一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物材料工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及人體關(guān)節(jié)軟骨的組織工程支架制備技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，因創(chuàng)傷、感染、腫瘤及退變等導(dǎo)致的可動關(guān)節(jié)端軟骨缺損是骨科臨床常見疾病，常表現(xiàn)為頑固性疼痛、關(guān)節(jié)活動障礙，嚴(yán)重者可喪失運(yùn)動功能，并且軟骨損傷會導(dǎo)致進(jìn)一步的軟骨磨損和關(guān)節(jié)面的損壞。由于關(guān)節(jié)軟骨沒有血管、神經(jīng)和淋巴系統(tǒng)，直徑超過2?4mm的軟骨缺損幾乎不能完全自我修復(fù);且臨床上單純關(guān)節(jié)軟骨損傷比較少見，更多的是伴隨軟骨下骨的病變，包括創(chuàng)傷引起的軟骨下骨的缺損，骨軟骨炎病變引起的軟骨下骨的壞死，軟骨退變引起的軟骨下骨的硬化、脂肪變等。因此，在修復(fù)軟骨的同時還需修復(fù)軟骨下骨。傳統(tǒng)治療方法均存在諸多明顯缺陷:關(guān)節(jié)清理術(shù)暫時緩解癥狀，不能阻止病程發(fā)展;關(guān)節(jié)融合術(shù)、關(guān)節(jié)切除成形術(shù)使關(guān)節(jié)功能嚴(yán)重喪失;人工關(guān)節(jié)置換術(shù)存在遠(yuǎn)期骨溶解和假體松動等問題;關(guān)節(jié)鏡下骨軟骨移植術(shù)，自體移植造成供體區(qū)域缺損且來源有限、異體移植則存在排斥反應(yīng)及潛在傳染疾病等弊端;難以實現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的自然修復(fù)再生。組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨缺損的再生修復(fù)提供了新的解決方案。
[0003]用組織工程學(xué)方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨，在臨床研究或動物實驗研究中取得了一定的臨床效果，使得全層的關(guān)節(jié)損傷修復(fù)成為可能。目前組織工程骨軟骨支架材料設(shè)計主要分為以下幾類:1)骨采用支架而軟骨不采用支架，即在骨支架上方直接種植上高密度的軟骨細(xì)胞或成軟骨細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)后植入或者不經(jīng)體外培養(yǎng)直接植入體內(nèi)對關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨缺損進(jìn)行修復(fù);2)采用適合骨、軟骨構(gòu)建的兩種支架材料，分別在體外培養(yǎng)形成組織工程骨和軟骨，然后粘合、或手術(shù)縫合、或順序植入等方法將組織工程骨和軟骨部分組裝成組織工程骨軟骨復(fù)合體；3)骨和軟骨部分皆采用相同的支架材料的一體化單層支架;4)骨軟骨部分分別采用兩種不同的支架材料構(gòu)建的一體化的雙層支架。而其中一體化雙層支架，其骨和軟骨支架層的成分及結(jié)構(gòu)是根據(jù)骨和軟骨生長的需要而設(shè)計的，因而這種一體化的組織工程骨軟骨復(fù)合支架具有更優(yōu)良的特性。
