且涉及改進(jìn)的免疫治療組合物和改進(jìn)的免疫治療方法。
背景技術(shù)：
：免疫治療涉及調(diào)節(jié)個(gè)體免疫應(yīng)答，以達(dá)到所需的治療效果。免疫治療藥涉及這樣的組合物當(dāng)給予個(gè)體時(shí)，能調(diào)節(jié)個(gè)體的免疫系統(tǒng)，最終減少與不想要的免疫應(yīng)答相關(guān)的癥狀，或者最終通過(guò)增加所需免疫應(yīng)答而緩解癥狀。在某些情況下，免疫治療是接種方案的組成部分，其中將疫苗給予個(gè)體，使個(gè)體暴露給免疫原，個(gè)體將產(chǎn)生抗該免疫原的免疫應(yīng)答。在這樣的情況下，免疫治療藥增加免疫應(yīng)答和/或選擇性加強(qiáng)免疫應(yīng)答部分(例如細(xì)胞免疫或體液免疫)，這是治療或預(yù)防特定病癥、感染或疾病所需要的。疫苗用于使個(gè)體產(chǎn)生抗靶抗原的免疫，所述靶抗原例如變應(yīng)原、病原體抗原或涉及人類疾病的細(xì)胞相關(guān)抗原。涉及人類疾病的細(xì)胞相關(guān)抗原包括癌相關(guān)腫瘤抗原和涉及自身免疫性疾病的細(xì)胞相關(guān)抗原。在設(shè)計(jì)這樣的疫苗中，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，在接種個(gè)體細(xì)胞中產(chǎn)生靶抗原的疫苗能有效誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫。具體地講，減毒活疫苗、使用無(wú)毒載體的重組疫苗和DNA疫苗各自在接種個(gè)體細(xì)胞中引起抗原的產(chǎn)生，結(jié)果誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫。另一方面，死疫苗即滅活疫苗以及僅包含蛋白的亞單位疫苗不能誘導(dǎo)良好的細(xì)胞免疫應(yīng)答，盡管它們能誘導(dǎo)體液應(yīng)答。細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)于提供抗病原體感染的保護(hù)性以及提供治療病原體感染、癌癥或自身免疫性疾病的有效的免疫介導(dǎo)療法來(lái)說(shuō)，通常是必需的。因此，在接種個(gè)體細(xì)胞中產(chǎn)生靶抗原的疫苗(例如減毒活疫苗、使用無(wú)毒載體的重組疫苗和DNA疫苗)通常是優(yōu)選的。盡管這類疫苗通常能使個(gè)體有效產(chǎn)生針對(duì)病原體感染或人類疾病的預(yù)防性或治療性免疫，但是需要改良疫苗。需要產(chǎn)生增強(qiáng)免疫應(yīng)答的組合物和方法。同樣，盡管某些免疫治療藥可用于調(diào)節(jié)患者的免疫應(yīng)答，但是仍需要改進(jìn)的免疫治療組合物和方法?；蛑委熒婕皩⒒騻鬟f給有需要的個(gè)體，或者能從所述基因編碼的蛋白獲益的個(gè)體。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出各種策略，以傳遞蛋白，因?yàn)閭€(gè)體沒(méi)有產(chǎn)生足夠和/或完整功能蛋白的相應(yīng)基因。因此，基因治療能補(bǔ)償所缺失的足夠的完整功能性內(nèi)源蛋白。在某些基因治療策略中，使用設(shè)計(jì)用來(lái)產(chǎn)生治療有效量蛋白的構(gòu)建體，給患者提供治療有效的蛋白。基因治療提供一種用于傳遞蛋白治療藥的替代方法。仍需要改進(jìn)的基因治療組合物和方法。除了直接將核酸分子給予個(gè)體之外，經(jīng)常還可給予蛋白。由重組方法產(chǎn)生的這類蛋白通常是制備它們的最有效方式。仍然需要改進(jìn)的生產(chǎn)蛋白的組合物和方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及含核酸分子的重組疫苗和使個(gè)體產(chǎn)生抗免疫原免疫的方法，所述核酸分子包含編碼免疫原的核酸序列和編碼融合蛋白的核酸序列以及任選編碼CD40L的核酸序列，所述融合蛋白包含與IL-15蛋白序列連接的非IL-15信號(hào)序列；所述方法包括給予個(gè)體所述重組疫苗。本發(fā)明涉及包含核酸分子的減毒活病原體和使個(gè)體產(chǎn)生抗病原體免疫的方法，所述核酸分子包含編碼融合蛋白的核酸序列以及任選編碼CD40L的核酸序列，所述融合蛋白包含與IL-15蛋白序列連接的非IL-15信號(hào)序列；所述方法包括給予個(gè)體所述減毒活病原體。本發(fā)明涉及分離的核酸分子，所述核酸分子包含編碼IL-15蛋白的核酸序列和編碼CD40L蛋白的核酸序列以及任選編碼免疫原的核酸序列。本發(fā)明涉及包含這樣的核酸分子的組合物含有編碼IL-15蛋白的核酸序列的核酸分子和含有編碼CD40L蛋白的核酸序列的核酸分子，以及任選在以上一種或兩種核酸分子上含有編碼免疫原的核酸序列。本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)個(gè)體免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予個(gè)體包含一種或多種核酸分子的組合物，其包含編碼IL-15蛋白的核酸序列和編碼CD40L的核酸序列。編碼各種不同蛋白的不同核酸序列可以在同一核酸分子和/或不同核酸分子上，或者兩者皆有。本發(fā)明涉及誘導(dǎo)個(gè)體產(chǎn)生抗免疫原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予個(gè)體包含一種或多種核酸分子的組合物，所述核酸分子包含編碼IL-15蛋白的核酸序列、編碼免疫原的核酸序列和編碼CD40L的核酸序列。編碼各種不同蛋白的不同核酸序列可以在同一核酸分子和/或不同核酸分子或者其組合上。本發(fā)明涉及含核酸分子的重組疫苗和使個(gè)體產(chǎn)生抗免疫原免疫的方法，所述核酸分子包含編碼免疫原的核酸序列、編碼IL-15蛋白的核酸序列和編碼CD40L的核酸序列；所述方法包括給予個(gè)體所述重組疫苗。本發(fā)明涉及包含核酸分子的減毒活病原體和使個(gè)體產(chǎn)生抗病原體免疫的方法，所述核酸分子包含編碼IL-15蛋白的核酸序列和編碼CD40L的核酸序列；所述方法包括給予個(gè)體所述減毒活病原體。本發(fā)明涉及核酸分子，其包含編碼融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白由與非IgE蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽組成，其中所述IgE信號(hào)肽和所述非IgE蛋白序列來(lái)源于相同物種的動(dòng)物。本發(fā)明涉及宿主細(xì)胞體外培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物包含在所述宿主細(xì)胞中可操作的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含編碼由與非IgE蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽組成的融合蛋白的核酸序列；涉及所述核酸分子；和涉及包含所述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明涉及核酸分子，所述核酸分子包含與表達(dá)所需調(diào)節(jié)元件操作性連接且編碼融合蛋白的核酸序列，以及與表達(dá)所需調(diào)節(jié)元件操作性連接且編碼免疫原的核酸序列；所述融合蛋白包含與非IgE蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽。本發(fā)明涉及組合物，所述組合物包含這樣的核酸分子含有編碼融合蛋白的核酸序列的核酸分子和含有編碼免疫原的核酸序列的核酸分子，其中含有編碼融合蛋白的核酸序列的核酸分子與含有編碼免疫原的核酸序列的核酸分子完全不同，所述融合蛋白包含與非IEg蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽。本發(fā)明涉及分離的融合蛋白，所述融合蛋白包含與非IgE蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽。本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)個(gè)體免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予個(gè)體組合物，所述組合物包含這樣的核酸分子含有編碼融合蛋白的核酸序列的核酸分子，所述融合蛋白包含與免疫調(diào)節(jié)蛋白連接的IgE信號(hào)肽。本發(fā)明涉及誘導(dǎo)個(gè)體產(chǎn)生抗免疫原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予個(gè)體核酸分子，所述核酸分子含有編碼融合蛋白的核酸序列和含有編碼免疫原的核酸序列；所述融合蛋白包含與免疫調(diào)節(jié)蛋白連接的IgE信號(hào)肽。編碼不同蛋白的不同核酸序列可以在同一核酸分子和/或不同核酸分子上。本發(fā)明涉及含核酸分子的重組疫苗和使個(gè)體產(chǎn)生抗免疫原免疫的方法，所述核酸分子包含編碼免疫原的核酸序列和編碼融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包含與免疫調(diào)節(jié)蛋白連接的IgE信號(hào)序列；所述方法包括給予個(gè)體所述重組疫苗。本發(fā)明涉及包含核酸分子的減毒活病原體和使個(gè)體產(chǎn)生抗病原體免疫的方法，所述核酸分子包含編碼融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包含與免疫調(diào)節(jié)蛋白連接的IgE信號(hào)序列；所述方法包括給予個(gè)體所述減毒活病原體。本發(fā)明涉及核酸分子、載體和宿主細(xì)胞，所述核酸分子包含編碼融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包含與IL-15蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽；所述載體包含所述核酸分子；所述宿主細(xì)胞包含所述載體。本發(fā)明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包含與IL-15蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽。本發(fā)明涉及組合物，所述組合物包含這樣的核酸分子含有編碼融合蛋白的核酸序列的核酸分子和含有編碼免疫原的核酸序列的核酸分子；所述融合蛋白包含與IL-15蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽。任選編碼CD40L的核酸序列可存在于包含編碼融合蛋白和/或免疫原的核酸序列的核酸分子上或存在于各自的核酸分子上。本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)個(gè)體免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予個(gè)體包含一種或多種核酸分子的組合物，其包含編碼融合蛋白的核酸序列，并任選包含編碼CD40L的核酸序列，所述融合蛋白包含與IL-15蛋白連接的IgE信號(hào)肽。編碼各種不同蛋白的不同核酸序列可以在同一核酸分子和/或不同核酸分子上，或者兩者皆有。本發(fā)明涉及誘導(dǎo)個(gè)體產(chǎn)生抗免疫原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予個(gè)體包含一種或多種核酸分子的組合物，所述核酸分子包含編碼融合蛋白的核酸序列、編碼免疫原的核酸序列和任選編碼CD40L的核酸序列；所述融合蛋白包含與IL-15蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽。編碼各種不同蛋白的不同核酸序列可以在同一核酸分子和/或不同核酸分子或者其組合上。附圖簡(jiǎn)述圖1描繪來(lái)自實(shí)施例1的數(shù)據(jù)，顯示IL-15和抗CD3單克隆抗體刺激人PBMC后，產(chǎn)生IFN-γ。PBMC得自接受三聯(lián)療法(HAART)的HIV-1慢性感染者。所有供體的病毒量都低于500拷貝/ml，他們的CD4計(jì)數(shù)高于500細(xì)胞/ml。為了確定IL-15增加IFN-γ產(chǎn)生是否可作為效應(yīng)子功能的指標(biāo)，將細(xì)胞用IL-15和抗CD3刺激，然后用標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法(ELIspotassay)進(jìn)行分析。圖2描繪來(lái)自實(shí)施例1的數(shù)據(jù)，顯示用IL-15和抗CD3單克隆抗體刺激人PBMC后，IFN-γ的產(chǎn)生主要是由CD8介導(dǎo)的。如圖1所示，來(lái)自接受三聯(lián)療法(HAART)的HIV-1慢性感染者的PBMC已耗盡了CD4或CD8T細(xì)胞，然后用IL-15和抗CD3進(jìn)行刺激，再用標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法進(jìn)行分析。圖3A、3B、3C和3D描繪來(lái)自實(shí)施例1的數(shù)據(jù)，顯示用HIV-1肽和IL-15刺激人PBMC后，產(chǎn)生抗原特異性IFN-γ。對(duì)來(lái)自接受三聯(lián)療法(HAART)的HIV-1慢性感染者的PBMC，在標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法中分析其響應(yīng)25ng/mlIL-15(圖3A和圖3C)和響應(yīng)HIV-1Gag肽與IL-15聯(lián)用(圖3B和圖3C)而分泌IFN-γ的能力。CD8已耗盡，用HIV-1肽和IL-5刺激后，評(píng)價(jià)IFN-γ的產(chǎn)生(圖3D)。圖4A、圖4B和圖4C描繪來(lái)自實(shí)施例1的數(shù)據(jù)，顯示在用HIV-1DNA疫苗和IL-15免疫后，HIV-1抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。在第0周和第2周，給Balb/c小鼠共注射50μgpCenv或pCgag以及50μgpIL-15和IL-15表達(dá)質(zhì)粒。最后免疫后2周，收獲脾細(xì)胞。在圖4A中，通標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測(cè)定法，測(cè)定脾細(xì)胞的抗HIV-1包膜和重組痘苗病毒感染的P815細(xì)胞的CTL活性。在圖4B中，對(duì)HIV-1抗原特異性趨化因子的分泌水平進(jìn)行分析。脾細(xì)胞用HIV-1env重組痘苗病毒感染的P815細(xì)胞進(jìn)行刺激。在第3天，收獲上清液，測(cè)定MIP-1β的分泌。在圖4C中，對(duì)抗原特異性IFN-γ分泌水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。將脾細(xì)胞重懸浮，濃度為5×106細(xì)胞/ml。將100μl等分試樣加入到96孔平底微量滴定板的各孔中。將重組p24蛋白加入到各孔中，一式三份，得到終濃度5μg/ml和1μg/ml。將細(xì)胞于37℃/5％CO2孵育3天，收獲上清液。用市售ELISA試劑盒，測(cè)定所分泌的細(xì)胞因子水平。圖5A和圖5B描繪來(lái)自實(shí)施例1的數(shù)據(jù)，顯示Th1細(xì)胞因子的胞內(nèi)染色。小鼠接受兩次注射單獨(dú)的pCgag或者pCgag加上pIL-15DNA質(zhì)粒。一周后，收獲脾細(xì)胞，在含有p55肽合并液(含127種15聚體，其跨越HIV-1p55，具有11個(gè)氨基酸的重疊)和布雷菲德菌素A的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)5小時(shí)。刺激后，細(xì)胞用抗小鼠CD3抗體和抗小鼠CD8抗體進(jìn)行胞外染色，然后用抗小鼠進(jìn)行胞內(nèi)染色。顯示CD3+/CD8+淋巴細(xì)胞的應(yīng)答。圖5A顯示IFN-γ的數(shù)據(jù)。圖5B顯示腫瘤壞死因子-α的數(shù)據(jù)。斑點(diǎn)印跡顯示CD3+/CD8+淋巴細(xì)胞的應(yīng)答。圖6描繪來(lái)自實(shí)施例1鼠T輔助細(xì)胞增殖測(cè)定的數(shù)據(jù)。在第0周和第2周，給Balb/c小鼠共注射50μgpCgag或pCenv和50μg質(zhì)粒，所述質(zhì)粒表達(dá)IL-2R依賴性Th1細(xì)胞因子IL-2或IL-15的cDNA。將含5×105細(xì)胞的100μl等分試樣立即加入到96孔平底微量滴定板的各孔中。將重組p24蛋白加入到各孔中，一式三份，得到終濃度5μg/ml和1μg/ml。測(cè)定刺激指數(shù)。自發(fā)計(jì)數(shù)孔中包含10％胎牛血清，起到無(wú)關(guān)蛋白對(duì)照作用。同樣，pCgag或?qū)φ胀ǔａ槍?duì)無(wú)關(guān)gp120蛋白來(lái)說(shuō)，SI為1。為了確保細(xì)胞健康，采用PHA或ConA(Sigma)作為多克隆刺激物陽(yáng)性對(duì)照。圖7描繪來(lái)自實(shí)施例1的數(shù)據(jù)，即用DNA疫苗pCgag免疫Balb/c小鼠后，Gag的表位作圖。在第0周和第2周，給Balb/c小鼠共注射50μgpCgag和50μgpIL-15質(zhì)?；虮磉_(dá)基因IL-15的載體骨架或載體骨架。分離脾細(xì)胞，在標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法中用一系列肽進(jìn)行編排。肽混合成一系列22種合并液的矩陣形式，測(cè)定其激活細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力。圖8A、圖8B和圖8C描繪來(lái)自實(shí)施例1的數(shù)據(jù)，顯示在對(duì)來(lái)自CD4敲除小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行刺激后，產(chǎn)生IFN-γ。圖8A，在第0周和第2周，給Balb/c小鼠共注射50μgpCgag和50μgpIL-15即IL-15表達(dá)質(zhì)粒。在最后一次免疫后兩周，收獲脾細(xì)胞，采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法，測(cè)定產(chǎn)生的HIV-1特異性IFN-γ。圖8B，Cd4tmlKmv小鼠用pCgag、用和不用pIL-15進(jìn)行免疫。圖8C，Cd4tmlKmv小鼠用pCgag以及pIL-15、pCD40L或這兩者進(jìn)行免疫。在最后一次免疫后兩周，收獲脾細(xì)胞，在用HIV-1Gag肽進(jìn)行體外刺激后，采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法，測(cè)定產(chǎn)生的HIV-1Gag特異性IFN-γ。圖9描繪來(lái)自實(shí)施例2的數(shù)據(jù)，顯示IL-15和CD40L在疫苗部位的局部產(chǎn)生，可以取代對(duì)T細(xì)胞輔助的需要，供CD8效應(yīng)T細(xì)胞擴(kuò)增用。圖10、圖11、圖12A-C、圖13A-B、圖14和圖15涉及實(shí)施例3中記載的內(nèi)容。圖16涉及實(shí)施例4中記載的內(nèi)容。優(yōu)選實(shí)施方案的詳述定義本文所用的術(shù)語(yǔ)“靶蛋白”是指本發(fā)明基因構(gòu)建體所編碼的肽和蛋白，其作為免疫應(yīng)答的靶蛋白。術(shù)語(yǔ)“靶蛋白”和“免疫原”可互換使用，是指可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的蛋白。靶蛋白是免疫原性蛋白，其與病原體蛋白或不需要的細(xì)胞類型(例如癌細(xì)胞或涉及自身免疫性疾病的細(xì)胞)的蛋白共享至少一個(gè)表位，希望產(chǎn)生抗這些蛋白的免疫應(yīng)答。針對(duì)靶蛋白的免疫應(yīng)答將會(huì)保護(hù)個(gè)體，預(yù)防和/或治療個(gè)體與所述靶蛋白相關(guān)的特異性感染或疾病。本文所用的術(shù)語(yǔ)“基因構(gòu)建體”是指DNA或RNA分子，其包含編碼靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列。編碼序列包括與調(diào)節(jié)元件操作性連接的起始信號(hào)和終止信號(hào)，所述調(diào)節(jié)元件包括在接受所述核酸分子的個(gè)體細(xì)胞中能指導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“可表達(dá)形式”是指含有與編碼靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白的編碼序列操作性連接的必要調(diào)節(jié)元件的基因構(gòu)建體，使得當(dāng)存在于個(gè)體細(xì)胞中時(shí)，可以表達(dá)編碼序列。本文所用的術(shù)語(yǔ)“共享表位”是指，蛋白包含至少一個(gè)與另一蛋白表位相同或基本類似的表位。本文所用的術(shù)語(yǔ)“基本類似的表位”是指具有與蛋白表位不同的結(jié)構(gòu)、但仍能誘導(dǎo)細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答的表位，其與所述蛋白有交叉反應(yīng)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“胞內(nèi)病原體”是指這樣的病毒或病原生物其復(fù)制或生命周期的至少一部分是在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行、因而產(chǎn)生病原體蛋白或引起病原體蛋白的產(chǎn)生。本文所用的術(shù)語(yǔ)“過(guò)度增殖性疾病”是指特征為細(xì)胞過(guò)度增殖的疾病和障礙。本文所用的術(shù)語(yǔ)“過(guò)度增殖相關(guān)蛋白”是指與過(guò)度增殖性疾病相關(guān)的蛋白。本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫調(diào)節(jié)蛋白”是指調(diào)節(jié)個(gè)體免疫系統(tǒng)的蛋白，所述個(gè)體已接受免疫調(diào)節(jié)蛋白。免疫調(diào)節(jié)蛋白的實(shí)例包括IL-15、CD40L、TRAIL；TRAILrecDRC5、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANKLIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、F461811或MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、CD30、CD153(CD30L)、Fos、c-jun、Sp-1、Ap1、Ap-2、p38、p65Re1、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、NIK、SAPK、SAP1、JNK2、JNK1B2、JNK1B1、JNK2B2、JNK2B1、JNK1A2、JNK2A1、JNK3A1、JNK3A2、NF-κ-B2、p49剪接形式、NF-κ-B2、p100剪接形式、NF-κ-B2、p105剪接形式、NF-κ-B50K鏈前體、NFκBp50、人IL-1α、人IL-2、人IL-4、鼠IL-4、人IL-5、人IL-10、人IL-15、人IL-18、人TNF-α、人TNF-β、人白介素12、MadCAM-1、NGFIL-7、VEGF、TNF-R、Fas、CD40L、IL-4、CSF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、LFA-3、ICAM-3、ICAM-2、ICAM-1、PECAM、P150.95、Mac-1、LFA-1、CD34、RANTES、IL-8、MIP-la、E-selecton、CD2、MCP-1、L-selecton、P-selecton、FLT、Apo-1、Fas、TNFR-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4(TRAIL)、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、ICE、VLA-1和CD86(B7.2)。