本發(fā)明涉及一種基于卡拉膠的多孔支架材料及其制備方法，屬于組織工程生物材料制備技術(shù)。

背景技術(shù)：

聚電解質(zhì)配合物(Polyelectrolyte Complex, PEC)是通過帶有相反電荷的聚電解質(zhì)很容易混合而成，即聚陽離子和聚陰離子之間通過庫侖力結(jié)合而形成。按形成PEC的材料類型來劃分，它可分為聚陽離子(Polycations)-聚陰離子(Polyanions)復(fù)合物、聚陰離子(Polyions)-兩性大分子(如蛋白質(zhì)等)復(fù)合物及兩性大分子-兩性大分子復(fù)合物等。由于其獨(dú)特的性能，已經(jīng)在藥物控制釋放、組織工程等領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用。天然細(xì)胞外基質(zhì)中含有多種多糖和蛋白質(zhì)，模擬細(xì)胞外基質(zhì)的多糖-蛋白質(zhì)聚電解質(zhì)配合物基支架材料是組織工程支架材料的首選。

卡拉膠是一類線性、含有硫酸酯基團(tuán)的陰離子多糖。具有重復(fù)的α-(1→4)-D-半乳吡喃-β-(1→3)-D-半乳吡喃糖（或3,6內(nèi)醚-D-半乳吡喃糖）二糖單元骨架結(jié)構(gòu)。根據(jù)結(jié)構(gòu)單元上硫酸酯基團(tuán)數(shù)量分為κ (kappa)、ι(iota)、λ (1ambda)三種類型。與重要生物粘多糖之一的硫酸軟骨素相比，卡拉膠有著與其相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。近期研究表明，在長期的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，卡拉膠體系可以促進(jìn)多種細(xì)胞的成活和增殖。與此同時(shí)卡拉膠還具有促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生有序的細(xì)胞外基質(zhì)的能力?？ɡz制備的凝膠可以很好的促進(jìn)封裝細(xì)胞的生長和分化。這些結(jié)果表明支架材料中加入卡拉膠成分有益于促進(jìn)三維細(xì)胞培養(yǎng)，從而能在組織工程中得以廣泛使用。因此，研制基于卡拉膠的多孔支架材料在組織工程研究中具有潛在的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于卡拉膠的組織工程用支架材料。

本發(fā)明的目的還在于提供上述新型多孔支架材料的制備方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一、兼具導(dǎo)電和抗氧化性能的苯胺五聚體-谷胱甘肽復(fù)合物合成

(1) 將一定量的殼聚糖（分子量5-60 萬，脫乙酰度大于85％）溶于1%的醋酸中，磁力攪拌12 小時(shí)，形成質(zhì)量濃度為2-6%的殼聚糖溶液，備用。

(2) 將一定量的明膠溶于去離子水中，50℃下溶解 12 h，形成質(zhì)量濃度為6-12%的明膠溶液，備用。

(3) 將步驟(1)制備的殼聚糖溶液和步驟(2)制備的明膠溶液按照一定的比例混合（1:1-1:3）混合均勻，備用。

(4) 配置質(zhì)量濃度為1%的氯化鉀溶液，并將一定量的卡拉膠(kappa型或Iota型)加入其中，70℃下溶解6-12 h致溶液澄清，配置質(zhì)量濃度為2-4%的卡拉膠氯化鉀溶液。

(5) 將步驟(4)獲得的卡拉膠溶液加入步驟(3)制備殼聚糖-明膠混合溶液中，使卡拉膠含量為5%-50%，超聲粉碎，快速機(jī)械攪拌，均勻后，加入一定量的戊二醛溶液(0.25%，戊二醛與混合溶液的體積比為1:4)，繼續(xù)攪拌1-2小時(shí)后將倒入模具中，室溫靜止12-24小時(shí)，形成混合凝膠。

(6) 將步驟(5)形成的混合凝膠，至于低溫冰箱中，-30℃- -60℃冷凍12小時(shí)以上。然后在冷凍干燥機(jī)中凍干48小時(shí)，形成多孔支架材料。

(7) 將步驟(6)凍干后所得支架材料置于 2％的 NaOH/乙醇水溶液中浸泡 6-12h，用水洗至中性后，再將支架置于 2％NaBH4溶液中浸泡4-8h，最后浸泡于蒸餾水中洗至中性。