[0004]組織工程骨軟骨支架材料存在的主要問題是構(gòu)建的骨和軟骨的界面結(jié)合較差以及支架種植體與周圍宿主骨軟骨整合性能不佳，而且關(guān)節(jié)軟骨構(gòu)建后的功能不理想。導(dǎo)致以上問題的主要原因與目前支架材料的設(shè)計缺陷有關(guān)?？v觀自然關(guān)節(jié)組織的構(gòu)造，它包含了軟骨區(qū)、軟骨鈣化區(qū)和骨化區(qū)等多個區(qū)域，其組織和結(jié)構(gòu)是逐漸過渡的，沒有明顯的界面，因而力學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。反觀目前組織工程骨軟骨體支架材料的設(shè)計，骨和軟骨部分沒有過渡區(qū)，在界面處楊氏模量無法匹配，因而界面處容易導(dǎo)致應(yīng)力集中。此外，這種設(shè)計亦難以實現(xiàn)種植體與周圍宿主骨軟骨較好的整合。這足以說明軟骨鈣化層是組織工程骨軟骨支架材料設(shè)計不可缺少的要素。因此，要解決骨和軟骨界面的結(jié)合問題，必須在骨和軟骨間引入過渡層，即軟骨鈣化層。軟骨鈣化層的引入不僅有利于骨和軟骨界面的楊氏模量的匹配，也由于種植體與周圍宿主骨軟骨組織結(jié)構(gòu)更加相似而有助于種植體與周圍宿主骨軟骨間的界面整合。此外，作為骨軟骨過渡界面的軟骨鈣化層是一種物理屏障，還起到了阻斷血管侵入軟骨的作用，是防止全層缺損骨化及軟骨修復(fù)不可缺少的條件。目前為此，軟骨鈣化層研究主要大多聚焦在深層軟骨細(xì)胞的研究中，或通過深層軟骨細(xì)胞在礦化基質(zhì)的培養(yǎng)構(gòu)建軟骨鈣化層，或是通過深層軟骨細(xì)胞在單層礦化基質(zhì)的培養(yǎng)構(gòu)建軟骨鈣化層，這些研究發(fā)現(xiàn)礦化基質(zhì)以及含有磷酸鈣顆粒的基質(zhì)有利于軟骨鈣化層的形成。這些研究僅孤立地對軟骨鈣化層進(jìn)行研究而忽略了骨層和淺層軟骨細(xì)胞層及其代謝對軟骨鈣化層的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架，它能有效地解決關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的重建問題，有利于體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨全層缺損的修復(fù)。
[0006]本發(fā)明的另一個目的是提供一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架的制備方法。它能有效地解決組織工程骨軟骨復(fù)合支架制備成形問題。
[0007]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
[0008]一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架，通過分別制備其復(fù)合溶膠，復(fù)合支架的軟骨支架層為上層復(fù)合溶膠，它是在接枝了 RGD(精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸三肽序列)的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸鈉與N-琥珀酰殼聚糖復(fù)合形成的溶膠基體中均勻混入生長因子和納米同軸短纖維及軟骨細(xì)胞懸浮液的方式，并對生長因子進(jìn)行聯(lián)合序貫使用構(gòu)建而成;復(fù)合支架的軟骨鈣化層為中間層復(fù)合溶膠，它是在接枝了 RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸鈉與N-琥珀酰殼聚糖復(fù)合形成的溶膠基體中均勻混入微米羥基磷灰石、載生長因子的納米同軸短纖維和軟骨肥大細(xì)胞懸浮液的方式，對生長因子進(jìn)行緩釋構(gòu)建而成;復(fù)合支架的骨支架層為底層復(fù)合溶膠，它是在接枝了 RGD的氧化海藻酸鈉-海藻酸鈉與鈣離子交聯(lián)形成的溶膠基體中均勻混入納米羥基磷灰石、生長因子的納米同軸短纖維和成骨細(xì)胞懸浮液的方式，對生長因子進(jìn)行緩釋構(gòu)建而成;將上述三種功能層復(fù)合溶膠組裝在一起，構(gòu)成一體化組織工程骨軟骨復(fù)合支架，同時，在中間層和底層之間通過靜電紡絲的方式制備孔徑小于5μπι的多孔的細(xì)胞隔斷膜。
[0009]所述納米同軸纖維的內(nèi)軸為載生長因子的聚乙二醇，外軸為聚ε-己內(nèi)酯。
[0010]所述的納米同軸短纖維在骨組織支架層復(fù)合溶膠、軟骨組織鈣化層復(fù)合溶膠和軟骨組織支架層復(fù)合溶膠所載的生長因子分別為BMP-2、Wnt/i3-catenin和FGF-2。