概述本發(fā)明來(lái)自以下發(fā)現(xiàn)。1)當(dāng)IL-15信號(hào)肽不存在時(shí)，IL-15蛋白表達(dá)水平更高，無(wú)論所表達(dá)的IL-15蛋白是“截短”的IL-15蛋白，還是含有與非IL-15信號(hào)肽(特別是IgE信號(hào)肽)連接的IL-15蛋白序列的融合蛋白。缺乏IL-15信號(hào)肽的IL-15蛋白，無(wú)論是“截短”的IL-15蛋白還是含有與非IL-15信號(hào)肽(特別是IgE信號(hào)肽)連接的IL-15蛋白序列的融合蛋白，在用于傳遞IL-15蛋白作為免疫調(diào)節(jié)蛋白的疫苗和構(gòu)建體中，都特別有用。2)涉及IL-15和CD40L傳遞的疫苗和免疫調(diào)節(jié)組合物特別有用。3)包含IgE信號(hào)肽的融合蛋白有助于增強(qiáng)表達(dá)，在蛋白的產(chǎn)生、疫苗和基因治療藥中是特別有用的，例如用于傳遞蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)蛋白)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供載體、疫苗和免疫調(diào)節(jié)組合物和方法，其中包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼以下蛋白的核苷酸序列包含缺乏IL-15信號(hào)肽(優(yōu)選缺乏IL-15Kozak區(qū)和非翻譯區(qū))的人IL-15編碼序列的蛋白；或提供具有非IL-15信號(hào)肽(優(yōu)選IgE信號(hào)序列)的人IL-15編碼序列的融合蛋白。IL-15編碼序列優(yōu)選缺乏IL-15信號(hào)序列，及優(yōu)選缺乏IL-15Kozak區(qū)和非翻譯區(qū)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供載體、疫苗和免疫調(diào)節(jié)組合物和方法，其中包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼以下蛋白的核苷酸序列1)IL-15蛋白，例如缺乏IL-15信號(hào)肽的IL-15蛋白，或包含與非IL-15信號(hào)肽(例如IgE信號(hào)肽)連接的IL-15蛋白序列的融合蛋白；2)編碼人CD40L的核苷酸序列。IL-15編碼序列優(yōu)選缺乏IL-15信號(hào)序列，和優(yōu)選缺乏IL-15Kozak區(qū)和非翻譯區(qū)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供載體、疫苗和免疫調(diào)節(jié)組合物和方法，其中包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼IgE信號(hào)肽與非IgE蛋白序列(優(yōu)選人IL-15蛋白序列)連接的融合蛋白的核苷酸序列。包含與非IgE蛋白連接的IgE信號(hào)序列的融合蛋白和編碼與非IgE蛋白連接的IgE信號(hào)序列的基因構(gòu)建體因此，本發(fā)明的一個(gè)總的方面涉及包含與非IgE蛋白連接的IgE信號(hào)序列的融合蛋白和編碼與非IgE蛋白連接的IgE信號(hào)序列的基因構(gòu)建體，以及所述構(gòu)建體在表達(dá)載體、疫苗和免疫調(diào)節(jié)組合物中的用途。關(guān)于這一方面，提供幾個(gè)不同的實(shí)施方案和形式。根據(jù)一些實(shí)施方案，提供包含分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子包含編碼與非IgE蛋白序列操作性連接的IgE信號(hào)序列的融合蛋白的核酸序列。非IgE蛋白的特性取決于構(gòu)建體的預(yù)定用途。例如，對(duì)于基因治療實(shí)施方案來(lái)說(shuō)，蛋白序列將是這樣的所需蛋白，例如患者所缺乏的足量功能性或完整功能性蛋白。這類所需蛋白的實(shí)例包括酶，例如DNA酶、生長(zhǎng)因子(例如生長(zhǎng)激素(人、牛、豬)、凝血因子、胰島素、肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白等。所需蛋白也可是這樣的蛋白當(dāng)在患者體內(nèi)表達(dá)時(shí)，能提供治療性益處的蛋白，例如紅細(xì)胞生成素、IL-2、GM-CSF、TPA等。在一些實(shí)施方案中，非IgE蛋白序列是免疫原。所述構(gòu)建體可用于疫苗，其中可提供免疫原的表達(dá)，作為免疫應(yīng)答的目標(biāo)。在一些實(shí)施方案中，非IgE蛋白序列是免疫調(diào)節(jié)蛋白。所述構(gòu)建體可用于疫苗以及免疫調(diào)節(jié)組合物，所述疫苗可提供免疫原的表達(dá)，作為免疫應(yīng)答的目標(biāo)，而所述免疫調(diào)節(jié)組合物所需的效果是按照所治療患者的病癥上調(diào)或下調(diào)患者的免疫系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)的具體方面。上調(diào)免疫系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)劑可用于治療罹患例如免疫抑制或傳染性疾病的患者，而下調(diào)免疫系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)劑可用于治療例如自身免疫性疾病、接受器官移植、組織移植的患者或接受細(xì)胞治療的患者，對(duì)于他們來(lái)說(shuō)，免疫抑制是必要的。在一些實(shí)施方案中，IgE信號(hào)序列與非IgE蛋白序列連接，用于在一個(gè)需要產(chǎn)生IgE蛋白的系統(tǒng)中使用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，IgE信號(hào)肽與其上連接的蛋白序列是來(lái)源于相同物種的動(dòng)物。在優(yōu)選的方法中，接受所述構(gòu)建體的動(dòng)物與IgE信號(hào)肽和蛋白序列的來(lái)源動(dòng)物是相同的物種。所述融合蛋白將被認(rèn)為是非免疫原性的。在一些實(shí)施方案中，包含與作為免疫調(diào)節(jié)蛋白的非IgE蛋白序列連接的IgE信號(hào)的編碼序列的構(gòu)建體的組合物，也可包含在同一核酸分子上或不同核酸分子上，即編碼免疫原的核酸序列上。通常，下述免疫原可以是任何免疫原性蛋白，包括變應(yīng)原、病原體抗原、癌相關(guān)抗原或涉及自身免疫性疾病的細(xì)胞相關(guān)抗原。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫原是病原體抗原，最優(yōu)選的病原體選自HIV、HSV、HCV和WNV。如上所述，非IgE蛋白序列優(yōu)選為IL-15蛋白，更優(yōu)選為缺乏IL-15信號(hào)序列的IL-15蛋白，還更優(yōu)選為缺乏IL-15信號(hào)序列、缺乏IL-15Kozak區(qū)和缺乏IL-15非翻譯序列的IL-15蛋白。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物還包括編碼CD40L的核苷酸序列。該核苷酸序列可包含在同一核酸分子上(作為融合蛋白)或不同的分子上。CD40L可包含在含免疫原編碼序列的疫苗組合物中，得到改良疫苗。在其它實(shí)施方案中，CD40L可包含在不含免疫原編碼序列的免疫調(diào)節(jié)組合物中，得到改良的免疫調(diào)節(jié)組合物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子摻入到病毒載體中，所述病毒載體例如痘苗病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒，或其它任何可接受的病毒載體，用作疫苗或基因治療載體。包含與作為免疫調(diào)節(jié)蛋白的非IgE蛋白序列連接的IgE信號(hào)序列的基因構(gòu)建體可直接摻入到本發(fā)明某些方面的減毒活病原體中。下面列出這些用作疫苗的病原體的實(shí)例。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)蛋白是IL-15，更優(yōu)選缺乏IL-15信號(hào)序列的IL-15蛋白，還更優(yōu)選缺乏IL-15信號(hào)序列、缺乏IL-15Kozak區(qū)和缺乏IL-15非翻譯序列的IL-15蛋白。在一些實(shí)施方案中，還提供攜帶編碼CD40L的核苷酸序列的減毒病原體。包含與非IgE蛋白序列操作性連接的IgE信號(hào)序列的融合蛋白也是本發(fā)明的一個(gè)方面。在一些實(shí)施方案中，融合蛋白的非IgE蛋白序列部分是酶。在一些實(shí)施方案中，融合蛋白的非IgE蛋白序列部分是免疫原。在一些實(shí)施方案中，融合蛋白的非IgE蛋白序列部分是免疫調(diào)節(jié)蛋白。優(yōu)選的非IgE蛋白序列是IL-15蛋白，最優(yōu)選缺乏IL-15信號(hào)序列。包含與IL-15蛋白連接的非IL-15信號(hào)序列的融合蛋白和編碼與IL-15蛋白連接的非IL-15信號(hào)序列的基因構(gòu)建體本發(fā)明的另一個(gè)總的方面涉及包含與IL-15蛋白連接的非IL-15信號(hào)序列的融合蛋白和編碼與IL-15蛋白連接的非IL-15信號(hào)序列的基因構(gòu)建體，以及所述構(gòu)建體在疫苗和免疫調(diào)節(jié)組合物中的用途。關(guān)于這一方面，提供幾個(gè)不同的實(shí)施方案和形式。通常，IL-15是指人IL-15。然而，構(gòu)建體也可指來(lái)自狗、貓、馬、牛、豬或羊等其它物種的IL-15。本發(fā)明的該方面來(lái)自這樣的觀察結(jié)果天然IL-15mRNA所表達(dá)的蛋白序列中含有抑制表達(dá)的信號(hào)或元件。通過(guò)去除這些抑制元件，得到更好的表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15編碼序列缺乏IL-15信號(hào)肽的編碼序列，優(yōu)選在其位置上提供另一種信號(hào)蛋白，例如IgE信號(hào)蛋白。此外，去除IL-15Kozak區(qū)和非翻譯區(qū)并去除抑制元件。構(gòu)建體中優(yōu)選包含的僅IL-15序列，是編碼缺乏IL-15信號(hào)肽的成熟IL-15蛋白的氨基酸序列的IL-15序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，提供包含分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子包含編碼與IL-15蛋白連接的非IL-15信號(hào)序列的融合蛋白的核酸序列。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，融合蛋白由與IL-15蛋白連接的非IL-15信號(hào)序列組成。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15蛋白缺乏IL-15信號(hào)序列。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，融合蛋白對(duì)于IL-15序列所來(lái)源的物種來(lái)說(shuō)是非免疫原性的。因此包含人IL-15的非免疫原性融合蛋白在人體內(nèi)是非免疫原性的。根據(jù)一些實(shí)施方案，提供包含構(gòu)建體的組合物，所述構(gòu)建體包含與IL-15蛋白連接的非IL-15信號(hào)序列的融合蛋白編碼序列，所述序列也可包括在同一核酸分子上或不同核酸分子上，即編碼免疫原的核酸序列上。通常，下述免疫原可以是任何免疫原性蛋白，包括變應(yīng)原、病原體抗原、癌相關(guān)抗原或涉及自身免疫性疾病的細(xì)胞相關(guān)抗原。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫原是病原體抗原，最優(yōu)選的病原體選自HIV、HSV、HCV和WNV。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物還包含編碼CD40L的核苷酸序列。該核苷酸序列可包含在同一核酸分子上作為融合蛋白，或不同分子上。CD40L也包含在含免疫原編碼序列的疫苗組合物中，得到改良疫苗。在其它實(shí)施方案中，CD40L可包含在不含免疫原編碼序列的免疫調(diào)節(jié)組合物中，得到改良的免疫調(diào)節(jié)組合物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子摻入到病毒載體中，所述病毒載體例如痘苗病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒，或其它任何可接受的病毒載體，用作疫苗或基因治療載體。包含與IL-15蛋白連接的非IL-15信號(hào)序列的融合蛋白的核苷酸序列的基因構(gòu)建體可直接摻入到本發(fā)明相同方面的減毒活病原體中。下面列出這些用作疫苗的病原體的實(shí)例。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，人IL-15(優(yōu)選缺乏IL-15信號(hào)序列)與人IgE信號(hào)序列連接。在一些實(shí)施方案中，還提供具有編碼CD40L的核苷酸序列的減毒病原體。包含與IL-15蛋白序列連接的非IL-15信號(hào)序列的融合蛋白是本發(fā)明的一方面。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，融合蛋白由與IL-15蛋白連接的非IL-15信號(hào)序列組成。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15蛋白缺乏IL-15信號(hào)序列。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，信號(hào)序列是IgE信號(hào)序列。序列優(yōu)選人序列。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，融合蛋白是非免疫原性的。非免疫原性是指這樣的蛋白對(duì)于IL-15序列所來(lái)源的物種來(lái)說(shuō)，所述蛋白是非免疫原性的。包含編碼IL-15和CD40L的基因構(gòu)建體的組合物及其使用方法本發(fā)明的另一個(gè)總的方面涉及包含編碼IL-15和CD40L的基因構(gòu)建體的組合物以及所述構(gòu)建體在疫苗和免疫調(diào)節(jié)組合物中的用途。關(guān)于這一方面，提供幾個(gè)不同的實(shí)施方案和形式。通常，IL-15是指人IL-15。然而，構(gòu)建體也可指來(lái)自狗、貓、馬、牛、豬或羊等其它物種的IL-15。IL-15可以是天然形式，即帶有IL-15信號(hào)序列。優(yōu)選IL-15是融合蛋白的組成部分(所述融合蛋白包含非I1-15信號(hào)序列)，最優(yōu)選還缺乏IL-15信號(hào)序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15與IgE信號(hào)序列連接。根據(jù)一些實(shí)施方案，提供包含一種分離的核酸分子的組合物或兩個(gè)不同的分離的核酸分子的組合物，前者包含編碼IL-15和CD40L的核酸序列，后者包含編碼IL-15的第一核酸序列及包含編碼CD40L的第二核酸序列。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含IL-15的蛋白對(duì)于IL-15序列所來(lái)源的物種來(lái)說(shuō)是非免疫原性的。根據(jù)一些實(shí)施方案，提供包含構(gòu)建體的組合物，所述構(gòu)建體包含IL-15和CD40L的編碼序列，所述序列也可包括在同一核酸分子上或在不同核酸分子上，即編碼免疫原的核酸分子上。通常，下述免疫原可以是任何免疫原性蛋白，包括變應(yīng)原、病原體抗原、癌相關(guān)抗原或涉及自身免疫性疾病的細(xì)胞相關(guān)抗原。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫原是病原體抗原，最優(yōu)選的病原體選自HIV、HSV、HCV和WNV。包含免疫原編碼序列的組合物可用作疫苗。不包含免疫原編碼序列的組合物可用作免疫調(diào)節(jié)組合物。在一些實(shí)施方案中，也提供蛋白免疫原，作為IL-15和CD40L聯(lián)用而增強(qiáng)的免疫應(yīng)答的目標(biāo)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子摻入到病毒載體中，例如痘苗病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒，或其它任何可接受的病毒載體，用作疫苗或基因治療載體。包含編碼IL-15和CD40L的核苷酸序列的基因構(gòu)建體可直接摻入到本發(fā)明相同方面的減毒活病原體中。下面列出這些用作疫苗的病原體的實(shí)例。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，人IL-15(優(yōu)選缺乏IL-15信號(hào)序列)與人IgE信號(hào)序列連接。疫苗和免疫調(diào)節(jié)組合物按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，本發(fā)明的組合物包含基因構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含免疫原和/或免疫原性蛋白編碼序列。將所述組合物給予個(gè)體，以調(diào)節(jié)個(gè)體免疫系統(tǒng)的活性，因而增強(qiáng)抗所述免疫原的免疫應(yīng)答。當(dāng)編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核酸分子被個(gè)體細(xì)胞攝入時(shí)，編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列在細(xì)胞中表達(dá)，因此將蛋白提供給個(gè)體。本發(fā)明的其它方面提供給予組合物中位于單個(gè)核酸分子上的蛋白編碼序列的方法，所述組合物包含編碼一種或多種不同轉(zhuǎn)錄因子或中間因子(intermediatefactor)的不同核酸分子，作為重組疫苗的組成部分和作為減毒疫苗的組成部分。按照本發(fā)明的一些方面，提供針對(duì)病原體或異常的疾病相關(guān)細(xì)胞的預(yù)防性和/或治療性免疫個(gè)體的組合物和方法。疫苗可以是任何類型的疫苗，例如減毒活疫苗、細(xì)胞疫苗、重組疫苗或核酸疫苗或DNA疫苗。本發(fā)明涉及用于傳遞免疫調(diào)節(jié)蛋白的組合物及其使用方法。可使用任何眾所周知的技術(shù)，包括DNA注射(亦稱DNA疫苗接種)、重組載體(例如重組腺病毒、重組腺病毒相關(guān)病毒和重組痘苗病毒)，來(lái)傳遞核酸分子。DNA疫苗描述于美國(guó)專利第5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055、5,676,594號(hào)及其中引用的優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)，所述的每篇專利文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。除了這些申請(qǐng)中描述的傳遞方案以外，傳遞DNA的替代方法描述于美國(guó)專利第4,945,050和5,036,006號(hào)，這兩篇文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。給藥途徑包括但不限于肌內(nèi)、鼻內(nèi)(intransally)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、眼內(nèi)(intraoccularly)和口服以及局部、經(jīng)皮、吸入或栓劑或粘膜組織，例如通過(guò)陰道、直腸、尿道、口腔和舌下組織灌洗。優(yōu)選的給藥途徑包括粘膜組織、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)和皮下注射?；驑?gòu)建體可通過(guò)包括但不限于以下方式給予傳統(tǒng)的注射器、無(wú)針注射裝置或“微彈轟擊基因槍(microprojectilebombardmentgeneguns)”。當(dāng)被細(xì)胞攝取時(shí)，基因構(gòu)建體可保留在細(xì)胞中，作為功能性染色體外分子和/或整合到細(xì)胞染色體DNA上?？梢詫NA導(dǎo)入細(xì)胞中，在此它可作為分離的遺傳物質(zhì)，以質(zhì)粒形式存在?；蛘?，可以將能整合到染色體上的線狀DNA導(dǎo)入細(xì)胞中。當(dāng)DNA導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，可以添加促進(jìn)DNA整合到染色體中的試劑?？捎糜诖龠M(jìn)整合的DNA序列也可包括在DNA分子中?；蛘?，可將RNA給予細(xì)胞。也預(yù)期提供基因構(gòu)建體，作為線狀小染色體，包括著絲粒、端粒和復(fù)制起點(diǎn)。基因構(gòu)建體可在生活在細(xì)胞內(nèi)的減毒活微生物體或重組微生物載體中保留部分遺傳物質(zhì)。基因構(gòu)建體可以是重組病毒疫苗基因組的組成部分，其中遺傳物質(zhì)或者整合在細(xì)胞染色體上或者仍存在于染色體外?；驑?gòu)建體包括核酸分子基因表達(dá)所需的調(diào)節(jié)元件。這些元件包括啟動(dòng)子、起始密碼子、終止密碼子和聚腺苷酸化信號(hào)。另外，編碼靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白的序列的基因表達(dá)常需要增強(qiáng)子。這些編碼所需蛋白的序列和調(diào)節(jié)元件操作性連接的元件，在接受它們的個(gè)體中是可操作的，這是必要的。起始密碼子和終止密碼子通常被認(rèn)為是編碼所需蛋白的核苷酸序列的組成部分。然而，這些元件在接受所述基因構(gòu)建體的個(gè)體中能發(fā)揮功能，這是必要的。起始密碼子和終止密碼子在編碼序列內(nèi)必須符合讀框。所用的啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)在個(gè)體細(xì)胞中必須起作用。本發(fā)明實(shí)踐、尤其是人用基因疫苗生產(chǎn)中所用的啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于來(lái)自以下來(lái)源的啟動(dòng)子猿猴病毒40(SV40)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、人免疫缺陷病毒(MV)例如BIV長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)啟動(dòng)子、莫洛尼病毒、ALV、巨細(xì)胞病毒(CMV)例如CMV立即早期啟動(dòng)子、EpsteinBarr病毒(EBV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)以及來(lái)自人基因的啟動(dòng)子，例如人肌動(dòng)蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌酸(musclecreatine)和人金屬硫蛋白(metalothionein)等人基因的啟動(dòng)子。本發(fā)明實(shí)踐、尤其是人用基因疫苗生產(chǎn)中所用的聚腺苷酸化信號(hào)的實(shí)例包括但不限于SV40聚腺苷酸化信號(hào)和LTR聚腺苷酸化信號(hào)。