一種水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種可用于生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域的納米顆粒及其制備方法，具體為一種水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]磁性納米顆粒是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，由于其擁有均一、優(yōu)異的表面物理化學(xué)性質(zhì)被廣泛應(yīng)用于各個(gè)行業(yè)。具有超順磁性氧化鐵納米顆粒(SP10)是未來(lái)癌癥診療的不二選擇，能夠用于診斷實(shí)驗(yàn)、核磁共振造影劑、細(xì)胞分化、熱療以及藥物載帶等方面的研究。
[0003]在過(guò)去幾十年中，自下而上的合成方法被廣泛應(yīng)用于磁性氧化鐵顆粒的制備。如共沉淀、熱分解、溶膠凝膠法、水熱反應(yīng)等。目前基于四氧化三鐵的制備方法主要分為兩類，一類是共沉淀法，主要是在一定溫度下，將一定量的葡糖糖高聚物、鐵鹽和亞鐵鹽溶于水，攪拌下加入過(guò)量的氨水獲得粒徑約25?40納米的顆粒。但是該方法獲得的顆粒有尺寸較大，結(jié)晶度低、飽和磁化強(qiáng)度小，核磁共振醫(yī)學(xué)成像效果差以及包裹劑厚度不均勻等缺點(diǎn)。另一類是在高溫條件下，通過(guò)熱分解制備的氧化鐵納米顆粒，尺寸相對(duì)較小且更均一，磁性能優(yōu)越，但是其水溶性和生理環(huán)境下穩(wěn)定性差等嚴(yán)重缺陷也阻礙了其在體內(nèi)成像的應(yīng)用。然而，具有較大比表面積的納米顆粒容易聚集而導(dǎo)致磁性消失，表面活性降低，被快速?gòu)捏w內(nèi)清除。鑒于前述的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，制備具有高穩(wěn)定、能夠避免鐵磁性聚集、在生理環(huán)境中空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，同時(shí)具有易于化學(xué)修飾的表面基團(tuán)的超順磁性金屬納米顆粒(SP10)是目前納米醫(yī)學(xué)的重大挑戰(zhàn)。
[0004]發(fā)展制備高質(zhì)量磁性納米材料的綠色工藝，大規(guī)模可控合成磁性高、制備尺寸均勻可控、單分散性好、結(jié)晶程度高、易于表面功能化的磁性納米材料，并將其更好地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域仍是今后研究的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)主要目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的至少一種缺陷，提供一種水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的制備方法，包括:將蛋白與磁性金屬鹽混合，所述磁性金屬鹽的金屬離子通過(guò)復(fù)合于所述蛋白，制得蛋白-磁性金屬的中間分散產(chǎn)物；向所述蛋白-磁性金屬的中間分散產(chǎn)物中加入堿，反應(yīng)后制得所述水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒。
[0006]根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，所述蛋白選自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、膠原蛋白，以及磷脂蛋白中的一種或多種。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，所述蛋白的質(zhì)量與所述磁性金屬的摩爾比為(1?100g): (0.5 ?lOOOmmol)。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，所述磁性金屬選鹽自鐵、鈷、或鎳的鹽。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，所述磁性金屬鹽選自二價(jià)鐵、三價(jià)鐵的鹽酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽中的一種或多種。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，包括將所述蛋白的水溶液與所述磁性金屬鹽的水溶液于20?80°C混合10?60分鐘，制得所述蛋白-磁性金屬的中間分散產(chǎn)物。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，包括向所述蛋白-磁性金屬的中間分散產(chǎn)物中加入所述堿，于20?90°C反應(yīng)1?24小時(shí)，制得所述水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，所述堿選自氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，還包括將所述蛋白-磁性金屬的中間產(chǎn)物與堿反應(yīng)后的產(chǎn)物依次進(jìn)行透析純化處理、離心濃縮處理或者低溫凍干處理，得到所述水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒。
[0014]本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒，由上述任一項(xiàng)所述的方法制得。
[0015]本發(fā)明的水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的制備方法，所使用的原料廉價(jià)易得、天然無(wú)毒、環(huán)境友好、具有生物適用性；反應(yīng)設(shè)備普通易得、制備方法簡(jiǎn)便、綠色環(huán)保、產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)一步純化，適用于大規(guī)模的生產(chǎn)；得到的產(chǎn)物外包覆蛋白質(zhì)、水溶性好、生物活性高、易于進(jìn)一步修飾靶向分子、核磁共振醫(yī)學(xué)信號(hào)優(yōu)異、尺寸超小、易于進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)部，適用于活體成像、癌癥特異性靶向、以及體內(nèi)信號(hào)實(shí)時(shí)追蹤等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為制備例1的水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的透射電子顯微鏡測(cè)試圖；
