一種抑制her-2表達(dá)的核酸脂質(zhì)體納米藥物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抑制HER-2表達(dá)的核酸脂質(zhì)體納米藥物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，乳腺癌已經(jīng)成為全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，約占全身所患腫瘤的7%-10%，其中40%患者HER-2/neu(表皮生長因子家族成員)表達(dá)結(jié)果為陽性。目前，乳腺癌的治療方法逐漸發(fā)展成為按腫瘤特征(如針對HER-2陽性患者)而進(jìn)行個(gè)體化治療。曲妥珠單抗是一種以HER-2受體細(xì)胞外位點(diǎn)為靶標(biāo)的重組人源IgG單克隆抗體，它能夠結(jié)合細(xì)胞膜上HER-2蛋白，抑制磷酸?；〈?3-激酶和絲裂原活化蛋白激酶，從而抑制細(xì)胞周期和抑制腫瘤生長。曲妥珠單抗的臨床治療取得了較好效果，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)經(jīng)曲妥珠單抗治療的患者，產(chǎn)生較大的耐藥性。
[0003]開發(fā)高效低毒，靶向性好的基于抑制HER-2的核酸藥物輸送體系一直是廣大科學(xué)家的努力方向。病毒載體在細(xì)胞中有很高的轉(zhuǎn)染效率，然而，相關(guān)研究表明病毒載體可以引起非特異性免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，并且病毒載體在細(xì)胞內(nèi)的多拷貝復(fù)制有可能激活原癌基因，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，進(jìn)而引發(fā)腫瘤。為了克服病毒載體在臨床基因治療中的缺陷，非病毒載體作為替代物，在將核酸藥物傳輸進(jìn)活體動物方面具有很大潛能。脂質(zhì)體作為藥物傳輸載體廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室和臨床。但目前應(yīng)用于乳腺癌治療的脂質(zhì)體大多半衰期較短，價(jià)格昂貴，藥物包封率較低等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明需要解決的問題就是公開了一種有效的治療小鼠乳腺癌的基于抑制HER-2表達(dá)的核酸脂質(zhì)體藥物及其制備方法。
[0005]本發(fā)明通過控制二十聚甘油單油酸酯與N，Y-羰基二咪唑(⑶I)的摩爾質(zhì)量比，得到了不同程度氨基修飾的陽離子二十聚甘油單油酸酯，通過實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，其中陽離子脂質(zhì)體(CDGMS-21)具有腫瘤靶向作用、緩釋作用、降低藥物毒性作用和提高藥物穩(wěn)定性的作用，與Lipofectamine 2000相比，這種新型的核酸脂質(zhì)體具有較小的粒徑和適當(dāng)?shù)谋砻骐娢?，且?xì)胞毒性明顯較小，小鼠的耐受度較高，可以用于動物體內(nèi)。
[0006]本發(fā)明所述的核酸脂質(zhì)體納米藥物，是由一種抑制HER-2表達(dá)的核酸藥物和陽離子脂質(zhì)體(CDGMS-21)構(gòu)成的納米復(fù)合物，其中抑制HER-2的核酸藥物為一種可轉(zhuǎn)錄表達(dá)HER-2干擾RNA的質(zhì)粒，該質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)可高度特異性地導(dǎo)致HER_2mRNA基因沉默；陽離子脂質(zhì)體是以二十聚甘油單硬脂酸酯為原料。
[0007]本發(fā)明中使用的基于HER-2表達(dá)抑制的核酸藥物包括:可轉(zhuǎn)錄表達(dá)HER-2干擾RNA的質(zhì)粒，可轉(zhuǎn)錄表達(dá)HER-2干擾RNA的病毒載體，化學(xué)合成的HER-2 siRNA片段。本次實(shí)驗(yàn)中采用的基于HER-2表達(dá)抑制的核酸藥物為可轉(zhuǎn)錄表達(dá)HER-2干擾RNA的質(zhì)粒，但是不應(yīng)視為對基于HER-2表達(dá)抑制的核酸藥物使用種類的限制。
[0008]本發(fā)明中核酸脂質(zhì)體藥物(即可轉(zhuǎn)錄表達(dá)HER-2干擾RNA的質(zhì)粒和⑶GMS-21構(gòu)成的脂質(zhì)體給藥體系)采用尾靜脈給藥給予合適劑量。該試劑的有效量是能導(dǎo)致乳腺癌癥狀明顯降低的劑量。