具體地講，使用pCEP4質(zhì)粒(Invitrogen，SanDiegoCA)中的SV40聚腺苷酸化信號(hào)，稱為SV40聚腺苷酸化信號(hào)。除了DNA表達(dá)所需的調(diào)節(jié)元件之外，DNA分子中也可包含其它元件。所述其它元件包括增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可選自以下增強(qiáng)子，包括但不限于人肌動(dòng)蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌酸和病毒增強(qiáng)子，例如來(lái)自CMV、RSV和EBV的增強(qiáng)子?；驑?gòu)建體可提供哺乳動(dòng)物復(fù)制起點(diǎn)，以便在染色體外保留構(gòu)建體并在細(xì)胞中產(chǎn)生多拷貝構(gòu)建體。來(lái)自Invitrogen(SanDiego，CA)的質(zhì)粒pVAX1、pCEP4和pREP4含有EpsteinBarr病毒復(fù)制起點(diǎn)和核心抗原EBNA-1編碼區(qū)，其產(chǎn)生高拷貝的未整合的附加體的復(fù)制。在免疫應(yīng)用相關(guān)的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，給予核酸分子，所述核酸分子包含編碼靶蛋白、免疫調(diào)節(jié)蛋白以及還能進(jìn)一步增強(qiáng)抗所述靶蛋白免疫應(yīng)答的蛋白的基因的核苷酸序列。所述基因的實(shí)例是編碼以下的其它細(xì)胞因子和淋巴因子的基因例如α-干擾素、γ-干擾素、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、TNF、GM-CSF、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-15，其中IL-15包括缺失信號(hào)序列并任選包括來(lái)自IgE的信號(hào)序列的IL-15?？梢蕴砑宇~外元件，所述元件起到細(xì)胞破壞的靶標(biāo)作用，如果因任何原因需要消除接受基因構(gòu)建體的細(xì)胞的話?；驑?gòu)建體中可包含呈可表達(dá)形式的皰疹胸苷激酶(tk)基因。可將藥物更昔洛韋給予個(gè)體，該藥物將會(huì)引起對(duì)產(chǎn)生tk的任何細(xì)胞的選擇性殺傷，因此，提供選擇性破壞具有所述基因構(gòu)建體的細(xì)胞的方法。為了最大量地產(chǎn)生蛋白，可以選擇適合于在接受構(gòu)建體的細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。此外，可以選擇在細(xì)胞中最有效轉(zhuǎn)錄的密碼子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可制備在細(xì)胞中起作用的DNA構(gòu)建體。本發(fā)明的一個(gè)方法包括按以下途徑給予核酸分子的步驟肌內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或局部，或者通過(guò)向粘膜組織灌洗，所述粘膜組織選自吸入、陰道、直腸、尿道、口腔和舌下組織。在一些實(shí)施方案中，將核酸分子與多核苷酸功能增強(qiáng)子或基因疫苗易化劑一起給予細(xì)胞。多核苷酸功能增強(qiáng)子描述于1994年1月26日申請(qǐng)的美國(guó)順序號(hào)5,593,972、5,962,428和國(guó)際申請(qǐng)順序號(hào)PCT/US94/00899，每件申請(qǐng)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中?；蛞呙缫谆瘎┟枋鲇?994年4月1日申請(qǐng)的美國(guó)順序號(hào)021,579，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。與核酸分子聯(lián)合給予的活性助劑可以作為與核酸分子的混合物給予，或者在給予核酸分子同時(shí)、之前或之后單獨(dú)給予。另外，可起到轉(zhuǎn)染劑和/或復(fù)制劑和/或炎性試劑的作用并能與GVF聯(lián)合給藥的其它試劑包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和淋巴因子，例如α-干擾素、γ-干擾素、GM-CSF、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、TNF、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、ILA、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-15以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表面活性劑例如免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似物(包括單磷脂酰脂質(zhì)A(WL)、胞壁酰肽)、苯醌類似物和囊泡例如角鯊烯和角鯊烯，透明質(zhì)酸也可與基因構(gòu)建體聯(lián)合給予。在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)蛋白可用作GVF。在一些實(shí)施方案中，核酸分子與PLG一起提供，以增強(qiáng)傳/攝取。本發(fā)明的藥物組合物包含約1納克至約2000微克DNA。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含約5納克至約1000微克DNA。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物含有約10納克至約800微克DNA。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物含有約0.1至約500微克DNA。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物含有約1至約350微克DNA。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物含有約25至約250微克DNA。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物含有約10至約200微克DNA。本發(fā)明的藥物組合物可按照所用的給藥方式來(lái)配制。在藥物組合物是注射用藥物組合物的情況下，它們無(wú)菌、無(wú)熱源和無(wú)顆粒。優(yōu)選使用等滲制劑。通常，等滲性添加劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在某些情況下，優(yōu)選等滲溶液例如磷酸緩沖鹽溶液。穩(wěn)定劑包括明膠和白蛋白。在一些實(shí)施方案中，向制劑中添加血管收縮藥。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，提供誘導(dǎo)抗免疫原免疫應(yīng)答的方法，即通過(guò)將本發(fā)明的組合物給予個(gè)體。疫苗可以是減毒活疫苗、細(xì)胞疫苗、重組疫苗或核酸疫苗或DNA疫苗。除了使用免疫調(diào)節(jié)蛋白編碼序列的可表達(dá)形式來(lái)改進(jìn)基因疫苗之外，本發(fā)明還涉及改良的減毒活疫苗和改良疫苗，其使用重組載體來(lái)傳遞編碼抗原的外源基因。減毒活疫苗和使用重組載體來(lái)傳遞外源抗原的疫苗的實(shí)例描述于美國(guó)專利第4,722,848、5,017,487、5,077,044、5,110,587、5,112,749、5,174,993、5,223,424、105,225,336、5,240,703、5,242,829、5,294,441、5,294,548、5,310,668、5,387,744、5,389,368、5,424,065、5,451,499、5,453,364、5,462,734、5,470,734和5,482,713，以上每篇文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。提供基因構(gòu)建體，其包含與調(diào)節(jié)序列操作性連接且編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，所述調(diào)節(jié)序列可在疫苗中起到影響表達(dá)的作用。將基因構(gòu)建體摻入到減毒活疫苗和重組疫苗中，以產(chǎn)生本發(fā)明的改良疫苗。本發(fā)明提供免疫個(gè)體的改進(jìn)方法，其包括以下步驟將基因構(gòu)建體給予個(gè)體細(xì)胞，作為疫苗組合物的組成部分，所述疫苗組合物包括DNA疫苗、減毒活疫苗和重組疫苗。基因構(gòu)建體包含與調(diào)節(jié)序列操作性連接且編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，所述調(diào)節(jié)序列可在疫苗中起到影響表達(dá)的作用。改良疫苗導(dǎo)致增強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。免疫原本發(fā)明用于誘發(fā)增強(qiáng)的抗靶蛋白的免疫應(yīng)答，所述靶蛋白即與病原體、變應(yīng)原或個(gè)體自身“異?！奔?xì)胞特異性相關(guān)的蛋白。本發(fā)明可用于使個(gè)體產(chǎn)生抗病原因子和病原生物的免疫，使得抗病原體蛋白的免疫應(yīng)答提供抗病原體的保護(hù)性免疫。本發(fā)明可用于控制過(guò)度增殖性疾病和障礙(例如癌癥)，即通過(guò)誘發(fā)抗靶蛋白的免疫應(yīng)答，所述靶蛋白是與過(guò)度增殖細(xì)胞特異性相關(guān)的蛋白。本發(fā)明可用于控制自身免疫性疾病和障礙，即通過(guò)誘發(fā)抗靶蛋白的免疫應(yīng)答，所述靶蛋白是與涉及自身免疫性疾病的細(xì)胞特異性相關(guān)的蛋白。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，將編碼靶蛋白和免疫調(diào)節(jié)蛋白的DNA或RNA導(dǎo)入個(gè)體組織細(xì)胞中，在此進(jìn)行表達(dá)，因而產(chǎn)生所編碼的蛋白。在個(gè)體細(xì)胞中，編碼靶蛋白和一種或兩種免疫調(diào)節(jié)蛋白的DNA或RNA序列與表達(dá)所需的調(diào)節(jié)元件連接。DNA表達(dá)的調(diào)節(jié)元件包括啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)。另外，其它元件，例如Kozak區(qū)，也可以包含在基因構(gòu)建體中。在一些實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)編碼靶蛋白序列的可表達(dá)形式以及編碼兩種免疫調(diào)節(jié)蛋白序列的可表達(dá)形式都在給予個(gè)體的同一核酸分子上。在一些實(shí)施方案中，編碼靶蛋白序列的可表達(dá)形式存在于各自的核酸分子上，而不在含有編碼一種或多種免疫調(diào)節(jié)蛋白的序列可表達(dá)形式的核酸分子上。在一些實(shí)施方案中，編碼靶蛋白序列的可表達(dá)形式與編碼一種或多種免疫調(diào)節(jié)蛋白的序列的可表達(dá)形式存在于一個(gè)核酸分子上，而不在含有編碼一種或多種免疫調(diào)節(jié)蛋白的序列可表達(dá)形式的核酸分子上?？梢园凑毡景l(fā)明，產(chǎn)生并傳遞多種不同核酸分子，并且傳遞給個(gè)體。例如，在一些實(shí)施方案中，編碼靶蛋白序列的可表達(dá)形式存在于各自的核酸分子上，而不在含有編碼這兩種免疫調(diào)節(jié)蛋白中的一種或多種的序列可表達(dá)形式的核酸分子上，而所述兩種免疫調(diào)節(jié)蛋白存在于各自的核酸分子上，而不在含有編碼一種或多種免疫調(diào)節(jié)蛋白的序列的可表達(dá)形式的核酸分子上。在這些情況下，將所有三種分子都傳遞給個(gè)體?？商峁┖怂岱肿?，作為質(zhì)粒DNA、重組載體的核酸分子或作為減毒疫苗或細(xì)胞疫苗所提供的遺傳物質(zhì)的組成部分?；蛘?，在一些實(shí)施方案中，除了傳遞編碼靶蛋白和/或一種或兩種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核酸分子以外，還可以將靶蛋白和/或一種或兩種免疫調(diào)節(jié)蛋白作為蛋白來(lái)傳遞，或者是用于替代編碼它們的核酸分子?；驑?gòu)建體可包括與基因表達(dá)所需調(diào)節(jié)元件操作性連接且編碼靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，提供以下基因構(gòu)建體的組合一個(gè)基因構(gòu)建體包含編碼靶蛋白的核苷酸序列的可表達(dá)形式，而另一個(gè)基因構(gòu)建體包含編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列的可表達(dá)形式。將包含基因構(gòu)建體組合的DNA或RNA分子摻入到活細(xì)胞中，導(dǎo)致DNA或RNA的表達(dá)并產(chǎn)生靶蛋白和一種或多種免疫調(diào)節(jié)蛋白。導(dǎo)致增強(qiáng)的抗靶蛋白的免疫應(yīng)答。本發(fā)明可用于使個(gè)體產(chǎn)生抗所有病原體的免疫，所述病原體例如病毒、原核生物和病原性真核生物，例如單細(xì)胞病原生物和多細(xì)胞寄生蟲。本發(fā)明特別用于使個(gè)體產(chǎn)生抗以下病原體的免疫，所述病原體感染細(xì)胞并且沒(méi)有包囊膜(encapsulated)，例如病毒和淋病(gonorrhea)、李斯特氏菌(1isteria)和志賀氏菌(shigella)等原核生物。另外，本發(fā)明也可用于使個(gè)體產(chǎn)生抗原生動(dòng)物病原體的免疫，所述病原體包括處于胞內(nèi)病原體的生命周期某一階段的病原體。表1列舉了可用于制備本發(fā)明疫苗的一些病毒科屬。包含編碼肽的DNA序列的DNA構(gòu)建體可用于疫苗，所述肽至少包含這樣的表位與該表所列舉的抗原等病原體抗原上展示的表位相同或基本類似的表位。此外，本發(fā)明也可用于使個(gè)體產(chǎn)生抗其它病原體的免疫，所述病原體包括原核病原體和真核原生動(dòng)物病原體，以及多細(xì)胞寄生蟲，例如表2所列舉的那些。為了生產(chǎn)基因疫苗以保護(hù)機(jī)體免遭病原體感染，基因構(gòu)建體中必須包含編碼免疫原性蛋白的遺傳物質(zhì)，作為靶的編碼序列，使得可以建立針對(duì)所述免疫原性蛋白的保護(hù)性免疫應(yīng)答。對(duì)于病原體是在胞內(nèi)感染(本發(fā)明對(duì)胞內(nèi)感染特別有用)還是胞外感染來(lái)說(shuō)，所有病原體抗原都誘導(dǎo)保護(hù)性反應(yīng)，是不太可能的。因?yàn)镈NA和RNA比較小，可以相對(duì)容易地生產(chǎn)，所以本發(fā)明提供采用多種病原體抗原接種的額外優(yōu)點(diǎn)?；蛞呙缰兴玫幕驑?gòu)建體可包括編碼許多病原體抗原的遺傳物質(zhì)，例如，一個(gè)構(gòu)建體中可包含若干病毒基因，由此提供多種靶標(biāo)。表1和表2列舉了用于制備基因疫苗的一些病原因子和病原生物，以保護(hù)個(gè)體免遭其感染。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，使個(gè)體產(chǎn)生抗病原體免疫的方法針對(duì)HIV、HSV、HCV、WNV或HBV。本發(fā)明的另一方面提供賦予抗過(guò)度增殖細(xì)胞(其是過(guò)度增殖性疾病的特征)的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，并提供治療罹患過(guò)度增殖性疾病的個(gè)體的方法。過(guò)度增殖性疾病的實(shí)例包括癌癥和銀屑病的所有形式。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將包含編碼免疫原性“過(guò)度增殖細(xì)胞”相關(guān)蛋白的核苷酸序列的基因構(gòu)建體導(dǎo)入個(gè)體細(xì)胞，導(dǎo)致在接種的個(gè)體細(xì)胞中產(chǎn)生這些蛋白。為了產(chǎn)生抗過(guò)度增殖性疾病的免疫，將包含編碼過(guò)度增殖性疾病相關(guān)蛋白的核苷酸序列的基因構(gòu)建體給予個(gè)體。為了讓過(guò)度增殖相關(guān)蛋白成為有效的免疫原性靶標(biāo)，與正常細(xì)胞相比，過(guò)度增殖細(xì)胞中必須專一性或以更高水平產(chǎn)生蛋白。靶抗原包括所述蛋白、其片段和肽；其包括存在于所述蛋白上的至少一個(gè)表位。在一些實(shí)例中，過(guò)度增殖相關(guān)蛋白是蛋白編碼基因的突變產(chǎn)物。與正常蛋白相比，突變基因編碼除了具有稍微不同的氨基酸序列外幾乎相同的蛋白，這產(chǎn)生正常蛋白上不存在的不同表位。所述靶蛋白包括例如以下癌基因所編碼的蛋白myb、myc、fyn和易位基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF。除了癌基因產(chǎn)物作為靶抗原之外，抗癌治療用靶蛋白和保護(hù)性方案還包括B細(xì)胞淋巴瘤產(chǎn)生的抗原的可變區(qū)和T細(xì)胞淋巴瘤的T細(xì)胞受體的可變區(qū)，在一些實(shí)施方案中也可用自身免疫性疾病的靶抗原。其它腫瘤相關(guān)蛋白也可用作靶蛋白，例如在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)呈更高水平的蛋白，包括單克隆抗體17-IA所識(shí)別的蛋白和葉酸結(jié)合蛋白或PSA。盡管本發(fā)明可用于使個(gè)體產(chǎn)生抗幾種類型癌癥中的一種或多種的免疫，但是本發(fā)明特別可用于預(yù)防性免疫個(gè)體，所述個(gè)體易于發(fā)展特定癌癥，或者所述個(gè)體已經(jīng)罹患癌癥并易于復(fù)發(fā)。遺傳學(xué)和技術(shù)以及流行病學(xué)的發(fā)展，使人們能夠?qū)€(gè)體產(chǎn)生癌癥的概率和風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行測(cè)算和評(píng)價(jià)。采用遺傳篩選和/或家族健康史，可以預(yù)測(cè)特定個(gè)體發(fā)生幾種類型癌癥中任何一種的概率。同樣，那些已經(jīng)罹患癌癥的個(gè)體和那些經(jīng)治療消除癌癥或得到緩解的個(gè)體，也特別易于復(fù)發(fā)。作為治療方案的一部分，可對(duì)經(jīng)診斷確認(rèn)患有癌癥的個(gè)體進(jìn)行抗癌免疫，以便控制癌癥復(fù)發(fā)。因此，一旦得知個(gè)體患有某類癌癥并具有復(fù)發(fā)危險(xiǎn)時(shí)，可以對(duì)他們進(jìn)行免疫，使其免疫系統(tǒng)做好準(zhǔn)備，以應(yīng)付未來(lái)出現(xiàn)的任何癌癥。本發(fā)明提供治療罹患過(guò)度增殖性疾病的個(gè)體的方法。在該方法種，引入基因構(gòu)建體，作為免疫治療藥，指導(dǎo)和啟動(dòng)個(gè)體免疫系統(tǒng)，以對(duì)付產(chǎn)生靶蛋白的過(guò)度增殖細(xì)胞。本發(fā)明提供治療罹患自身免疫性疾病和障礙的個(gè)體的方法，即通過(guò)給予廣譜保護(hù)性免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答是針對(duì)包括細(xì)胞受體和產(chǎn)生“自身”定向抗體的細(xì)胞在內(nèi)的自身免疫相關(guān)靶標(biāo)的。T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化(MS)、斯耶格倫綜合征(Sjogren’ssyndrome)、結(jié)節(jié)病、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、自身免疫性甲狀腺炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、銀屑病、脈管炎、韋格納肉芽腫病(Wegener’sgranulomatosis)、節(jié)段性回腸炎(Crohn’sdisease)和潰瘍性結(jié)腸炎。這些疾病的特征都是結(jié)合內(nèi)源性抗原并引起自身免疫性疾病相關(guān)的炎性級(jí)聯(lián)的T細(xì)胞受體?？筎細(xì)胞可變區(qū)的接種，將會(huì)誘導(dǎo)包括CTL在內(nèi)的免疫應(yīng)答，以消除這些T細(xì)胞。在RA中，涉及該病的T細(xì)胞受體(TCR)的若干特異性可變區(qū)已經(jīng)表征。這些TCR包括Vβ-3、Vβ-14、20Vβ-17和Vα-17。因此，用編碼至少一種所述蛋白的DNA構(gòu)建體進(jìn)行接種，將會(huì)誘導(dǎo)靶向涉及RA的T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。參見(jiàn)Howell，M.D.等，1991Proc.Nat.Acad.Sci.USA8810921-10925；Piliard，X.等，1991Science253325-329；Williams，W.V.等，1992JClinInvest.90326-333；以上每篇文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在MS中，涉及該病的TCR的若干特異性可變區(qū)已經(jīng)表征。這些TCR包括VfP和Va-10。因此，用編碼至少一種所述蛋白的DNA構(gòu)建體進(jìn)行接種，將會(huì)誘導(dǎo)靶向涉及MS的T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。參見(jiàn)Wucherpfennig，K.W.等，1990Science2481016-1019；Oksenberg，J.R.等，1990Nature345344-346；以上每篇文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在硬皮病中，涉及該病的TCR的若干特異性可變區(qū)已經(jīng)表征。這些TCR包括Vβ-6、Vβ-8、Vβ-14和Vα-16、Vα-3C、Vα-7、Vα-14、Vα-15、Vα-16、Vα-28和Vα-12。因此，用編碼至少一種所述蛋白的DNA構(gòu)建體進(jìn)行接種，將會(huì)誘導(dǎo)靶向涉及硬皮病的T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。為了治療罹患T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病(特別是TCR可變區(qū)已經(jīng)表征的)的患者，可以進(jìn)行滑膜活檢。可以取出所存在的T細(xì)胞樣品，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定TCR可變區(qū)。用這些信息，可以制備基因疫苗。B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病包括狼瘡(SLE)、格雷夫斯病(Grave’sdisease)、重癥肌無(wú)力、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少癥、哮喘、冷球蛋白血癥、原發(fā)性膽硬化和惡性貧血。這些疾病的特征都是結(jié)合內(nèi)源性抗原并引起自身免疫性疾病相關(guān)的炎性級(jí)聯(lián)的抗體?？箍贵w可變區(qū)的接種，將會(huì)誘導(dǎo)包括CTL在內(nèi)的免疫應(yīng)答，以消除這些產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞。為了治療罹患B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的患者，必須對(duì)涉及自身免疫活性的抗體可變區(qū)進(jìn)行鑒定?？