[0017]圖2為制備例1的粒徑分布圖；
[0018]圖3為制備例1的水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的X射線光電子能譜測(cè)試圖；
[0019]圖4為制備例1的水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的X射線衍射光譜譜圖；
[0020]圖5為制備例1的水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的磁性測(cè)試圖；
[0021]圖6為實(shí)施例1的水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的核磁共振成像測(cè)試圖；
[0022]圖7為制備例1的水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的鐵離子濃度與1/T2的線性關(guān)系圖；
[0023]圖8A為現(xiàn)有的未使用應(yīng)用例的樣品的核磁共振醫(yī)學(xué)信號(hào)活體成像圖；
[0024]圖8B為使用了應(yīng)用例的樣品的核磁共振醫(yī)學(xué)信號(hào)活體成像圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]體現(xiàn)本發(fā)明特征與優(yōu)點(diǎn)的典型實(shí)施方式將在以下的說(shuō)明中詳細(xì)敘述。應(yīng)理解的是本發(fā)明能夠在不同的實(shí)施方式上具有各種的變化，其皆不脫離本發(fā)明的范圍，且其中的說(shuō)明及圖示在本質(zhì)上是當(dāng)作說(shuō)明之用，而非用以限制本發(fā)明。
[0026]本發(fā)明提供了一種水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的制備方法，包括:將蛋白與磁性金屬鹽混合，所述磁性金屬鹽的金屬離子復(fù)合于所述蛋白，制得蛋白-磁性金屬的中間分散產(chǎn)物；向所述蛋白-磁性金屬的中間分散產(chǎn)物中加入堿，反應(yīng)后制得所述水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒。
[0027]由于本發(fā)明所制得的磁性金屬納米顆粒外面包覆有蛋白質(zhì)，所以無(wú)需再進(jìn)行額外的表面氨基化或是羧基化，可以直接修飾靶向分子，適用于活體成像、癌癥特異性靶向、以及體內(nèi)信號(hào)實(shí)時(shí)追蹤等。
[0028]本發(fā)明中，磁性金屬可以為鐵、鉆、銀、絡(luò)、猛等；蛋白可以為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、膠原蛋白，以及磷脂蛋白中的一種或多種。
[0029]蛋白的質(zhì)量與磁性金屬的摩爾比優(yōu)選為(1?100g): (0.5?lOOOmmol);所使用的磁性金屬鹽可選自二價(jià)鐵、三價(jià)鐵的鹽酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽中的一種或多種。
[0030]在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，將蛋白的水溶液與磁性金屬鹽的水溶液于20?80°C混合10?60分鐘，制得蛋白-磁性金屬的中間分散產(chǎn)物。
[0031]在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，向蛋白-磁性金屬的中間分散產(chǎn)物中加入堿，以調(diào)節(jié)溶液的pH至堿性，于20?90°C中蛋白-磁性金屬的中間分散產(chǎn)物反應(yīng)1?24小時(shí)，制得水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒。其中，堿可以為例如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水。可通過(guò)加入堿，將體系的pH值調(diào)至例如10?14。
[0032]在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，還包括將所述蛋白-磁性金屬與堿反應(yīng)后的產(chǎn)物依次進(jìn)行透析純化處理、離心濃縮處理或者低溫凍干處理，得到所述水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒。例如，可將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行透析純化處理72小時(shí)，每12小時(shí)更換一次水。
[0033]本發(fā)明的制備方法所使用的原料廉價(jià)易得、天然無(wú)毒、環(huán)境友好、具有生物適用性；反應(yīng)設(shè)備普通易得、制備方法簡(jiǎn)便、綠色環(huán)保、產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)一步純化，適用于大規(guī)模的生產(chǎn)；得到的產(chǎn)物外包覆蛋白質(zhì)，無(wú)需再進(jìn)行額外的表面氨基化或是羧基化，且結(jié)晶程度高、水溶性好、生物活性高，易于進(jìn)一步修飾靶向分子，核磁共振信號(hào)優(yōu)異、尺寸超小、易于進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)部，適用于活體成像、癌癥特異性靶向、以及體內(nèi)信號(hào)實(shí)時(shí)追蹤等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
[0034]以下，結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒及其制備方法做進(jìn)一步說(shuō)明。其中，相關(guān)的測(cè)試儀器和條件如下:
[0035]透射電鏡，將樣品水溶液稀釋為5mg/ml濃度，用移液器滴加在雙面銅網(wǎng)干燥后，測(cè)試。儀器為Tecnai G2F20S-TWIN，美國(guó)FEI公司，電壓:200KeV
[0036]XPS:測(cè)試儀器 Thermo Escalab 250Χ? (Thermo Scientific, China) using Mg asthe exciting source.