(8) 將步驟(7)獲得的支架再次冷凍干燥，獲得基于卡拉膠的多孔支架材料。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明制備的卡拉膠基多孔支架材料在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與天然細(xì)胞外基質(zhì)類似。該支架中存在有陰離子多糖卡拉膠與陽離子多糖殼聚糖之間的靜電相互作用，同時(shí)也存在殼聚糖和/或明膠之間的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。此外，可通過調(diào)整支架中卡拉膠的含量改變其在復(fù)合支架中的構(gòu)象。在制備方法上采用離子屏蔽技術(shù)，使殼聚糖和卡拉膠能夠形成均已穩(wěn)定的配合物而不是不均一的沉淀。此外，所制備的卡拉膠基多孔支架材料的平均孔徑在200 μm左右，且孔徑大小隨著支架中卡拉膠含量的增加而減小，該類支架具有良好的溶脹特性和力學(xué)強(qiáng)度。此外，該支架材料能夠支持間充質(zhì)干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的粘附與生長。這些優(yōu)異的性能說明，該方法制備的卡拉膠基多孔支架材料在組織工程中具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1：軟骨細(xì)胞和支架材料共培養(yǎng)結(jié)構(gòu)圖

具體實(shí)施方式

實(shí)施所用的主要原料為明膠、殼聚糖、卡拉膠、氯化鉀、戊二醛、氫氧化鈉、硼氫化鈉等均為化學(xué)純。

實(shí)施例一：卡拉膠基多孔支架材料制備

(1) 將分子量20 萬，脫乙酰度大于85%的殼聚糖溶于1%的醋酸中，磁力攪拌12 小時(shí)，制備質(zhì)量濃度為3%的殼聚糖溶液。

(2) 將一定量的明膠溶于去離子水中，50℃下溶解 12 h，形成質(zhì)量濃度為6%的明膠溶液，備用。

(3) 將步驟(1)制備的殼聚糖溶液和步驟(2)制備的明膠溶液按照體積比為混合均勻，備用。

(4) 配置質(zhì)量濃度為1%的氯化鉀溶液，并將一定量的kappa型卡拉膠加入其中，70℃下溶解6致溶液澄清，配置質(zhì)量濃度為2%的卡拉膠氯化鉀溶液。

(5) 將步驟(4)獲得的卡拉膠溶液加入步驟(3)制備殼聚糖-明膠混合溶液中，體積比為,2:10，使卡拉膠的固體含量為10%，超聲粉碎，快速機(jī)械攪拌，均勻后，加入一定量的戊二醛溶液(0.25%，戊二醛與混合溶液的體積比為1:4)，繼續(xù)攪拌2小時(shí)后將倒入模具中，室溫靜止12小時(shí)，形成混合凝膠。

(6) 將步驟(5)形成的混合凝膠，至于低溫冰箱中，-45℃冷凍12小時(shí)以上。然后在冷凍干燥機(jī)中凍干48小時(shí)，形成多孔支架材料。

(7) 將步驟(6)凍干后所得支架材料置于 2％的 NaOH/乙醇水溶液中浸泡 12h，用水洗至中性后，再將支架置于 2％NaBH₄溶液中浸泡4h，最后浸泡于蒸餾水中洗至中性。再次冷凍干燥，獲得基于卡拉膠的多孔支架材料。

實(shí)施例三：軟骨細(xì)胞在支架材料中的種植

（1）將所制備的支架材料⁶⁰Co輻照滅菌24小時(shí)，備用。

（2）取健康3周齡SD大鼠，應(yīng)用頸椎脫臼法處死大鼠，酒精浸泡消毒30min后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)小心分離四肢長管骨，充分暴露股骨頭、脛骨平臺(tái)和肩關(guān)節(jié)處等處軟骨組織，DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗干凈后小心剔除軟骨組織，將得到的組織置于EP管中并充分剪碎，以900r/min離心3min，倒掉上清液，加入1ml 0.2%Ⅱ型膠原酶反復(fù)吹打，置于37℃的震蕩水浴器中震蕩12小時(shí)，取出后以900r/min離心3min，倒掉上清液，加入已配置好的完全培養(yǎng)液反復(fù)吹打，接種于25ml培養(yǎng)瓶，將其置于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2天后首次換液，以后每2～3天換液一次，待原代細(xì)胞鋪滿瓶底80%時(shí)傳代。本實(shí)驗(yàn)采用第二代細(xì)胞,將軟骨細(xì)胞，按照密度為8×10⁵/ml的細(xì)胞種植在覆蓋有支架的24孔板中，將其置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

（3）共培養(yǎng)7、14、21天取材，對(duì)其進(jìn)行切片并采用免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)支架中的細(xì)胞表現(xiàn)出很好的活性(如圖1所示)。