梢赃M(jìn)行活檢，可以取出炎癥部位所存在的抗體樣品?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)，對(duì)這些抗體的可變區(qū)進(jìn)行鑒定。用這些信息，可以制備基因疫苗。在SLE的情況下，認(rèn)為一種抗原是DNA。因此，在有待進(jìn)行抗SLE免疫的患者中，可以對(duì)他們的血清篩選抗DNA抗體，可以制備包含DNA構(gòu)建體的疫苗，所述DNA構(gòu)建體編碼血清中存在的抗DNA抗體可變區(qū)。TCR可變區(qū)和抗體可變區(qū)的共同結(jié)構(gòu)特征是眾所周知的。通?？砂凑找韵卤娝苤姆椒?，找到編碼特定TCR或抗體的DNA序列，所述方法例如描述于以下文獻(xiàn)的方法Kabat等，1987SequenceofProteinsofImmunologicalInterestU.S.DepartmentofHealthandHumanServices，BethesdaMD，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。另外，從抗體克隆功能性可變區(qū)的通用方法可參見(jiàn)Chaudhary，V.K.等，1990Proc.Natl.AcadSci.USA871066，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。重組蛋白的制備本發(fā)明涉及體外宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，所述宿主細(xì)胞包含在所述宿主細(xì)胞中可操作的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含編碼由與非IgE蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽組成的融合蛋白的核酸序列；涉及所述核酸分子；和涉及包含所述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明也涉及產(chǎn)生融合蛋白的方法，所述方法包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞的步驟。本發(fā)明涉及分離的融合蛋白，其包含與非IgE蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)方法，使用易得的原料，如上所述地制備融合蛋白。制備編碼所需蛋白的合適DNA序列，就可以使用本領(lǐng)域已知的重組技術(shù)來(lái)制備蛋白。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以使用眾所周知的技術(shù)，將編碼融合蛋白的DNA插入到市售表達(dá)載體中，用于眾所周知的表達(dá)系統(tǒng)中。市售質(zhì)粒pYES2(Invitrogen，SanDiego，Calif.)可用于在釀酒酵母(S.cerevisiae)中進(jìn)行制備。市售MaxBacTM(Invitrogen，SanDiego，Calif.)完整桿狀病毒表達(dá)載體可用于在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行制備。市售質(zhì)粒pcDNAI(Invitrogen，SanDiego，Calif.)可用于在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行制備。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可使用這些市售表達(dá)載體系統(tǒng)或其它系統(tǒng)，用常規(guī)技術(shù)和易得原料來(lái)制備融合蛋白。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可使用其它市售表達(dá)載體和系統(tǒng)，使用眾所周知的方法和易得原料，來(lái)制備載體。含有所需控制序列(例如啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)，優(yōu)選增強(qiáng)子)的表達(dá)系統(tǒng)是易得的，并且本領(lǐng)域已知可用于各種宿主。參見(jiàn)例如Sambrook等，MolecularCloningaLaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborPress(1989)。因此，所需蛋白既可在原核系統(tǒng)中也可在真核系統(tǒng)中制備，得到一系列加工形式的蛋白。目前，各種各樣的真核宿主也可用于制備重組外源蛋白。可以用產(chǎn)生所需蛋白(直接使用IgE信號(hào)肽)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化真核宿主。常用的真核系統(tǒng)包括但不限于酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、鳥類細(xì)胞和高等植物細(xì)胞?？梢允褂煤线m的啟動(dòng)子以及末端序列和增強(qiáng)子，其用于這些宿主類型時(shí)是相容的和可操作的，例如桿狀病毒多角體啟動(dòng)子。如上所述，啟動(dòng)子可以是組成型或誘導(dǎo)型的。例如，在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，小鼠金屬硫蛋白啟動(dòng)子可以因添加重金屬離子而被誘導(dǎo)。適于所需宿主的表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域已知的。對(duì)于蛋白的重組制備來(lái)說(shuō)，編碼它的DNA適宜連接所選的表達(dá)載體并用于轉(zhuǎn)化相容性宿主，然后在以下條件下培養(yǎng)和維持它們其中發(fā)生外源基因的表達(dá)。從培養(yǎng)物中(或者可以通過(guò)裂解細(xì)胞或者優(yōu)選從培養(yǎng)基中)回收由此產(chǎn)生的本發(fā)明蛋白。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以使用眾所周知的技術(shù)，使用所述表達(dá)系統(tǒng)，分離所產(chǎn)生的融合受體蛋白或其片段。實(shí)施例實(shí)施例1引言對(duì)許多HIV-1陽(yáng)性個(gè)體來(lái)說(shuō)，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的聯(lián)合療法在感染者中成功地降低了病毒量，導(dǎo)致良好的預(yù)后。然而，一些實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)報(bào)道，聯(lián)合用藥方案很少影響已建立的病毒儲(chǔ)存庫(kù)(以下參考文獻(xiàn)1-3)。迄今為止，聯(lián)合療法尚未導(dǎo)致病毒的清除，而且目前的治療方案具有相當(dāng)大的副作用，最終會(huì)影響患者的依從性并影響病程。因此，非常需要開(kāi)發(fā)替代療法，包括用于HIV-1的潛在的免疫療法。據(jù)信，CD8+T細(xì)胞應(yīng)答對(duì)于控制HIV-1感染和緩解病程來(lái)說(shuō)，是重要的。盡管HIV-1特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答在控制病毒復(fù)制中的確切功能尚未完全闡明，但是，已經(jīng)確定，HIV-1血清陽(yáng)性個(gè)體中長(zhǎng)期不發(fā)展與特異性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答之間的相關(guān)性(以下參考文獻(xiàn)4-7)。另外，在岡比亞，一組高暴露、但HIV陰性的個(gè)體缺乏抗體應(yīng)答，但卻顯示出抗HIV-1的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答(以下參考文獻(xiàn)8和9)。的確，HIV-1感染后，增強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答被誘導(dǎo)，同時(shí)伴隨病毒量的下降。然而，盡管存在高水平的HIV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，但HIV-1感染仍然沒(méi)有清除。高CD8介導(dǎo)的應(yīng)答與持續(xù)的病程之間的矛盾值得深思。CTL不能清除病毒，可能部分因?yàn)镃TL逃逸突變體(以下參考文獻(xiàn)10-14)，這是病毒可能的免疫致病機(jī)制，例如Nef相關(guān)性I類MHC的下調(diào)或Vpr或Env對(duì)宿主免疫力的影響(以下參考文獻(xiàn)15-18)。另一個(gè)問(wèn)題是CD8+T淋巴細(xì)胞缺乏有效的CD4+T細(xì)胞輔助(以下參考文獻(xiàn)19和20)。據(jù)觀察，循環(huán)CD8+細(xì)胞可具有受損的功能(以下參考文獻(xiàn)21)。如果HIV-1免疫發(fā)病機(jī)理限制產(chǎn)生有效的CD8應(yīng)答的話，在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法中提供HIV-1抗原，則能以有限的方式強(qiáng)化CD8記憶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞。這些事件能對(duì)克服疾病提供潛在影響。然而，為CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增提供幫助是重要的。鑒于此，人們發(fā)現(xiàn)，CD8+記憶T細(xì)胞的存活，對(duì)持續(xù)的抗原呈遞來(lái)說(shuō)，并非偶然，(以下參考文獻(xiàn)22)，但是可能依賴于周圍環(huán)境中特異性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。顯著影響CD8+T細(xì)胞的一個(gè)所述細(xì)胞因子是白介素-15(IL-15)。Waldmann及其同事首次報(bào)道，IL-15是一種15kDa蛋白，使用IL-2受體復(fù)合物的γ鏈和β鏈，所述復(fù)合物是IL-2受體與信號(hào)T細(xì)胞的復(fù)合物，其具有獨(dú)特α鏈(以下參考文獻(xiàn)23)。IL-15表現(xiàn)出抗凋亡活性，看來(lái)在刺激記憶CD8+T細(xì)胞表型中起到作用。許多研究小組正在對(duì)IL-15在HIV-1感染中的作用進(jìn)行研究。已經(jīng)證明，IL-15減少?gòu)腍IV-1感染者分離的淋巴細(xì)胞的細(xì)胞凋亡(以下參考文獻(xiàn)24)并增加天然殺傷細(xì)胞的活性和增殖(以下參考文獻(xiàn)25-27)。也認(rèn)為，IL-15與HIV-1感染者的B細(xì)胞增殖(以下參考文獻(xiàn)28和29)和巨噬細(xì)胞活化(以下參考文獻(xiàn)30)有關(guān)。重要的是，IL-15看來(lái)也對(duì)HIV-1效應(yīng)T細(xì)胞的增殖和干擾素-γ(IFN-γ)的產(chǎn)生具有直接作用(以下參考文獻(xiàn)31和32)。然而，IL-15在許多檢驗(yàn)為HIV-1血清陽(yáng)性的患者中卻不能刺激IFN-γ。因此，研究了IL-15對(duì)抗原特異性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用。對(duì)IL-15對(duì)從慢性感染的HIV-1血清陽(yáng)性患者分離的T細(xì)胞的作用進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)，rhIL-15增強(qiáng)了CD8T細(xì)胞的增殖，而且重要的是，IL-15在所有患者中都增加了的效應(yīng)抗原特異性CD8+IFN-γ的產(chǎn)生。在免疫模型中，IL-15增強(qiáng)了CD8+效應(yīng)細(xì)胞的功能，這是在免疫模型系統(tǒng)中進(jìn)行的研究。來(lái)自小鼠的CD8+淋巴細(xì)胞能夠以更高水平裂解表達(dá)HIV-1抗原的靶標(biāo)，當(dāng)提供IL-15時(shí)。這一作用發(fā)生在CD4+T細(xì)胞劇烈增殖不存在的情況下。然而，在CD4敲除(KO)小鼠中，在產(chǎn)生CD8效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答時(shí)，IL-15不能完全忽略CD4輔助的需要。這些結(jié)果表明，IL-15在CD8記憶細(xì)胞的增殖中是高度有效的，但是單獨(dú)的IL-15對(duì)其開(kāi)始產(chǎn)生并不足夠。材料與方法人PBMC的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定，對(duì)于通過(guò)基本ficoll-hypaque技術(shù)從HIV-1陽(yáng)性志愿者分離的PBMC，評(píng)價(jià)效應(yīng)子功能。將PBMC重懸于含10％FCS(R10)的RPMI中，濃度為1×106細(xì)胞/ml。將抗體1-DIK(Mabtech，MariemontOH；Nacka，SE)在0.1M碳酸鹽-碳酸氫鹽溶液(pH9.6)中稀釋至15μg/ml，用于包被96孔硝酸纖維素膜板(Millipore，Bedford，MA)。膜板在4℃孵育過(guò)夜。用200μlPBS洗滌膜板6次。將122種無(wú)菌肽的混合物(mixture)配制成混合物(cocktail)，濃度(對(duì)于每種肽)為50μg/μl的DMSO。所述肽是一系列重疊肽，長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸，包括所有HIV-1Gag(AIDSReagent和ReferenceRepository，ARRR)。將100,000個(gè)PBMC加入到硝酸纖維素抗體包被板的每孔中(100μl@1.0×106細(xì)胞/m1)，再加入100μl肽混合物(稀釋1∶200(溶于R10)，有或沒(méi)有50ng/mlIL-15，終濃度25ng/ml)。每個(gè)樣品按一式三份進(jìn)行測(cè)定。用5μg/mlPHA作為陽(yáng)性對(duì)照。將各板在37℃孵育約24小時(shí)。然后用200μlPBS洗滌各板6次。將100μl抗體7-B6-1-生物素(Mabtech)加入到每孔中，濃度為1μg/ml的PBS。各板在室溫下孵育2-4小時(shí)。然后用200μlPBS洗滌各板6次。將100μl鏈霉抗生物素-ALP(Mabtech)加入到每孔中，濃度為1μg/ml的PBS。各板在室溫下孵育1-2小時(shí)。用200μlPBS洗滌各板6次。將100μl底物溶液(BCIP/NBT，Sigma)加入到每孔中。用自來(lái)水除去顯影液。使用或者與CD8特異性單克隆抗體偶聯(lián)或者與CD4特異性單克隆抗體偶聯(lián)的Dynabeads(DynalBiotech，Lakesuccess，NY；Oslo，NO)來(lái)耗盡CD8和CD4群體。用抗CD3單克隆抗體對(duì)PBMC的共刺激在有或沒(méi)有IL-15(50ng/ml)的情況下，用結(jié)合Dynabeads(DynalBiotech)的對(duì)CD3具有特異性的單克隆抗體，刺激從HIV-1血清陽(yáng)性患者分離的PBMC，然后通過(guò)如上所述的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法，分析產(chǎn)生的IFN-γ。使用或者與CD8特異性單克隆抗體偶聯(lián)或者與CD4特異性單克隆抗體偶聯(lián)的Dynabeads(DynalBiotech)來(lái)耗盡CD8和CD4群體。用CD40L對(duì)PBMC的共刺激測(cè)定CD40L蛋白與IL-15和肽混合物的聯(lián)用，其濃度為250μg/ml，然后通過(guò)如上所述的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法，分析產(chǎn)生的IFN-γ。在小鼠中進(jìn)行質(zhì)粒免疫在第0周和第2周，雌性Balb/c小鼠用50μgpCgag或pCenv和50μg質(zhì)粒一起進(jìn)行接種，所述質(zhì)粒如前所述表達(dá)IL-2R依賴性Th1細(xì)胞因子IL-15的基因(以下參考文獻(xiàn)33)。也采用Cd4tmlKmv定向突變的純合型小鼠。這些小鼠因CD4基因突變而在CD4+T細(xì)胞發(fā)育中被完全阻斷；其90％的循環(huán)T-細(xì)胞是CD8+。純合突變型小鼠在輔助T細(xì)胞活性和其它T細(xì)胞應(yīng)答上也顯示出II類限制性缺陷。在第0周和第2周，B6.129S6-Cd4tmlKmv用50μgpCgag和50μg質(zhì)粒一起進(jìn)行接種，所述質(zhì)粒表達(dá)CD40L、IL-15或兩者的組合。用Qiagen柱制備所有DNA，最終的制劑是0.25％布比卡因的等滲檸檬酸緩沖液。第二次注射后一周，切取脾臟。鼠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞測(cè)定在5小時(shí)51Cr釋放CTL測(cè)定中，使用重組痘苗病毒感染的細(xì)胞作為靶標(biāo)，評(píng)價(jià)CTL應(yīng)答。在接種和體外刺激后一周，分離脾細(xì)胞。用相關(guān)痘苗病毒感染的細(xì)胞刺激效應(yīng)子。P815用vDK1(gag/pol)(ARRR)或vMN462(ARRR)(env)感染。如前所述，刺激物用0.1％戊二醛固定，然后與脾細(xì)胞一起(比例為1∶20)在CTL培養(yǎng)基中孵育4-5天。CTL培養(yǎng)基由1∶1的Iscove改良DulbeccoMedia(Gibc-BRL，GrandIsland，NY)和Hanks平衡鹽溶液(Gibco-BRL)組成，后者含有10％胎牛血清1640(Gibco-BRL)和10％RAT-T-STIM，不含ConA(BectonDickinsonLabware，Bedford，MA)。通過(guò)在37℃感染3×106P815細(xì)胞(感染復(fù)數(shù)MOI為10)達(dá)12小時(shí)，制備痘苗病毒感染的靶標(biāo)。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測(cè)定，其中靶細(xì)胞用20μCi/mlNa251CrO4標(biāo)記120分鐘，然后與受刺激的效應(yīng)脾細(xì)胞一起在37℃孵育6小時(shí)。在效應(yīng)子∶靶標(biāo)(E∶T)比例為50∶1至12.5∶1的范圍內(nèi)，測(cè)定CTL裂解。收獲上清液，在LKBCliniGammaγ-計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)。按照下式求出特異性裂解的百分?jǐn)?shù)通過(guò)使靶細(xì)胞在含1％TritonX-100培養(yǎng)基中裂解，求出最大釋放。如果“自發(fā)釋放”計(jì)數(shù)值超過(guò)“最大釋放”的20％的話，認(rèn)為測(cè)定無(wú)效。CD8+T細(xì)胞的完全裂解通過(guò)用抗CD8單克隆抗體(Pharmingen，SanDiego，CA)進(jìn)行處理，然后通過(guò)在37℃與兔補(bǔ)體(Sigma)一起保溫45分鐘，從脾細(xì)胞中去除CD8+T細(xì)胞(以下參考文獻(xiàn)33)。鼠T輔助細(xì)胞增殖測(cè)定采用淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定，評(píng)價(jià)淋巴細(xì)胞的總免疫活性并檢測(cè)對(duì)分裂細(xì)胞具有特異性的抗原。按照以下參考文獻(xiàn)34所述，從脾臟收獲淋巴細(xì)胞，去除紅細(xì)胞，然后用新鮮培養(yǎng)基洗滌幾次，以制備淋巴細(xì)胞。分離的細(xì)胞以5×106細(xì)胞/ml的濃度重懸浮。將含5×105細(xì)胞的100μl等分試樣立即加入到96孔平底微量滴定板的每孔中。將重組p24蛋白加入到各孔中，一式三份，得到終濃度5μg/ml和1μg/ml。將細(xì)胞于37℃/5％CO2孵育3天。將1μCi的氚化胸苷加入到各孔中，然后將細(xì)胞在37℃孵育12-18小時(shí)。收獲各板中的細(xì)胞，在Beta讀板儀(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上測(cè)定所摻入的氚化胸苷的數(shù)量。按下式求出刺激指數(shù)刺激指數(shù)(SI)＝(實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)/自發(fā)計(jì)數(shù))自發(fā)計(jì)數(shù)孔中包含10％胎牛血清，起到無(wú)關(guān)蛋白對(duì)照作用。同樣，來(lái)自pCgag或?qū)φ彰庖咝∈蟮钠⒓?xì)胞通常針對(duì)其無(wú)關(guān)蛋白靶標(biāo)來(lái)說(shuō)SI為1。為了確保細(xì)胞健康，采用PHA或ConA(Sigma)作為多克隆刺激物陽(yáng)性對(duì)照。受刺激鼠細(xì)胞的細(xì)胞因子和趨化因子分析從脾臟收獲淋巴細(xì)胞，將分離的細(xì)胞重懸浮，濃度為5×106細(xì)胞/ml。將含5×105細(xì)胞的100μl等分試樣加入到96孔平底微量滴定板的各孔中。將重組p24蛋白或包膜蛋白加入到各孔中，一式三份，得到終濃度5μg/ml和1μg/ml。將細(xì)胞于37℃/5％CO2孵育3天，收獲上清液。用市售ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞因子和趨化因子。受刺激鼠細(xì)胞的干擾素-γ的胞內(nèi)染色小鼠接受兩次注射pCgagDNA或者pCgagDNA質(zhì)粒加上pIL-15。一周后，收獲脾細(xì)胞，在含有p55肽合并液(含122種15聚體，其跨越HIV-1p55，具有11個(gè)氨基酸的重疊)和布雷菲德菌素A的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)5小時(shí)。刺激后，細(xì)胞用抗小鼠CD3抗體和抗小鼠CD8抗體進(jìn)行胞外染色，然后用抗小鼠IFN-γ進(jìn)行胞內(nèi)染色。描點(diǎn)曲線顯示CD3+/CD8+淋巴細(xì)胞的應(yīng)答。表位作圖將脾細(xì)胞重懸于含10％FCS(R10)的RPMI中，濃度為1×106細(xì)胞/ml。將得自AIDSReference和ReagentRepository的系列122種肽，混合成為每種合并液中含10種肽的混合物，終濃度為20μg/ml/肽。每種肽都包含在兩個(gè)不同的合并液中，總共有22種肽合并液。以矩陣形式排列各合并液，用于脾細(xì)胞刺激。IFN-γ的產(chǎn)生通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法(R和D系統(tǒng))評(píng)價(jià)。將各板于37℃孵育約24小時(shí)。每個(gè)樣品按一式三份進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果用CD3和IL-15對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激評(píng)價(jià)IL-15以協(xié)同方式，與T細(xì)胞受體刺激一起，增強(qiáng)T細(xì)胞效應(yīng)子活化的能力。PBMC是從HIV-1感染者中分離的。PBMC用抗CD3表面結(jié)合抗體進(jìn)行刺激，然后與IL-15一起孵育過(guò)夜。不出所料，CD3單獨(dú)刺激PBMC，能誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，而單獨(dú)補(bǔ)充IL-15卻只能誘導(dǎo)低應(yīng)答至無(wú)應(yīng)答。然而，當(dāng)淋巴細(xì)胞用CD3和IL-15一起刺激時(shí)，觀察到細(xì)胞分泌IFN-γ的數(shù)量增加好幾倍(圖1)。