[0037]XRD:x射線粉末衍射儀D8Advance，德國(guó)Bruker AXS。測(cè)試角度:起始角=10，終止角=80，步寬=.01，波長(zhǎng)=1.5406，40kV, 40mA。
[0038]弛豫率:7T小動(dòng)物核磁共振成像儀(B1Spec70/20USR，Bruker)，T2-加權(quán):RARE序列,TR:3000ms, TE:50ms。
[0039]磁滯回線:超導(dǎo)量子磁強(qiáng)計(jì)MPMS-7，測(cè)試溫度:300k，磁場(chǎng)0_±5T。
[0040]活體MRI成像，西門子1.5Τ臨床核磁共振成像儀。TSE序列，TR: 5520ms，TE: 120ms。
[0041]制備例1
[0042](1)將一定質(zhì)量的牛血清白蛋白溶于水中，制備成20mg/mL的溶液；
[0043](2)取二價(jià)鐵和三價(jià)鐵的氯化鹽制備鐵離子混合溶液，三價(jià)鐵及二價(jià)鐵的混合摩爾比為1:2，鐵元素的總濃度為100mmol/L ；
[0044](3)在磁力攪拌條件下，將0.8mL的鐵鹽混合溶液加入到10mL蛋白質(zhì)水溶液中，充分反應(yīng)30分鐘，得到蛋白-鐵的中間分散產(chǎn)物；
[0045](4)向步驟⑶得到的蛋白-鐵的中間分散產(chǎn)物中加入lmL濃度為lmol/L的氫氧化鈉水溶液，在37°C水浴中，攪拌反應(yīng)8小時(shí)后停止反應(yīng)。
[0046](5)將步驟(4)得到的產(chǎn)物進(jìn)行透析純化處理72小時(shí)，使用的透析袋為截留分子量為3500，每12小時(shí)更換一次水。
[0047](6)將透析后的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)離心濃縮處理，得到最終的蛋白質(zhì)包覆的氧化鐵納米顆粒粉末樣品。
[0048]對(duì)上述樣品進(jìn)行各項(xiàng)表征，具體參見(jiàn)圖1至7。圖1為樣品的透射電子顯微鏡測(cè)試結(jié)果，表明得到的氧化鐵納米顆粒具有較小的尺寸；圖2為樣品的粒徑分布圖，顯示樣品的平均粒徑大小為4.51納米。圖3為樣品的X射線光電子能譜測(cè)試結(jié)果，在結(jié)合能為710.8電子伏的位置存在有一個(gè)明顯的峰位，表明得到的納米顆粒中鐵元素的存在形式是四氧化三鐵。圖4為樣品的X射線衍射光譜譜圖，該譜圖也表明制備的納米顆粒是四氧化三鐵的結(jié)晶形態(tài)，結(jié)晶程度良好。圖5為樣品的磁性測(cè)試圖，樣品的磁滯回線結(jié)果顯示樣品的飽和磁化強(qiáng)度是84.32emu每克。將樣品配制成一系列不同濃度的水溶液之后，對(duì)其進(jìn)行核磁共振成像測(cè)試，結(jié)果如圖6所示，隨著樣品濃度的增加，得到的T2加權(quán)像也越來(lái)越暗，所得的結(jié)果與對(duì)應(yīng)的鐵元素濃度作圖得到的結(jié)果如圖7所示，數(shù)據(jù)結(jié)果呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，表明樣品非常適用于核磁共振醫(yī)學(xué)成像應(yīng)用。
[0049]制備例2
[0050](