誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化的組合物和方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物醫(yī)學工程領域，更具體地設及間充質干細胞向軟骨誘導的組合物 及誘導方法。
【背景技術】
[0002] 間充質干細胞是一類具有高度自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，具有很強 的自我復制能力及多向分化潛能，在一定誘導條件下可定向分化為成骨細胞、成軟骨細胞、 脂肪細胞等，近年來作為種子細胞和細胞載體被廣泛應用于軟骨組織工程和基因治療。
[0003] 目前采用間充質干細胞分化成軟骨細胞的方法一般是將間充質干細胞培養(yǎng)至傳 代的間充質干細胞后，再在含有定向誘導為軟骨細胞的因子的培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)，將 間充質干細胞誘導成軟骨細胞。但是由于間充質干細胞的定向誘導分化受很多不同信號通 路的影響，而且誘導培養(yǎng)間充質干細胞的細胞微環(huán)境變化對于間充質干細胞誘導分化及其 分子結構有著非常重要的影響。因此。導致現(xiàn)有的間充質干細胞分化成軟骨細胞的方法所 需周期都較長，通常需要2-4周，并且誘導后II型膠原的表達效率較低。
[0004] 舉例而言，關節(jié)軟骨因損傷而導致退變，甚至發(fā)生退行性骨關節(jié)炎，隨著人口的老 齡化骨關節(jié)炎的發(fā)病率正在逐漸增加。由于沒有神經、血管和淋己的分布，軟骨雖然有一定 的自我修復能力，但是大于5mmW上的局部軟骨損傷就很那進行自我修復，關節(jié)炎類軟骨疾 病一直不能得到很好的手術治療。軟骨組織的傳統(tǒng)修復方法是自體組織分離的軟骨細胞經 體外培養(yǎng)，但是卻面臨著成熟軟骨組織擴增能力有限，隨著傳代次數的增加，細胞逐漸老化 而喪失增殖能力，難W滿足組織構建需要和逐漸喪失其原有特性而分化成其他組織的問 題。而骨髓干細胞具有自我更新和多功能分化潛能的特性，在適當培養(yǎng)條件下可被誘導分 化成軟骨細胞，通過體細胞核轉移技術有可能提供無免疫原性的"通用型"種子細胞，運將 為軟骨疾病的治療提供大量的健康備用組織。干細胞向軟骨細胞的分化成為醫(yī)學界的熱點 研究問題之一。
[0005] CN101014699A公開了一種去分化型軟骨細胞向軟骨細胞的再分化用培養(yǎng)基，其用 于使去分化而軟骨特性減弱的去分化型軟骨細胞向原來的軟骨細胞再分化，含有膜島素和 從BMP-2及其類似物中選擇的至少一種。
[0006] CN101748095A公開了一種定向誘導軟骨細胞的方法，具體設及一種采用人類羊膜 上皮細胞定向誘導軟骨細胞的方法，其依據組織工程基因學原理，通過體外培養(yǎng)人羊膜上 皮細胞，進行羊膜上皮細胞的原代、傳代培養(yǎng)，觀察調整羊膜上皮細胞基因型，利用細胞因 子和BMP-7誘導和調控其定向誘導分化成軟骨細胞，通過分子生物學方法檢測誘導分化的 細胞的軟骨細胞特性及軟骨細胞活性，明確人羊膜上皮細胞定向誘導軟骨細胞的調控機 審IJ，結果表明人羊膜上皮細胞可W作為軟骨細胞誘導分化的種子源。
[0007] CN102399745A公開了一種軟骨干細胞分離培養(yǎng)方法，其中所述的軟骨干細胞為由 軟骨組織細胞篩選而來，經特定培養(yǎng)基培養(yǎng)條件維持的成纖維樣細胞，具骨、軟骨及脂肪分 化能力，與成體細胞相比還具有良好的擴增能力，自原代收獲后可傳至15代W上而保持原 來特性，其利用特定培養(yǎng)條件進行篩選，純化出軟骨干細胞，使軟骨干細胞含量在95 % W 上，此技術將促進軟骨組織性特異干細胞的收獲和應用于骨、軟骨組織工程。