受刺激群體耗盡CD4+或CD8+T細(xì)胞，然后補(bǔ)充IL-15，再次檢測(cè)活性。CD8細(xì)胞的損失再次耗盡活化信號(hào)。數(shù)據(jù)表明，來(lái)自HIV-1慢性感染者的CD8+效應(yīng)T細(xì)胞，可以因IL-15/CD3刺激而擴(kuò)增(圖2)。HIV-1陽(yáng)性樣品經(jīng)IL-15刺激后產(chǎn)生抗原特異性IFN-γ對(duì)IL-15增強(qiáng)HIV-1抗原特異性CD8+應(yīng)答的能力，進(jìn)行體外評(píng)價(jià)。從接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒聯(lián)合治療(HAART)的HIV-1慢性感染者中，采集樣品。在用HIV-1特異性肽刺激后，在IL-15存在或不存在的情況下，評(píng)價(jià)PBMC分泌IFN-γ的能力。PBMC用包含HIV-1gag蛋白完整可讀框的重疊HIV-115個(gè)氨基酸肽進(jìn)行刺激。來(lái)自接受肽刺激的患者的PBMC，當(dāng)用IL-15處理后，表現(xiàn)出IFN-γ產(chǎn)生增加(圖3A和圖3B)，IFN-γ產(chǎn)生在有無(wú)IL-15的情況下具有顯著性差異(p＝009)，(圖3C)。一些患者單用IL-15刺激，就會(huì)高水平分泌INF-γ(圖3A)，表明它們具有部分T細(xì)胞活化，所述活化被阻斷并需要補(bǔ)充細(xì)胞因子才有效。這一活性清楚表明，當(dāng)CD8細(xì)胞群體被耗盡時(shí)，CD8在介導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生中的活性已經(jīng)喪失(圖3D)。IL-15在小鼠體內(nèi)增加CD8+CTL應(yīng)答以上對(duì)HIV-1應(yīng)答和IL-15的研究，確定IL-15在初次刺激的T細(xì)胞群體中能增加IFN-γ的產(chǎn)生。然而，尚不清楚，IL-15對(duì)CD8+T細(xì)胞的體內(nèi)功能誘導(dǎo)具有什么樣的效應(yīng)。為了解決該問(wèn)題，使用小鼠模型系統(tǒng)。給小鼠接種HIV-1質(zhì)粒，作為傳遞HIV-1抗原并研究CD8免疫在體內(nèi)誘導(dǎo)的措施。HIV-1表達(dá)質(zhì)粒是與或者表達(dá)IL-15的質(zhì)粒、或者對(duì)照質(zhì)粒一起注射的，然后比較所得免疫應(yīng)答。在大量CTL測(cè)定中，與表達(dá)HIV-1包膜和IL-15的質(zhì)粒一起注射，導(dǎo)致約40％表達(dá)HIV-1包膜的靶標(biāo)裂解，其比例為50∶1效應(yīng)子∶靶標(biāo)，相比之下，用包膜質(zhì)粒和對(duì)照載體則觀察到11％裂解(圖4A)。這些結(jié)果是CD8T細(xì)胞依賴性的，表明IL-15對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答的顯著影響。小鼠在抗原刺激后IL-15誘導(dǎo)MIP-1β和IFN-g的分泌疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可進(jìn)一步擴(kuò)增，即通過(guò)檢查β-趨化因子MIP-1β作為免疫活化標(biāo)記的表達(dá)分布型。趨化因子是免疫和炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)劑。它們?cè)诎准?xì)胞從血管進(jìn)入宿主防御的外圍部位的分子調(diào)控中尤為重要。此外，先前已經(jīng)報(bào)道過(guò)，T細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子包括MIP-1β，在細(xì)胞免疫增殖中起到關(guān)鍵作用(以下參考文獻(xiàn)24)。因此，受刺激T細(xì)胞所產(chǎn)生的趨化因子的水平，可提供抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的量和質(zhì)方面的補(bǔ)充知識(shí)。對(duì)受刺激T細(xì)胞的上清液(如材料與方法小節(jié)所述)的MIP-1β釋放進(jìn)行分析和檢測(cè)。用IL-15共同免疫，結(jié)果導(dǎo)致高水平分泌MIP-1β(圖4B)。也對(duì)上清液中產(chǎn)生的Th1細(xì)胞因子IFN-γ進(jìn)行評(píng)價(jià)。在細(xì)胞用于CTL測(cè)定之前，在用表達(dá)HIV-1包膜的重組痘苗病毒所感染的效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行為期3天的淋巴細(xì)胞刺激之后，得到樣品。圖4C表明，與單獨(dú)注射質(zhì)粒疫苗或?qū)φ盏男∈笙啾?，共注射IL-15的小鼠的脾細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的IFN-γ(120pg/ml)。相比之下，在這些研究中沒(méi)有觀察到任何培養(yǎng)物明顯產(chǎn)生的IL-4(數(shù)據(jù)未顯示)。IFN-γ和TNF-α的胞內(nèi)染色為了定量研究對(duì)HIV-1疫苗的T細(xì)胞應(yīng)答，進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色測(cè)定。處死免疫動(dòng)物，收獲脾細(xì)胞，在含p55混合物和布雷菲德菌素A的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)5小時(shí)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，測(cè)定CD8+CD3+T細(xì)胞的IFN-γ或TNF-α的產(chǎn)生(圖5A和圖5B)。共同接種IL-15的動(dòng)物表現(xiàn)出高CD8效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答，2.6％的CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，3.7％的產(chǎn)生TNF-α。這些數(shù)據(jù)表明，IL-15對(duì)功能性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答顯示出巨大影響。用IL-15和HIV-1疫苗共同免疫的鼠脾細(xì)胞中淋巴細(xì)胞增殖T輔助淋巴細(xì)胞的活化和增殖對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫擴(kuò)增來(lái)說(shuō)，是至關(guān)重要的。在基礎(chǔ)淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定中，評(píng)價(jià)了來(lái)自免疫小鼠的脾細(xì)胞在響應(yīng)重組HIV-1抗原刺激時(shí)的增殖能力?？磥?lái)IL-15對(duì)增殖應(yīng)答沒(méi)有重大影響(圖6)。然而，IL-2用作對(duì)照，清楚地看到，在共注射IL-2質(zhì)粒的小鼠中，對(duì)于gp120env蛋白的脾細(xì)胞增殖顯著增加。比起用對(duì)照、pCgag單用或pCEnv+IL-15聯(lián)用免疫的小鼠來(lái)說(shuō)，共注射IL-2的小鼠脾細(xì)胞，導(dǎo)致刺激指數(shù)至少高出3倍(圖6)。該數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明，在沒(méi)有T細(xì)胞輔助劇烈擴(kuò)增時(shí)，IL-15看來(lái)也能增加CD8T細(xì)胞功能。這也證明，IL-15所引起的擴(kuò)增并不依賴于IL-2。這表明，在這種情況下，CD4及CD8效應(yīng)子功能的擴(kuò)大。表位作圖IL-15處理對(duì)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng)作用，是否是因?yàn)樗憫?yīng)的表位數(shù)量的增加(即表位延伸)，還是因?yàn)閷?duì)同一表位具有特異性的CD8+T細(xì)胞數(shù)量的總體增加？為了解決這些問(wèn)題，使用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定和一系列得自AIDSReference和ReagentRepository的肽(按矩陣形式混合成合并液)，鑒定出兩個(gè)表位。將優(yōu)勢(shì)表位作圖到Gag氨基酸197-211(AMQMLKETMEEAAE-SEQIDNO1)(圖7)。Paterson等人先前在用重組單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)HIV-1疫苗進(jìn)行免疫后，已經(jīng)確定AMQMLKETI-SEQIDNO2(以下參考文獻(xiàn)35)為優(yōu)勢(shì)CD8表位。進(jìn)而確定了亞優(yōu)勢(shì)表位即Gag氨基酸293-307(FRDVDRFYKTRAE-SEQIDNO3)(圖7)。在僅用Gag免疫的小組中，觀察到所響應(yīng)表位的數(shù)量沒(méi)有增加。然而，IL-15極大地增加了對(duì)這些表位應(yīng)答的數(shù)量級(jí)。僅在用IL-15共同免疫的動(dòng)物中是亞優(yōu)勢(shì)表位的清楚證據(jù)。IL-15影響CD8效應(yīng)細(xì)胞的擴(kuò)增。CD4敲除小鼠我們觀察到，在來(lái)自HIV-1感染者的PBMC中，IL-15使抗原特異性CD8T細(xì)胞擴(kuò)增。我們也觀察到，在我們的疫苗模型中，顯著的CD8效應(yīng)細(xì)胞誘導(dǎo)不依賴于CD4擴(kuò)增。因此，CD4輔助T細(xì)胞對(duì)IL-15免疫擴(kuò)增的貢獻(xiàn)引起疑問(wèn)。為了解決這一問(wèn)題，對(duì)IL-15在完全沒(méi)有CD4細(xì)胞的情況下誘導(dǎo)CD8效應(yīng)群體的能力，進(jìn)行了調(diào)查。對(duì)Cd4tmlKmv定向突變的純合型小鼠(以下參考文獻(xiàn)36)進(jìn)行免疫。這些小鼠在CD4+T細(xì)胞發(fā)育中被阻斷，因此大多數(shù)循環(huán)淋巴細(xì)胞是CD8細(xì)胞。利用質(zhì)粒共同免疫模型(其中在正常小鼠中每一百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞中平均約有200個(gè)IFN-γ產(chǎn)生細(xì)胞被誘導(dǎo))，在絕對(duì)沒(méi)有CD4細(xì)胞的情況下，IL-15不能拯救誘導(dǎo)的CD8效應(yīng)子功能(圖8B)。因?yàn)榭磥?lái)IL-15的作用不涉及CD4擴(kuò)增(圖6)，所以該缺陷理所當(dāng)然是因?yàn)槿狈輔助細(xì)胞所提供的另一功能，CD4T輔助細(xì)胞也提供對(duì)CD8擴(kuò)增的幫助，即通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞(APC)的活化。在這一APC活化模型中，APC上的CD40與T細(xì)胞CD40配體的連接，上調(diào)B7的表達(dá)，使T細(xì)胞活化。在I類MHC肽呈遞的情況下，B7分子對(duì)CD8T細(xì)胞擴(kuò)增提供共刺激。而且，Bourgeois等(以下參考文獻(xiàn)37)證明，CD40L能直接影響CD8記憶細(xì)胞的發(fā)育。在CD4輔助方面的缺陷表現(xiàn)為缺乏共刺激水平，這一點(diǎn)是下一項(xiàng)要考慮和研究的。為了檢驗(yàn)該假說(shuō)，小鼠用含有IL-15和CD40L以及pCgag的質(zhì)粒進(jìn)行共免疫。使用錨定的CD40L分子。錨定的CD40L是局部表達(dá)的并在轉(zhuǎn)運(yùn)的免疫細(xì)胞，但是不能分泌，這使實(shí)驗(yàn)變得更復(fù)雜(以下參考文獻(xiàn)38)。這樣的接種可在質(zhì)粒模型中提供共刺激(以下參考文獻(xiàn)38)。的確，當(dāng)研究pCgag與pCD40L聯(lián)合使用時(shí)，在CD40KO小鼠中，誘導(dǎo)Gag特異性CD8免疫應(yīng)答(圖8)。該數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，IL-15直接影響記憶CD8淋巴細(xì)胞。當(dāng)CD4細(xì)胞不存在時(shí)，IL-15從稚細(xì)胞不能誘導(dǎo)抗原特異性CD8細(xì)胞應(yīng)答。討論HIV-1特異性CD8免疫應(yīng)答的維持和增強(qiáng)一直是許多研究的來(lái)源。近期研究已經(jīng)報(bào)道，IL-15在支持記憶細(xì)胞存活中起到重要作用。觀察到在小鼠模型中，IL-15的存在，可導(dǎo)致記憶細(xì)胞分裂(以下參考文獻(xiàn)39)。離體功能分析以及用遺傳上缺乏IL12、IL-15或其特異性受體的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行的研究，在表征IL-15所起的作用中是重要的。的確，Zhang及其合作者(以下參考文獻(xiàn)39)證明，在體內(nèi)小鼠模型中，IL-15對(duì)記憶表型、CD44hiCD8+T細(xì)胞提供有效而有區(qū)別的刺激。另外，Ku等(以下參考文獻(xiàn)40)報(bào)道，記憶CD8+T細(xì)胞的分裂是由IL-15刺激的，但是被IL-2抑制。也發(fā)現(xiàn)，IL-2抑制CD8+記憶T細(xì)胞的增殖。本文所公開(kāi)的研究工作證明，IL-15對(duì)體外和體內(nèi)誘導(dǎo)CD8+效應(yīng)T細(xì)胞也特別有效。當(dāng)與肽和IL-15一起孵育時(shí)，從HIV-1感染者分離的CD8+T細(xì)胞能以抗原特異性方式分泌IFN-γ。IL-15與TCR協(xié)同作用，刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ并確保效應(yīng)子表型。在某些患者中，在抗原不存在的情況下，IL-15導(dǎo)致IFN-γ的產(chǎn)生。這表明，在HIV感染中，某些細(xì)胞被部分激活，而這類部分激活狀態(tài)可被IL-15拯救。然而，重要的是，在所有患者中，當(dāng)用IL-15和HIV-1抗原共同刺激PBMC時(shí)，效應(yīng)子功能顯著增加。目前，vonAdrian及其同事(以下參考文獻(xiàn)41)提出，對(duì)淋巴細(xì)胞的IL-15刺激能導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞直接從稚細(xì)胞加工成記憶細(xì)胞表型。然而，本文的數(shù)據(jù)表明，TCR的結(jié)合可導(dǎo)致CD8+T淋巴細(xì)胞更完全活化，表明IL-15單用對(duì)稚細(xì)胞的作用是最小的。另外，也表明，IL-15導(dǎo)致非功能性記憶細(xì)胞(以下參考文獻(xiàn)41)。該數(shù)據(jù)證明，在人以及小鼠研究中，IL-15擴(kuò)增都能導(dǎo)致完全功能性CD8+T細(xì)胞。在小鼠中，IL-15顯著增加CD8+T細(xì)胞應(yīng)答以及增加β-趨化因子和IFN-γ應(yīng)答，這清楚表明抗原特異性擴(kuò)增并建立在先前的工作上(以下參考文獻(xiàn)33和42)。在CD4+T細(xì)胞擴(kuò)增不存在的情況下，觀察到CD8+T細(xì)胞功能的擴(kuò)增。然而，對(duì)于CD4T細(xì)胞在發(fā)生CD8應(yīng)答方面具有重要作用。在CD4敲除小鼠的研究中，通過(guò)使用CD40L，可以遏止對(duì)CD4T細(xì)胞的需要。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)病毒感染的免疫治療極其重要。許多免疫治療策略都集中于擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。HIV-1感染通過(guò)病毒誘導(dǎo)的免疫抑制，使免疫治療變得更為復(fù)雜，所述免疫抑制能導(dǎo)致缺乏有效的CD4+T細(xì)胞輔助。反過(guò)來(lái)說(shuō)，認(rèn)為缺乏這樣的輔助，造成無(wú)效CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。在通常的慢性感染中需要CD4+的輔助，以維持對(duì)病毒復(fù)制的控制，這可能是HIV-1感染的實(shí)例。Serbina等(以下參考文獻(xiàn)43)證明，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的發(fā)展依賴于CD4+T細(xì)胞。他們還觀察到，在CD4T細(xì)胞敲除小鼠中具有降低的IL-15產(chǎn)生。然而，IL-15并不由CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生。它主要由基質(zhì)細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生?？赡苡蠧D4+T細(xì)胞增加IL-15產(chǎn)生的某些反饋機(jī)制，而在降低CD4輔助的情況下，最終CD8+T細(xì)胞功能也下降。該反饋機(jī)制可解釋，為什么6個(gè)患者中有3個(gè)IFN-γ產(chǎn)生是在單獨(dú)添加IL-15之后。因此，在CD4不存在且IL-15處于較低水平的情況下，在HIV-1血清陽(yáng)性患者中，殘留病毒僅可部分激活CD8+T淋巴細(xì)胞。重要的是，由此看來(lái)，可以添加IL-15，以更改由病毒免疫抑制所引起的缺陷。應(yīng)該在免疫治療HIV-1的領(lǐng)域中，考慮該假說(shuō)的意義?？偟膩?lái)說(shuō)，IL-15在小鼠中增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞效應(yīng)子功能并增強(qiáng)從HIV-1感染陽(yáng)性患者分離的CD8+T細(xì)胞的功能。應(yīng)該考慮，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gation，108871-878.42.MooreAC.KongWP.ChakrabartiBK.NabelGJ.EffectsofantigenandgeneticadjuvantsonimmuneresponsestohumanimmunodeficiencyvirusDNAvaccinesinmice(在小鼠中，抗原和遺傳佐劑對(duì)針對(duì)人免疫缺陷病毒DNA疫苗的免疫應(yīng)答的作用).JournalofVirology.76(1)243-50，2002年1月.43.SerbinaNV.LazarevicV.FlynnJL2001，CD4(+)TcellsarerequiredforthedevelopmentofcytotoxicCD8(+)TcellsduringMycobacteriumtuberculosisinfection(在結(jié)核分枝桿菌感染中，CD4(+)T細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒CD8(+)T細(xì)胞發(fā)育來(lái)說(shuō)是必需的).JournalofImmunology.1676991-7000.實(shí)施例2需要CD4(+)Th細(xì)胞并產(chǎn)生IFN-γ，以在免疫抑制個(gè)體體內(nèi)以及抗腫瘤免疫中控制病毒復(fù)制。來(lái)自實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)證明，對(duì)于T細(xì)胞輔助以擴(kuò)增CD8效應(yīng)T細(xì)胞的需要，可以被疫苗部位局部產(chǎn)生IL-15和CD40L來(lái)替代。用通過(guò)基因敲除II類MHC的β-鏈(MHCIIKO)而消除CD4(+)T細(xì)胞的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，揭示出用抗原gag+IL-15+CD40L初次免疫所述動(dòng)物，導(dǎo)致CD8T細(xì)胞的活化。用IFN-γ的產(chǎn)生(以斑點(diǎn)表示)測(cè)定活化。在該測(cè)定中多于50點(diǎn)的為陽(yáng)性。這些數(shù)據(jù)見(jiàn)圖9，說(shuō)明了用于測(cè)定不依賴CD4(+)T細(xì)胞輔助的效應(yīng)CD8T細(xì)胞的活化的簡(jiǎn)單方法。這些研究對(duì)于無(wú)免疫應(yīng)答個(gè)體的治療來(lái)說(shuō)，具有重要意義。實(shí)施例3人、小鼠和猿猴IL-15cDNA均編碼162個(gè)氨基酸(aa)殘基的前體蛋白，含有48個(gè)aa殘基的前導(dǎo)序列，將其切除后，得到114個(gè)aa殘基的成熟IL-15。人IL-15與猿猴和小鼠IL-15分別共享約97％和73％的序列同一性。人IL-15和猿猴IL-15對(duì)小鼠細(xì)胞都有活性。盡管IL-15的結(jié)構(gòu)尚未確定，但是預(yù)測(cè)其類似于IL-2和四螺旋束細(xì)胞因子家族的其它成員。(Grabstein，K.等(1994)Science264965，Anderson，D.M.等(1995)Genomics25701；和Bamford，R.N.等(1995)Cytokine7595，Brandhuber，B.J.等(1987)Science2381707，所述文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。)IL-15mRNA在心臟、肺、肝臟、胎盤、骨骼肌、粘附外周血單核細(xì)胞、APC(樹突細(xì)胞)和上皮細(xì)胞系以及成纖維細(xì)胞系中都可檢出。然而，IL-15mRNA在含有高水平IL-2mRNA的活化外周血T細(xì)胞中沒(méi)能檢出。IL-15已經(jīng)顯示出刺激天然殺傷細(xì)胞、活化外周血T淋巴細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)和B細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外，IL-15也已經(jīng)顯示出是人血T淋巴細(xì)胞的趨化因子，在NK細(xì)胞中能誘導(dǎo)淋巴因子活化殺傷(LAK)活性，并能誘導(dǎo)溶細(xì)胞性效應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)生。(Armitage，R.J.等(1995)J.Immunol.154483；P.Wilkinson和F.Liew(1995)J.Exp.Med.1811255；Grabstein，K.等(1994)Science264965；Giri，J.G.等(1994)EMBOJ.132822；和Giri，J.G.等(1995)EMBOJ.153654，每篇文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。因?yàn)镮L-15是原型Th1細(xì)胞因子，而且由于其作為T細(xì)胞、NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞和TIL刺激物的活性，IL-15是一種令人興奮的候選物，作為分子佐劑可與DNA疫苗(例如HIV疫苗)聯(lián)用，以增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。IL-15增加HIV特異性CTL，而IL-15的過(guò)量產(chǎn)生與節(jié)段性回腸炎等炎性疾病有關(guān)。RNA印跡分析表明IL-15的廣泛組成型表達(dá)。表達(dá)的控制發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后的翻譯和轉(zhuǎn)運(yùn)(胞內(nèi)運(yùn)輸)水平。IL-15mRNA中包含許多妨礙其翻譯成蛋白的元件，包括1)5′AUG帶有上游AUG，其干擾有效的IL-15翻譯(小鼠有5個(gè)，人有12個(gè))；2)IL-15編碼序列的起始密碼子具有弱KOZAK區(qū)(GTAATGA)；3)IL-15成熟蛋白編碼序列的C-端存在負(fù)元件。