[0009]本發(fā)明通過動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對乳腺癌療效進(jìn)行例證。此處的動物包括但是不限于:小鼠，大鼠，馴養(yǎng)動物包括但是不限于貓，狗，以及其它一些動物包括但是不限于牛，羊，豬，馬，靈長類動物包括但是不限于猴子和人。小鼠腋下植瘤的乳腺癌模型是被廣泛認(rèn)可和接受的體內(nèi)藥物活性檢測模型，同時(shí)也可以為其它生物包括但是不局限人提供參考。
[0010]下面的部分以描述這項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)容，但是不應(yīng)該被視作對這項(xiàng)發(fā)明的功能范圍的限定。
[0011 ]本發(fā)明所述的由可轉(zhuǎn)錄表達(dá)HER-2干擾RNA的質(zhì)粒/⑶GMS-21構(gòu)成的核酸脂質(zhì)體納米藥物的制備方法，在可轉(zhuǎn)錄表達(dá)HER-2干擾RNA的質(zhì)粒溶液中加入適量CDGMS-21，攪拌混勻，室溫靜置20分鐘，即可制得核酸脂質(zhì)體納米藥物，通過Zeta電位儀測得電位和粒徑。
[0012]本發(fā)明所述的由可轉(zhuǎn)錄表達(dá)HER-2干擾RNA的質(zhì)粒/⑶GMS-21構(gòu)成的核酸脂質(zhì)體納米藥物在小鼠乳腺癌腫瘤模型治療中的應(yīng)用:
[0013](I )BALB/C小鼠腋下4T1細(xì)胞植瘤
[0014](2)小鼠乳腺癌腫瘤模型建立5天后，腫瘤直徑大約在0.3-0.5厘米左右，將預(yù)先制備好的核酸脂質(zhì)體納米藥物通過尾靜脈給藥的方式注入小鼠體內(nèi)
[0015](3)每隔三天給藥一次，一共給藥4次，15天后，分離腫瘤測量
[0016]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明首次采用陽離子脂質(zhì)體(CDGMS-21)和一種可轉(zhuǎn)錄表達(dá)HER-2干擾RNA的質(zhì)粒來制備一種新型核酸脂質(zhì)體藥物，并應(yīng)用于小鼠乳腺癌治療。該種新型的包裹核酸脂質(zhì)體微粒，應(yīng)用于活體實(shí)驗(yàn)動物而不致死，并且能顯著減小小鼠實(shí)體瘤體積，實(shí)驗(yàn)動物生理機(jī)能有明顯改善，該新型納米藥物大大提高了核酸藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性;該核酸納米藥物通過尾靜脈給藥能直接下調(diào)小鼠乳腺癌腫瘤中HER-2的水平，明顯緩解小鼠乳腺癌腫瘤癥狀。本發(fā)明為乳腺癌疾病開發(fā)了一種療效顯著的核酸納米新藥。
【附圖說明】
[0017]圖1核酸脂質(zhì)體納米復(fù)合物粒徑圖
[0018]圖2核酸脂質(zhì)體納米復(fù)合物電位圖
[0019]圖3脂質(zhì)體包裹GFP質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光照片
[0020]圖4核酸脂質(zhì)體藥物治療小鼠乳腺癌的腫瘤實(shí)物圖
[0021]A.生理鹽水組
[0022]B.可轉(zhuǎn)錄表達(dá)HER-2干擾RNA組
[0023]C.CDGMS-21組
[0024]D.可轉(zhuǎn)錄表達(dá) HER-2 干擾 RNA/CDGMS-21 組
[0025]圖5核酸脂質(zhì)體藥物治療小鼠乳腺癌的腫瘤體積圖
[0026]A.生理鹽水組
[0027]B.可轉(zhuǎn)錄表達(dá)HER-2干擾RNA組
[0028]C.CDGMS-21組
[0029]D.可轉(zhuǎn)錄表達(dá) HER-2 干擾 RNA/CDGMS-21 組
[0030]圖6核酸脂質(zhì)體藥物治療小鼠乳腺癌的腫瘤重量圖
[0031]A.生理鹽水組
[0032]B.可轉(zhuǎn)錄表達(dá)HER-2干擾RNA組
[0033]C.CDGMS-21組
[0034]D.可轉(zhuǎn)錄表達(dá) HER-2 干擾 RNA/CDGMS-21 組
【具體實(shí)施方式】
[0035]1.材料來源
[0036]雌性BALB/c小鼠(16-18g)，購自北京軍事醫(yī)學(xué)院動物中心。小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1購自上海細(xì)胞研究院細(xì)胞資源中心。二十聚甘油單硬脂酸酯和N，Y-羰基二咪