[0011 ]本發(fā)明的另一個目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:一種組織工程骨軟骨復(fù)合支架的制備方法，包括以下步驟:
[0012]步驟一:載生長因子的納米同軸短纖維的制備，將聚ε-己內(nèi)酯溶于氯仿配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的聚合物溶液作為外軸，流速設(shè)置為0.5mL/h，將聚乙二醇溶于蒸餾水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 %的聚合物溶液并加入生長因子作為內(nèi)軸，流速設(shè)置為0.lmL/h，外加直流高電壓為20kV，以轉(zhuǎn)速為1200r/min的高速轉(zhuǎn)動的滾筒作為接收器，噴射針頭的外針頭內(nèi)徑為
1.1mm,內(nèi)針頭外徑為0.6mm，內(nèi)針頭內(nèi)徑0.3mm和滾筒邊緣的距離為15cm，制備得到定向的聚乙二醇/聚ε-己內(nèi)酯納米同軸纖維，真空干燥，將聚乙二醇/聚ε-己內(nèi)酯納米同軸纖維在-20°C環(huán)境下固定并用冰凍切片包埋劑包埋，再將包埋的聚乙二醇/聚己內(nèi)酯納米同軸纖維在-70°C下冷凍5min，通過冰凍切片機(jī)在-20°C環(huán)境下進(jìn)行冰凍切割。將冰凍切割后的聚乙二醇/聚ε-己內(nèi)酯納米同軸短纖維立即混懸于蒸餾水中，然后離心15min分離聚乙二醇/聚ε-己內(nèi)酯納米同軸短纖維;再抽濾洗滌三遍，將得到的載生長因子的聚乙二醇/聚ε-己內(nèi)酯納米同軸短纖維冷凍干燥，滅菌，備用。
[0013]步驟二:納米羥基磷灰石的制備，將硝酸鈣和磷酸氫二銨分別溶于蒸餾水中配成質(zhì)量體積比分別為11.8w/v%硝酸鈣溶液和6.58w/v%的磷酸氫二銨溶液，將硝酸鈣溶液與磷酸氫二銨溶液在攪拌下混合均勻并加入氨水調(diào)節(jié)至PH=11，然后向混合溶液中加入4?8g乙二胺四乙酸并在180°C條件下水熱6小時，然后抽濾、清洗、烘干，滅菌，備用。
[0014]步驟三:微米羥基磷灰石的制備，將硝酸鈣和磷酸氫二銨分別溶于蒸餾水中配成質(zhì)量體積比分別為11.8w/v%硝酸鈣溶液和6.58w/v%的磷酸氫二銨溶液，將硝酸鈣溶液與磷酸氫二銨溶液在攪拌下混合均勻并加入氨水調(diào)節(jié)至PH=11，然后向混合溶液中加入6?9g乙二胺四乙酸二鈉并在180°C條件下水熱10小時，然后抽濾、清洗、烘干，滅菌，備用。
[0015]步驟四:軟骨組織支架層的構(gòu)建，無菌條件下，將步驟一得到的且已滅菌的載生長因子的聚乙二醇/聚ε-己內(nèi)酯納米同軸短纖維以及生長因子和軟骨細(xì)胞懸浮液依次均勻地分散于接枝了 RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸鈉與Ν-琥珀酰殼聚糖復(fù)合形成的溶膠基體中，備用。
[0016]步驟五:軟骨組織鈣化層的構(gòu)建，無菌條件下，將上述步驟得到的且已滅菌的載生長因子的聚乙二醇/聚ε-己內(nèi)酯納米同軸短纖維、微米羥基磷灰石和軟骨肥大細(xì)胞懸浮液均勻地分散于接枝了 RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸鈉與Ν-琥珀酰殼聚糖復(fù)合形成的溶膠基體中，備用。
[0017]步驟六:多孔的細(xì)胞隔斷膜的構(gòu)建，將質(zhì)量比為20:1的聚乙二醇:聚ε_己內(nèi)酯溶于體積比為1:9的Ν，Ν-二甲基甲酰胺:二氯甲烷混合溶劑中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的聚合物溶液，流速設(shè)置為0.5mL/h，外加直流高電壓為15kV，以轉(zhuǎn)速為200r/min滾筒作為接收器，針頭和接收裝置的距離為15cm，制備得到一層纖維膜，真空干燥，滅菌，備用。
[0018]步驟七:骨組織支架層的構(gòu)建，無菌條件下，將上述步驟得到的且已滅菌的載生長因子的聚乙二醇/聚ε-己內(nèi)酯納米同軸短纖維、納米羥基磷灰石和成骨細(xì)胞懸浮液均勻地分散于接枝了 RGD的氧化海