(Grabstein等(1994)Science264965-968，Bamford等(1996)PNAS932897-2902；Bamford等(1998)J.Immunol1604418-4426；和Kozak等(1991)J.CellBiol.115887-903，所述文獻(xiàn)各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。這三個(gè)控制元件各自可被消除，以改進(jìn)表達(dá)。天然IL-15同種型含有兩個(gè)前導(dǎo)肽21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽(SSP)或48個(gè)氨基酸的信號(hào)肽(LSP)(Waldmann等，Ann.Rev＞Immunol.(1999)1719-49，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。進(jìn)行下述策略通過(guò)優(yōu)化用于免疫的IL-15DNA構(gòu)建體，來(lái)增加IL-15的表達(dá)。引物設(shè)計(jì)成從信號(hào)肽開(kāi)始擴(kuò)增IL-15，因此上游抑制性AUG在最終IL-15信使中不存在。引物設(shè)計(jì)成包括強(qiáng)KOZAK區(qū)(GCCGCCACC)。C-端負(fù)調(diào)節(jié)元件用PCR反義引物設(shè)計(jì)來(lái)除去。所述引物見(jiàn)圖10。進(jìn)行下述策略通過(guò)用IgE前導(dǎo)序列取代48個(gè)氨基酸的IL-15信號(hào)肽(LSP)，來(lái)增加IL-15的表達(dá)。有義引物設(shè)計(jì)成從48個(gè)氨基酸的LSP后開(kāi)始，而反義引物從終止位點(diǎn)擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)成包括強(qiáng)KOZAK區(qū)(GCCGCCACC-SEQIDNO4)。有義引物設(shè)計(jì)成含有IgE前導(dǎo)序列加上ATG起始位點(diǎn)的序列。所述引物見(jiàn)圖11。制備不同的構(gòu)建體，用于轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞。測(cè)定不同構(gòu)建體的IL-15蛋白的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)見(jiàn)圖12A-C。圖13A顯示，包含與IL-15連接的21個(gè)氨基酸信號(hào)肽(IL-15SSP-左)的編碼序列和人48個(gè)氨基酸信號(hào)肽(IL-15LSP-右)的編碼序列的人構(gòu)建體的表達(dá)比較。圖12B顯示，包含48個(gè)氨基酸信號(hào)肽(人IL-15LSP-左)的編碼序列和IgE信號(hào)肽(人IL-15-IgE-右)的編碼序列的人構(gòu)建體的表達(dá)比較。圖12C顯示，包含48個(gè)氨基酸信號(hào)肽(恒河猴IL-15LSP-左)的編碼序列和IgE信號(hào)肽(恒河猴IL-15-IgE-右)的編碼序列的恒河猴構(gòu)建體的表達(dá)比較。對(duì)不同構(gòu)建體所產(chǎn)生的IL-15蛋白，測(cè)定IL-15的生物活性。數(shù)據(jù)見(jiàn)圖13A和圖13B。圖13A顯示，在包含48個(gè)氨基酸信號(hào)肽(人IL-15LSP-左)和IgE信號(hào)肽(人IL-15-IgE-右)的編碼序列的人構(gòu)建體之間的IL-15生物活性比較。圖13B顯示，包含48個(gè)氨基酸信號(hào)肽(恒河猴IL-15LSP-左)的編碼序列和IgE信號(hào)肽(恒河猴IL-15-IgE-右)的編碼序列的恒河猴構(gòu)建體之間的IL-15生物活性比較。用具有與IgE信號(hào)肽編碼序列連接的IL-15編碼序列的插入序列的表達(dá)載體pVAX，制備構(gòu)建體。也得到編碼HIV-1Gag的構(gòu)建體。進(jìn)行免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，用IL-15工程質(zhì)粒以及HIV-1Gag，比較對(duì)免疫應(yīng)答的效應(yīng)。按照?qǐng)D14的免疫方案，對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行接種。在第三次免疫后5周，通過(guò)比較對(duì)抗原特異性IFN-γ產(chǎn)生的再次刺激，研究免疫應(yīng)答。數(shù)據(jù)見(jiàn)圖15。疫苗組包括首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠，接種載體pCDN3的小鼠，接種編碼HIV-1Gag的構(gòu)建體的小鼠，接種編碼HIV-1Gag和IL-15(連接48個(gè)氨基酸信號(hào)肽)的構(gòu)建體的小鼠，接種編碼HIV-1Gag以及IgE信號(hào)肽的構(gòu)建體的小鼠。實(shí)施例4構(gòu)建工程化IL-15質(zhì)粒疫苗，即通過(guò)除去天然IL-15Kozak區(qū)、AUG和UTR。提供具有IgE信號(hào)肽編碼序列的工程化IL-15質(zhì)粒。工程化IL-15的表達(dá)水平比相關(guān)野生型質(zhì)粒高30-50倍。在用工程化IgE信號(hào)-IL-15和HIV-1gag構(gòu)建體共同免疫的小鼠中，所觀察到的免疫應(yīng)答明顯比單用HIV-1gag構(gòu)建體免疫的小鼠高幾倍。數(shù)據(jù)見(jiàn)圖16。實(shí)施例5編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的分離的cDNA可用作構(gòu)建可產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)蛋白的構(gòu)建體的原料。在一些實(shí)施方案中，提供這樣的構(gòu)建體其中一個(gè)以下免疫調(diào)節(jié)蛋白的編碼序列與IgE信號(hào)肽連接。在一些實(shí)施方案中，提供所述構(gòu)建體作為疫苗和免疫調(diào)節(jié)組合物的組成部分，例如如上所述的構(gòu)建體。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和易得原料，可以制備編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核酸分子，并摻入到如上所述的構(gòu)建體、載體、疫苗等中。Genbank檢索號(hào)AF031167是指人IL-15mRNA的完整編碼序列。Genbank檢索號(hào)Y09908、X91233、X94223和X94222也是指人IL-15序列。它們都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。Genbank檢索號(hào)L07414是指人CD40-配體mRNA的完整編碼序列。其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。Bax的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為L(zhǎng)22473，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。TRAIL的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為U37518或AF023849，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。TRAILrecDRC5的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為U90875或AF016266，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。通過(guò)引用結(jié)合到本文中的還有TRAIL-R2AF016849；TRAIL-R3AF014794；和TRAIL-R4AF021232。RANK的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為AF018253，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。RANK配體的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為AF019047或AF333234，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。Ox40的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為X75962，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。Ox40配體的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為X79929或AB007839，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。NKG2D的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為AF461811或X54870，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。MICA的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為X92841，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。MICB的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為U65416，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。NKG2A的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為X54867，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。NKG2B的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為X54868，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。NKG2C的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為X54869或Aj0016984，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。NKG2E的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為L(zhǎng)14542，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。NKG2F的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為AH006173、U96845或U96846，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。CD30的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為M83554，(Durkop，H等，Cell68(3)，421-427(1992))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。CD153(CD30L)的核苷酸序列和氨基酸序列的GENBANK檢索號(hào)為L(zhǎng)09753，(Smith，C.A.等，Cell73(7)，1349-1360(1993))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。Fos的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為K00650或V01512，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。c-jun的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為J04111或M29039，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。Sp-1的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為BC021101、BC005250、BC002878、M31126、J02893或X15102，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。Ap1的核苷酸序列可在以下文獻(xiàn)中找到Lee等，1987Cell49741-752，Rauscher等，1988Science2401010-1016，和Chiu等，1988Cell54541-552，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。Ap-2的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為M36711，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。p38的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為U66243，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。p65Rel的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為L(zhǎng)19067，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。MyD88的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為U70451，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。IRAK的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為NM001569，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。TRAF6的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為U78798，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。IkB的核苷酸序列可在以下文獻(xiàn)中找到Gilmore等，TrendsGenet1993年12月；9(12)427-33，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。NIK的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為Y10256，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。SAPK的核苷酸序列可在以下文獻(xiàn)中找到Franklin等，Oncogene.1995年12月7日；11(11)2365-74，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。SAP1的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為M85164或M85165，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。JNK2的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為L(zhǎng)31951，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。JNK1B2的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為U35005；其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。JNK1B1的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為U35004；其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。JNK2B2的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為U35003；其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。JNK2B1的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為U35002；其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。JNK1A2的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為U34822；其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。JNK2A1的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為U34821；其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。JNK3A1的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為U34820；其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。JNK3A2的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為U34819，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。NF-κ-B2即p49剪接形式的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為A57034，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。NF-κ-B2即p100剪接形式的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為A42024，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。NF-κ-B2即p105剪接形式的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為S17233，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。NF-κ-B50K鏈前體的核苷酸序列的GENBANK檢索號(hào)為A37867，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。NFκBp50的核苷酸序列描述于MeyerR.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88(3)，966970，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。人IL-1的核苷酸序列和氨基酸序列是眾所周知的，示于以下文獻(xiàn)Telford等(1986)Nucl.AcidsRes.149955-9963，F(xiàn)urutani等(1985)Nucl.AcidsRes.143167-3179，March等(1985)Nature315641-647和檢索號(hào)SwissprotPO1583，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。人IL-2的核苷酸序列和氨基酸序列是眾所周知的，示于以下文獻(xiàn)Holbrook等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA811634-1638，F(xiàn)ujita等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA807437-7441，F(xiàn)use等(1984)Nucl.AcidsRes.129323-9331，Taniguchi等(1983)nature302305-310，Meada等(1983)Biochem.Biophys.Res.Comm.1151040-1047，Devos等(1983)Nucl.AcidsRes.114307-4323，檢索號(hào)為SwissprotPO1585，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。人IL-4的核苷酸序列和氨基酸序列是眾所周知的，示于以下文獻(xiàn)Arai等(1989)J.Immunol.142274-282Otsuka等(1987)Nucl.AcidsRes.15333-344，Yokota等(1986)Proc.Natl.Acad.SciUSA835894-5898，Noma等(1984)Nature319640-646，Lee等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA832061-2063，和檢索號(hào)Swissprot05112(鼠IL-4的檢索號(hào)為Swissprot07750)，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。人IL-5的核苷酸序列和氨基酸序列是眾所周知的，示于以下文獻(xiàn)Campbell等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA846629-6633，Tanabe等(1987)J.Biol.Chem.26216580-16584，Campbell等(1988)Eur.J.Biochem.174345-352，Azuma等(1986)Nucl.AcidsRes.149149-9158，Yokota等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA847388-7392，和檢索號(hào)SwissprotPO5113，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。人IL-10的核苷酸序列和氨基酸序列是眾所周知的，示于以下文獻(xiàn)Viera等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA881172-1176，和檢索號(hào)SwissprotP22301。人IL-15的核苷酸序列和氨基酸序列是眾所周知的，示于以下文獻(xiàn)Grabstein等(1994)Science264965-968，和檢索號(hào)SwissprotUO3099，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。人IL-18的核苷酸序列和氨基酸序列是眾所周知的，示于以下文獻(xiàn)Ushio等(1996)J.Immunol.1564274-4279，檢索號(hào)為D49950，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。人TNF-α的核苷酸序列和氨基酸序列是眾所周知的，示于以下文獻(xiàn)Pennica，(1984)Nature312724-729，檢索號(hào)為SwissprotPO1375，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。