[000引 CN103146645A公開了一種誘導間充質干細胞成為軟骨細胞的方法，包括如下步 驟:獲取間充質干細胞和軟骨細胞;將所述軟骨細胞接種于軟骨細胞培養(yǎng)液中進行培養(yǎng);將 所述間充質干細胞接種于插入式細胞培養(yǎng)皿中，再將接種有所述間充質干細胞的所述插入 式細胞培養(yǎng)皿置于所述軟骨細胞培養(yǎng)液中，并將所述軟骨細胞培養(yǎng)液更換成軟骨細胞誘導 分化培養(yǎng)基后進行共同培養(yǎng);其中，所述軟骨細胞誘導分化培養(yǎng)基中含有甲狀旁腺激素相 關蛋白1-34。
[0009] W02014/078579A1公開了一種用于將成纖維細胞分化成脂肪細胞的方法，其包括： a)在標準條件下將成纖維細胞在成纖維細胞培養(yǎng)基中生長至匯合;b)在第一分化細胞培養(yǎng) 基中培養(yǎng)所述細胞;C)在第二分化細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞;和d)確認脂肪細胞的存在。
[0010] "轉化生長因子0及周期性拉伸應變條件下骨髓間充質干細胞向軟骨樣細胞的分 化"，郝耀等，中國組織工程研究，2014(28)，研究了轉化生長因子0對骨髓間充質干細胞的 軟骨方向分化所具有顯著的誘導作用，研究發(fā)現(xiàn)，周期性拉伸應變可W模擬軟骨細胞在體 內的力學環(huán)境，對細胞的增殖和分化起著重要的調節(jié)作用，轉化生長因子e及周期性拉伸應 變在誘導骨髓間充質干細胞向軟骨樣細胞分化過程中是否具有協(xié)同作用。
[0011] CN102899287A公開了一種采用小球法誘導培養(yǎng)間充質干細胞的方法，該方法可W 制得無支架軟骨，通過定時晃動離屯、管使細胞球與管底分離，保證了細胞球與誘導分化培 養(yǎng)基充分接觸，細胞球中的間充質干細胞分化狀態(tài)均一，廝帶源間充質干細胞相對于常規(guī) 的骨髓源間充質干細胞分離制備簡便，來源豐富。然而，發(fā)現(xiàn)在該方法中，誘導的定向性仍 有待提高，例如仍含義一定量的脂肪細胞、基質細胞等其它細胞。本發(fā)明人在該專利的基礎 上，對其誘導成分進行改進，使得能夠更好地模擬體內多因素聯(lián)合調控的作用，更加有利于 促進其軟骨分化，同時通過引用將該專利全文并入本文。

【發(fā)明內容】

[0012] 為克服現(xiàn)有技術中存在的上述缺陷，本發(fā)明人在上述現(xiàn)有技術的基礎上，經過深 入研究和大量實驗，提出了如下技術方案。
[0013] 在本發(fā)明的一方面，提供了一種誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化的組合物，該 組合物包含:20-80測心抗壞血酸-2-憐酸醋，2-lOng/ml TGF盼，50-150nM地塞米松，10-50 μg/ml 維生素 C，10-50μg/ml 脯氨酸，0.5-5iig/ml 嗎 I 噪美辛axiTS+lpremix(即，10μg/ml Insulin,5.5]ig/ml transferrin,5ng/ml selenium,5.35jig/ml Iinoleic acid) ,0.S-IOu g/ml下式(I)所示的氯地孕酬醋，所述濃度是指在培養(yǎng)基中的濃度：
[0014]
[0015] 優(yōu)選地，該組合物包含：5化邑/1111心抗壞血酸-2-憐酸醋，5叫/1111了6邱3，100碰地 塞米松，2扣g/ml維生素C，20μg/ml脯氨酸，2.5iig/ml嗎I噪美辛，I X 口S+lpremix，化g/ml式 (I)所示的氯地孕酬醋。
[0016] 當然，本領域技術人員可W理解的是，所述組合物也可W是培養(yǎng)基與上述誘導組 分的組合。
[0017] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，氯地孕酬醋的濃度為化g/ml可W獲得最佳的分化效果(可例如參 見圖1)，濃度繼續(xù)增加，分化效果反而下降，運樣的效果是先前所未曾預料到的。