人TNF-β的核苷酸序列和氨基酸序列是眾所周知的，示于以下文獻(xiàn)Gray，(1984)Nature312721-724，和檢索號(hào)SwessprotPO1374，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。人IL-10氨基酸序列是眾所周知的，示于以下文獻(xiàn)Viera等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA881172-1176，和檢索號(hào)SwissprotP22301，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。人白介素12mRNA的完整編碼序列示于Genbank檢索號(hào)AF180563(P40mRNA)和AF180562(P35mRNA)和美國(guó)專利第5,840,530號(hào)，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。MadCAM-1的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)U80016(Leung，E.等，Immunogenetics46(2)，111-119(1997))，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。MadCAM-1的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)U43628(Shyjan，A.M.等，J.Immunol.156(8)，2851-2857(1996))，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。NGF的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M57399(Kretschmer，P.J.等，GrowthFactors5，99-114(1991))，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。IL-7的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)J04156(Goodwin，R.G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(1)，302-306(1989))，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。VEGF的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M32977(Leung，D.W.等，Science246，1306-1309(1989))，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。TNF-R的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M60275(Gray，P.W.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，7380-7384(1990))，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。TNF-R的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M63121(Himmler，A.等，DNACellBiol.9，705-715(1990))，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。Fas的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M67454(Itoh，N.等，Cell66(2)，233-243(1991))，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。CD40L的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)L07414(Gauchat，J.F.M.等，F(xiàn)EBSLett，315，259-266(1992)，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。IL-4的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M23442(Arai，N.等，J.Immunol.142(1)，274-282(1989))，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。IL-4的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M13982(Yokota，T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83(16)，5894-5898(1986))，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。CSF的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M37435(Wong，G.G.等，Science235(4795)，1504-1508(1987))，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。G-CSF的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)X03656(Nagata，S.等，EMBOJ.5(3)，575-581(1986))，其各自通過(guò)引用結(jié)合到本文中。G-CSF的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)X03655(Nagata，S.等，EMBOJ.5(3)，575-581(1986))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。GM-CSF的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M11220(Lee，F(xiàn).等，Proc.Ntl.Acad.Sci.U.S.A.(13)，4360-4364(1985))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。GM-CSF的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M10663(Wong，G.G.等，Science228(4701)，810-815(1985))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。M-CSF的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M27087(Takahashi，M.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.161(2)，892-901(1989))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。M-CSF的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M37435(WongG.G.等，Science235(4795)，1504-1508(1987))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。LFA-3的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)Y00636(Wallner，B.P.等，J.Exp.Med.166(4)，923-932(1987))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。ICAM-3的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)X69819，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。ICAM-2的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)X15606(Staunton，D.E.等，Nature339(6219)，61-64(1989))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。ICAM-1的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)J03132(Staunton，D.E.等，Cell52(6)，925-933(1988))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。PECAM的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M28526(Newman，P.J.等，Science247，1219-1222(1990)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。P150.95的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)Y00093(Corbi，A.L.等，EMBOJ.6(13)，4023-4028(1987))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。Mac-1的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)J03925(Corbi，A.L.等，J.Biol.Chem.263(25)，12403-12411(1988))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。LFA-1的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)Y00796(Larson.R.等，J.CellBiol.108(2)，703-712(1989))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。CD34的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M81104(Simmons，D.L.等，J.Immunol.148，267-271(1992))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。RANTES的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M21121(Schall，T.J.等，J.Immunol.141，1018-1025(1988))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。IL-8的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M28130(Mukaida，N.等，J.Immunol.143(4)，1366-1371(1989))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。MIP-1α的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)U72395(Fridell，R.A.等，J。Cell.Sci110(pt11)，1325-1331(1997))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。E-selecton的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M24736(Bevilacqua，M.P.等，Science243(4895)，1160-1165(1989))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。CD2的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M14362(Sewell，W.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，8718-8722(1986)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84，7256-7256(1987))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。MCP-1的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)S69738(Li，Y.S.等，Mol.Cell.Biochem.126(1)，61-68(1993))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。L-selection的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)X16150(Tedder，T.F.等，J.Exp.Med.170(1)，123-133(1989))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。P-selection的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M25322(Johnston，G.I.等，Cell56，1033-1044(1989)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。FLT的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)X94263(Mandrota，S.J.等，J.Biol.Chem.271(19)，11500-11505(1996))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。FLT的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)X51602(Shibuya，M.等，Oncogene5(4)，519-524(1990)Han，H.J.等Hum.Mol.Genet.2(12)，2204(1993))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。Apo-1的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)X63717(Oehm等，J.Biol.Chem.，(1992)，267(15)，10709-15)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。Fas的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M67454(Itoh等，Cell，(1991)，66(2)，233-43)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。TNFR-1的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M67454(Nophar等，EMBOJ.，1990，9(10)，3269-78)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。p55的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M58286(Loetscher等，Cell，1990，61，351-359)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。WSL-1的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)Y09392(Kitson等，Nature，1996，384(6607)，372-5)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。DR3的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)U72763(Chinnaiyan等，Science，1996，274(5829)，990-2)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。TRAMP的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)U75381(Bodmer等，Immunity，1997，6(1)，79-88)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。Apo-3的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)U74611(Marsters等，Curr.Biol.，1996，6(12)，1669-76)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。AIR的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)U78029，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。LARD的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)U94512(Screaton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94(9)，4615-19)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。NGRF的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)M14764(Johnson等，Cell，1986，47(4)，545-554)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。DR4(TRAIL)的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)U90875(Pan等，Science，1997，276(5309)，111-113)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。DR5的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)AF012535(Sheridan等，Science，1997，1227(5327)，818-821)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。KILLER的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)AF022386(Wu等，Nat.Genet.17(2)，141-143(1997))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。TRAIL-R2的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)AF020501，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。TRICK2的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)AF018657。DR6的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)AF068868，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。ICE的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)U13697、U13698和U13699(Alnemri，E.S.等，J.Biol.Chem.270(9)，4312-4317(1995))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。VLA-1的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)X17033(Takada.等，J.Biol.Chem.109(1)，397-407(1989))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。CD86(B7.2)的序列信息參見(jiàn)Genbank檢索號(hào)U04343(Azuma等，Nature.366(6450)，76(1993))，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。表1小RNA病毒科(PicornavirusFamily)屬鼻病毒屬(Rhinovirus)(醫(yī)學(xué))是約50％感冒的病因腸道病毒屬(Etherovirus)(醫(yī)學(xué))包括脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)、柯薩奇病毒(coxsackievirus)、?？刹《?echovirus)和人腸道病毒(humanenterovirus)例如甲型肝炎病毒(hepatitisAvirus)口瘡病毒屬(Apthoviruse)(獸醫(yī))是口蹄疫病毒靶抗原VP1、VP2、VP3、VP4、VPG杯狀病毒科(CalcivirusFamily)屬諾沃克病毒組(NorwalkgroupofVirus)(醫(yī)學(xué))這些病毒是流行性胃腸炎的重要致病因子披膜病毒科(TogavirusFamily)屬甲病毒屬(Alphavirus)(醫(yī)學(xué)和獸醫(yī))實(shí)例包括Senilisvirus、羅斯河病毒(RossRivervirus)、東方馬腦炎病毒和西方馬腦炎病毒(Eastern&WesternEquineencephalitisvirus)呼腸孤病毒屬(Reovirus)(醫(yī)學(xué))風(fēng)疹病毒(Rubellavirus)黃病毒科(FlariviridueFamily)實(shí)例包括(醫(yī)學(xué))登革病毒(denguevirus)、黃熱病毒(yellowfevervirus)、日本腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus)、圣路易斯腦炎病毒(St.Louisencephalitisvirus)和蜱傳腦炎病毒(tickborneencephalittsvirus)。西尼羅病毒(WestNilevirus)(GenbankNC001563，AF533540，AF404757，AF404756，AF404755，AF404754，AF404753，AF481864，M12294，AF317203，AF196835，AF260969，AF260968，AF260967，AF206518和AF202541)代表性靶抗原ENS5C丙型肝炎病毒(醫(yī)學(xué))這類病毒不在一個(gè)科內(nèi)，但是據(jù)信仍是披膜病毒(togavirus)或黃病毒(flavivirus)。與披膜病毒科最相似。冠狀病毒科(CoronavirusFamily)(醫(yī)學(xué)和獸醫(yī))傳染性支氣管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus)(家禽)豬傳染性胃腸病毒(Porcinetransmissiblegastroentericvirus)(豬)豬血凝腦脊髓炎病毒(Porcinehemaglutinatingencephalomyelitisvirus)(豬)貓傳染性腹膜炎病毒(Felineinfectiousperitonitisvirus)(貓)貓腸道冠狀病毒(Felineentericcoronavirus)(貓)犬冠狀病毒(Caninecoronavirus)(狗)SARS相關(guān)性冠狀病毒(SARSassociatedcoronavirus)人呼吸道冠狀病毒(Humanrespiratorycoronavirus)引起約40種感冒EX.224E，OC43注釋-冠狀病毒可引起非甲、非乙或非丙型肝炎靶抗原E1-也稱為M或基質(zhì)蛋白E2-也稱為S或刺突(Spike)蛋白E3-也稱為BE或hemagglutin-elterose糖蛋白(不存在于所有冠狀病毒中)N-核殼彈狀病毒科(RhabdovirusFamily)屬水皰病毒屬(vesiliovirus)狂犬病毒屬(Lyssavirus)(醫(yī)學(xué)和獸醫(yī))狂犬病靶抗原G蛋白N蛋白絲狀病毒科(FiloviridueFamily)(醫(yī)學(xué))出血熱病毒(Hemorrhagicfevervirus)，例如馬爾堡病毒(Marburgvirus)和埃博拉病毒(Ebolavirus)副粘病毒科(ParamyxovirusFamily)屬副粘病毒屬(Paramyxovirus)(醫(yī)學(xué)和獸醫(yī))腮腺炎病毒(Mumpsvirus)、新城疫病毒(NewCastlediseasevirus)(雞的重要病原體)麻疹病毒屬(Morbillivirus)(醫(yī)學(xué)和獸醫(yī))麻疹、犬瘟熱肺病毒屬(Pneuminvirus)(醫(yī)學(xué)和獸醫(yī))呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytialvirus)正粘病毒科(OrthomyxovirusFamily)(醫(yī)學(xué))流感病毒(Influenzavirus)布尼亞病毒科(BungavirusFamily)屬布尼亞病毒屬(Bungavirus)(醫(yī)學(xué))加州腦炎病毒(CaliforniaencephalitisvirusLACrosse)白蛉熱病毒屬(Phlebovirus)(醫(yī)學(xué))立夫特山谷熱病毒(RiftValleyFevervirus)漢坦病毒屬(Hantavirus)Puremala是一種出血熱病毒納伊羅病毒(Nairvirus)(獸醫(yī))內(nèi)羅畢綿羊病還有許多未命名的布尼亞病毒沙粒病毒科(ArenavirusFamily)(醫(yī)學(xué))LCM，拉沙熱病毒(Lassifevervirus)呼腸孤病毒科(ReovirusFamily)屬呼腸孤病毒屬(Reovirus)可能的人病原體輪狀病毒屬(Rotavirus)小兒急性胃腸炎環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)(醫(yī)學(xué)和獸醫(yī))科羅拉多蜱熱、Lebombo(人)馬器質(zhì)性腦病、藍(lán)舌逆轉(zhuǎn)病毒科(RetrovirusFamily)亞科致癌RNA病毒亞科(Oncorivirinal)(獸醫(yī))(醫(yī)學(xué))貓白血病病毒(felineleukemiavirus)、HTLVI和HTLVII慢病毒亞科(Lentivirinal)(醫(yī)學(xué)和獸醫(yī))HIV、貓免疫缺陷病毒(felineimmunodeficiencyvirus)、馬傳染性貧血病毒(equineinfections，anemiavirus)泡沫病毒亞科(Spumavirinal)乳多空病毒科(PapovavirusFamily)亞科多瘤病毒屬(Polyomavirus)(醫(yī)學(xué))BKU和JCU病毒亞科乳頭瘤病毒屬(Papillomavirus)(醫(yī)學(xué))癌癥或惡性乳頭瘤相關(guān)的許多病毒類型腺病毒(Adenovirus)(醫(yī)學(xué))EXAD7，ARD.，O.B.—引起呼吸道疾病—某些腺病毒例如275引起腸炎細(xì)小DNA病毒科(ParvovirusFamily)(獸醫(yī))貓細(xì)小DNA病毒(Felineparvovirus)引起貓腸炎貓腸炎病毒(Felinepanleucopeniavirus)犬細(xì)小DNA病毒(Canineparvovirus)豬細(xì)小DNA病毒(Porcineparvovirus)皰疹病毒科(HerpesvirusFamily)亞科甲型皰疹病毒亞科(Alphaherpesviridue)屬單純皰疹病毒屬(Simplexvirus)(醫(yī)學(xué))HSVI(GenbankX14112，NC001806)，HSVII(NC001798)水痘病毒屬(Varicellovirus)(醫(yī)學(xué)獸醫(yī))偽狂犬病-水痘-帶狀皰疹亞科乙型皰疹病毒亞科(Betaherpesviridue)屬巨細(xì)胞病毒屬(Cytomegalovirus)(醫(yī)學(xué))HCMV鼠巨細(xì)胞病毒屬(Muromegalovirus)亞科丙型皰疹病毒亞科(Gammaherpesviridue)屬淋巴隱伏病毒屬(Lymphocryptovirus)(醫(yī)學(xué))EBV-(伯基特淋巴瘤(Burkittslympho))蛛猴皰疹病毒屬(Rhadinovirus)痘病毒科(PoxvirusFamily)亞科脊椎動(dòng)物痘病毒亞科(Chordopoxviridue)(醫(yī)學(xué)-獸醫(yī))屬天花病毒屬(Variola)(天花)痘苗病毒屬(Vaccinia)(牛痘)副痘病毒屬(Parapoxivirus)-獸醫(yī)禽痘病毒屬(Auipoxvirus)-獸醫(yī)山羊痘病毒屬(Capripoxvirus)野兔痘病毒屬(Leporipoxvirus)豬痘病毒屬(Suipoxvirus)亞科昆蟲痘病毒亞科(Entemopoxviridue)嗜肝DNA病毒科(HepadnavirusFamily)乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus)未分類丁型肝炎病毒(hepatitisdeltavirus)表2細(xì)菌病原體致病性革蘭氏陽(yáng)性球菌包括肺炎球菌(pneurnococcal)；葡萄球菌(staphylococcal)；和鏈球菌(streptococcal)。致病性革蘭氏陰性球菌包括腦膜炎球菌(menignococcal)；和淋病球菌(gonococcal)。致病性革蘭氏陰性腸桿菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)；假單胞菌屬(pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(acinetobacteria)和艾肯氏菌屬(eikenella)、melioidosis；沙門氏菌屬(sahnonella)；志賀氏菌屬(shigellosis)；嗜血桿菌屬(hemophilus)；軟下疳菌屬(chancroid)；布魯氏菌屬(brucellosis)；土拉熱菌屬(tularemia)；耶爾森氏菌屬(yersinia(巴斯德氏菌屬(pasteurella))；念球狀鏈桿菌(streptobacillusmortiliformis)和螺菌屬(spirillum)；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)；豬紅斑丹毒絲菌(erysipelothrixrhusiopathiae)；白喉(diphtheria)、霍亂(cholera)、炭疽(anthrax)；性病肉芽腫(donovanosis(腹股溝肉芽腫(granulomainguinale))；和巴爾通體病(bartonellosis)。致病性厭氧菌包括破傷風(fēng)(tetanus))；肉毒中毒(botulism)；其它梭狀芽孢桿菌；結(jié)核(tuberculosis)；麻風(fēng)(leprosy)；和其它分枝桿菌。致病性螺旋體病包括梅毒(syphilis)；—密螺旋體病(treponematoses)雅司病(yaws)、品他病(pinta)和地方性梅毒；和鉤端螺旋體病(leptospirosis)。由高等病原菌和致病性真菌引起的其它感染包括放線菌病(actinomycosis)；諾卡氏菌病(nocardiosis)；隱球菌病(cryptococcosis)、芽生菌病(blastomycosis)、組織胞漿菌病(histoplasmosis)和球孢子菌病(coccidioidomycosis)；念珠菌病(candidiasis)、曲霉病(aspergillosis)和毛霉病(mucormycosis)；孢子絲菌病(sporotrichosis)；類球孢子菌病(paracoccidiodomycosis)、petriellidiosis、球擬酵母菌病(torulopsosis)、足分支菌病(mycetoma)和著色真菌病(chromomycosis)；和皮膚真菌病(dermatophytosis)。立克次氏體感染包括立克次氏體病(rckettsial和rickettsioses)。支原體(mycoplasma)和衣原體(chlamydial)感染包括肺炎支原體(mycoplasmapneurnoniae)；性病性淋巴肉芽腫瘤(lymphogranulomavenereum)；鸚鵡熱(psittacosis)；和圍產(chǎn)期衣原體感染。致病性真核生物致病性原生動(dòng)物和寄生蟲及其感染包括阿米巴病(amebiasis)；瘧疾(malaria)；利什曼病(leishmaniasis)；錐蟲病(trypanosomiasis)；弓形體病(toxoplasmosis)；卡氏肺囊蟲(pneumocystiscarinii)；巴貝蟲病(babesiosis)；賈第鞭毛蟲病(giardiasis)；旋毛蟲病(trichinosis)；絲蟲病(filariasis)；血吸蟲病(schistosomiasis))；線蟲(nematode)；吸蟲(trematode或fluke)；和絳蟲(cestode(tapeworm))感染。序列表<110>賓夕法尼亞州大學(xué)信托人(TheTrusteesoftheUniversityofPennsylvania)<120>編碼IgE信號(hào)肽和/或IL-15的核酸序列與包含IgE信號(hào)肽和/或IL-15的組合物及其使用方法<130>UPAP0020-500<150>US60/478,205<151>2003-06-13<150>US60/478,210<151>2003-06-13<160>9<170>PatentInversion3.2<210>1<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>化學(xué)合成的肽<400>1AlaMetGlnMetLeuLysGluThrMetGluGluAlaAlaGlu1510<210>2<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>化學(xué)合成的肽<400>2AlaMetGlnMetLeuLysGluThrIle15<210>3<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>化學(xué)合成的肽<400>3PheArgAspValAspArgPheTyrLysThrArgAlaGlu1510<210>4<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物<400>4gcccccgtcgacgccgccaccatgagaatttcgaaaccacatttgag47<210>5<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物<400>5atcgggctcgagtcaagaagtgttgatgaacatttgg37<210>6<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物<400>6gcccccggtaccgccgccaccatggtattgggaaccata39<210>7<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物<400>7atcgggggatcctcaagaagtgttgatgaacat33<210>8<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物<400>8gcccccgaattcgccgccaccatggattggacttggatcttattttt47<210>9<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸引物<400>9agttgctgctgctactagagttcattctaactgggtgaatgtaataagt49權(quán)利要求1.一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含編碼包含與白介素(IL)-15蛋白或其功能性片段連接的非IL-15信號(hào)肽的非免疫原性融合蛋白的核酸序列；或者所述核酸分子包含編碼包含與IL-15蛋白或其功能性片段連接的非IL-15信號(hào)肽的融合蛋白的核酸序列，其中所述非IL-15信號(hào)肽與所述IL-15來(lái)自相同物種的基因。2.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述非IL-15信號(hào)肽是IgE信號(hào)肽。3.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述融合蛋白由與IL-15蛋白或其功能性片段連接的非IL-15信號(hào)肽組成。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，其中所述IL-15蛋白或其功能性片段是缺乏IL-15信號(hào)肽的IL-15蛋白或缺乏IL-15信號(hào)肽的IL-15蛋白的功能性片段。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，其中編碼所述IL-15蛋白或其功能性片段的核酸序列缺乏IL-15Kozak區(qū)和/或IL-155′非翻譯區(qū)和/或IL-153′非翻譯區(qū)。6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，所述核酸分子還包含編碼CD40L或其功能性片段的核苷酸序列。7.一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含編碼IL-15蛋白或其功能性片段的核酸序列和編碼CD40L或其功能性片段的核苷酸序列。8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，所述核酸分子還包含編碼免疫原的核酸序列。9.權(quán)利要求8的分離的核酸分子，其中所述免疫原是病原體抗原、癌相關(guān)抗原或涉及自身免疫性疾病的細(xì)胞相關(guān)抗原。10.權(quán)利要求9的分離的核酸分子，其中所述免疫原是病原體抗原。11.權(quán)利要求10的分離的核酸分子，其中所述病原體抗原是從選自以下的病原體來(lái)的人免疫缺陷病毒(HIV)、HSV、HCV和WNV。12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，其中IL-15編碼序列缺乏IL-15信號(hào)肽。13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，其中IL-15編碼序列缺乏IL-15Kozak區(qū)和/或IL-155＇非翻譯區(qū)和/或IL-153＇非翻譯區(qū)。14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，其中所述分離的核酸分子是質(zhì)粒。15.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的核酸分子，所述核酸分子摻入到病毒載體中。16.一種組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的核酸分子和包含編碼免疫原的核酸序列的核酸分子。17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述免疫原是病原體抗原、癌相關(guān)抗原或涉及自身免疫性疾病的細(xì)胞相關(guān)抗原。18.權(quán)利要求17的組合物，其中所述免疫原是病原體抗原。19.權(quán)利要求18的組合物，其中所述病原體抗原是從選自以下的病原體來(lái)的HIV、HSV、HCV和WNV。20.一種組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的核酸分子并且還包含編碼CD40L的核苷酸序列的核酸分子。21.一種注射用藥物組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的核酸分子或權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)的組合物。22.一種重組疫苗，所述疫苗包含權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的核酸分子。23.權(quán)利要求22的重組疫苗，其中所述重組疫苗是重組痘苗病毒疫苗。24.一種減毒活病原體，其中包含權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的核酸分子。25.一種包含與IL-15蛋白序列連接的非IL-15信號(hào)序列的非免疫原性融合蛋白或者一種包含與IL-15蛋白序列連接的非IL-15信號(hào)序列的融合蛋白，其中所述非IL-15信號(hào)序列與所述IL-15蛋白序列來(lái)自相同的物種。26.權(quán)利要求25的融合蛋白，其中所述非IL-15信號(hào)序列是IgE信號(hào)序列。27.權(quán)利要求25或26的融合蛋白，所述融合蛋白由與IL-15蛋白序列連接的非IL-15信號(hào)序列組成。28.權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)的融合蛋白，其中所述IL-15蛋白序列缺乏IL-15信號(hào)序列。29.一種組合物，所述組合物包含兩種核酸分子，第一種核酸分子包含編碼IL-15蛋白的核酸序列，第二種核酸分子包含編碼CD40L蛋白的核苷酸序列。30.權(quán)利要求29的組合物，所述組合物還包含編碼免疫原的核酸序列。31.權(quán)利要求29或30的組合物，其中所述免疫原是病原體抗原、癌相關(guān)抗原或涉及自身免疫性疾病的細(xì)胞相關(guān)抗原。32.權(quán)利要求31的組合物，其中所述免疫原是病原體抗原。33.權(quán)利要求32的組合物，其中所述免疫原是從選自以下病原體來(lái)的病原體抗原HIV、HSV、HCV和WNV。34.權(quán)利要求29-33中任一項(xiàng)的組合物，其中所述分離的核酸分子是質(zhì)粒。35.一種調(diào)節(jié)個(gè)體免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體權(quán)利要求58或63的組合物。36.一種誘導(dǎo)個(gè)體產(chǎn)生抗免疫原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體權(quán)利要求59、62或64-67中任一項(xiàng)的組合物。37.一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白由與非IgE蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽組成，其中所述IgE信號(hào)肽和所述非IgE蛋白序列來(lái)源于相同物種的動(dòng)物。38.一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白由與非IgE蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽組成，其中所述非IgE蛋白是酶或其功能性片段。39.一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白由與非IgE蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽組成，其中所述非IgE蛋白是免疫調(diào)節(jié)蛋白或其功能性片段。40.權(quán)利要求39的分離的核酸分子，其中所述融合蛋白由與免疫調(diào)節(jié)蛋白或其功能性片段連接的IgE信號(hào)肽組成。41.權(quán)利要求39-40中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，其中所述IgE信號(hào)肽和所述非IgE蛋白序列來(lái)源于相同物種的動(dòng)物。42.權(quán)利要求39-41中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，其中所述分離的核酸分子是質(zhì)粒。43.權(quán)利要求39-41中任一項(xiàng)的核酸分子，所述核酸分子摻入到病毒載體中。44.一種注射用藥物組合物，所述組合物包含權(quán)利要求39-41中任一項(xiàng)的核酸分子。45.一種重組疫苗，所述疫苗包含權(quán)利要求39-41中任一項(xiàng)的核酸分子。46.一種減毒活病原體，其中包含權(quán)利要求39-41中任一項(xiàng)的核酸分子。47.一種融合蛋白，所述蛋白包含與非IgE蛋白連接的IgE信號(hào)肽，其中所述IgE信號(hào)肽和所述非IgE蛋白來(lái)源于相同物種的動(dòng)物。48.一種融合蛋白，所述蛋白包含與非IgE蛋白連接的IgE信號(hào)肽，其中所述非IgE蛋白是酶或其功能性片段。49.權(quán)利要求47的融合蛋白，其中所述非IgE蛋白序列是免疫調(diào)節(jié)蛋白或其功能性片段。50.權(quán)利要求47的融合蛋白，所述蛋白由與免疫調(diào)節(jié)蛋白或其功能性片段連接的IgE信號(hào)肽組成。51.權(quán)利要求49或50的融合蛋白，其中所述IgE信號(hào)肽和所述非IgE蛋白來(lái)源于相同物種的動(dòng)物。52.一種體外細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞培養(yǎng)物包括含編碼融合蛋白的核酸序列的核酸分子的細(xì)胞，所述融合蛋白由與非IgE蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽組成，其中所述核酸序列在所述細(xì)胞中與表達(dá)所需的調(diào)節(jié)元件操作性連接。53.一種制備非IgE蛋白的方法，所述方法包括將細(xì)胞在融合蛋白表達(dá)所需的條件下培養(yǎng)足夠時(shí)間，所述細(xì)胞包括含編碼融合蛋白的核酸序列的核酸分子的細(xì)胞，所述融合蛋白由與非IgE蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽組成，其中所述核酸序列在所述細(xì)胞中與表達(dá)所需的調(diào)節(jié)元件操作性連接，所述培養(yǎng)時(shí)間足以讓所述細(xì)胞表達(dá)所述融合蛋白。全文摘要公開(kāi)了融合蛋白和編碼融合蛋白的核酸分子。公開(kāi)了包含與IL－15蛋白序列連接的非IL－15信號(hào)肽的融合蛋白和包含與非IgE蛋白序列連接的IgE信號(hào)肽的融合蛋白。公開(kāi)了包含所述核酸分子的載體以及包含所述載體的宿主細(xì)胞；還公開(kāi)了編碼融合蛋白的重組疫苗和減毒活病原體及其使用方法。公開(kāi)了在給予IL－15和CD40L之后，在有或沒(méi)有免疫原的情況下的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，也公開(kāi)了用于傳遞所述蛋白的各種核酸分子及其組合物與所述組合物的使用方法。文檔編號(hào)C07K14/705GK1832956SQ200480022891公開(kāi)日2006年9月13日申請(qǐng)日期2004年6月14日優(yōu)先權(quán)日2003年6月13日發(fā)明者D·B·維納,M·庫(kù)茨勒,A·K·楚,J·楊,J·D·博伊爾申請(qǐng)人:賓夕法尼亞州大學(xué)信托人