[0018] 本發(fā)明人經研究還發(fā)現(xiàn)，所述氯地孕酬醋可有效誘導間充質干細胞向軟骨細胞的 分化。在軟骨分化條件下，氯地孕酬醋可提高hBMSCs中ALP的活性，并且由成骨誘導后的茜 素紅S染色證實氯地孕酬醋提高了成熟成骨細胞中礦物質集聚和巧沉積(參見圖1)。
[0019] 優(yōu)選地，該組合物還包含IO-IOOiiM的0-甘油憐酸鋼。0-甘油憐酸鋼在培養(yǎng)液中迅 速被水解，產生大量憐酸離子，促進生理性巧鹽的沉積和巧化，是骨髓基質細胞誘導發(fā)生礦 化結節(jié)的必要條件，可W和維生素C 一起加速骨髓基質細胞向成骨細胞分化，促進巧化結節(jié) 的形成。
[0020] 優(yōu)選地，脯氨酸替換為左旋谷氨酷胺。
[0021] 在一個特別優(yōu)選的實施方式中，所述組合物還包含50-200iiM雪蓮和/或藏紅花的 提取物。所述雪蓮優(yōu)選為天山雪蓮。
[0022] 所述雪蓮和/或藏紅花的提取物通過如下方法制得：
[0023] (1)將干燥的雪蓮和/或藏紅花粉碎，然后加入為其體積約5-30倍的水和乙醇混合 物(水：乙醇= 1:1體積），攬拌均勻，之后置于60-90°C的恒溫水浴鍋中進行浸提，浸提時間 為1-5小時；
[0024] (2)將浸提后的混合物進行過濾，然后將濾液在不高于80°C的溫度下進行減壓濃 縮，獲得濃縮液；
[0025] (3)將上述濃縮液溶解在乙醇中，用乙酸乙醋/石油酸混合液(體積比為1:1-1: 3) 做流動相，經過大孔吸附樹脂進行層析純化，用硅膠柱進行層析純化，采用HPLC進行洗脫組 分的監(jiān)測，獲得經純化的提取物濃縮液；
[0026] (4)采用納濾將步驟(3)得到的經純化的提取物濃縮液再次進行純化分離，在低于 60°C的溫度下除去溶劑，得到固體形式的提取物。
[0027] 實驗結果證明所述提取物的加入，可明顯進一步增強干細胞向軟骨細胞的分化， 顯著促進Sox9的表達，誘導骨髓基質干細胞向軟骨細胞分化，還能增加細胞的collagen II、collagen X表達。
[0028] 另外，所述提取物含有直接刺激骨髓問充質干細胞不斷增殖的成分，例如東賞窘 素、0-谷醬醇，從而使骨髓間充質干細胞數量不斷增加，并誘導骨髓問充質干細胞不斷向軟 骨細胞分化，進而促進軟骨細胞分泌的II型膠原。
[0029] 此外，發(fā)現(xiàn)通過上述提取方法得到的提取物具有非常高的純度，能夠滿足誘導分 化的品質要求，而一般的提取方法例如簡單的水提取法或醇提取法，提取物會由于雜質的 存在導致分化受到嚴重抑制。
[0030] 在本發(fā)明中，該組合物優(yōu)選用作培養(yǎng)液(培養(yǎng)基）的成軟骨誘導劑，即成軟骨誘導 組合物。
[0031 ]所述培養(yǎng)液可W包括DMEM培養(yǎng)液、a-MEM培養(yǎng)液中的任一種。DMEM培養(yǎng)液可W是高 糖DMEM培養(yǎng)液、DMEM+10 % FBS培養(yǎng)基等。
[0032]在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種利用上述誘導組合物誘導間充質干細胞向軟 骨細胞分化的方法，其中，在15ml尖底離屯、管中使用小球法誘導培養(yǎng)間充質干細胞，并且每 隔約24小時輕輕晃動離屯、管一次，使細胞球與管底分離，使用的誘導分化培養(yǎng)基為高糖 DMEM加入前述組成和濃度的組合物。
[0033 ]優(yōu)選地，誘導分化培養(yǎng)時間為14-21天。
[0034] 優(yōu)選地，所述間充質干細胞為廝帶源間充質干細胞。
[0035] 在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法包 括W步驟：
[0036] 1)在每個75cm2培養(yǎng)瓶中加入13.5ml間充質干細胞生長培養(yǎng)基培養(yǎng)P3代廝