專利名稱：水溶性緩釋重組蛋白質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)修飾領(lǐng)域，具體的說就是蛋白質(zhì)的氨基酸殘基與水溶性多聚物共價(jià)修飾的領(lǐng)域。本發(fā)明涉及這一具有生物活性的多肽的衍生物。這一化合物在體內(nèi)生理環(huán)境下，能在較長的一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)的釋放出活性多肽。
隨著重組DNA技術(shù)的飛速發(fā)展，具有生物學(xué)活性的重組活性蛋白質(zhì)也應(yīng)運(yùn)而生。通過基因工程方法可獲得蛋白質(zhì)。為了得到有活性的蛋白質(zhì)，除了需復(fù)性外，還需要進(jìn)行必要的修飾，如氨基端的酰氨化、豆蔻?；?。但是，這些蛋白質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)后，仍然可能被胃酸、蛋白酶等所降解而失活。
在近二十年的臨床應(yīng)用過程中，逐漸暴露出目前上市的基因工程藥物的一些共同缺點(diǎn)。如生物半衰期短，需頻繁用藥；有抗原性，長期使用產(chǎn)生抗體；保存條件苛刻，較不穩(wěn)定等。
如何保護(hù)蛋白質(zhì)，阻止其降解，延長其在體內(nèi)的半衰期，并降低其抗原性，已經(jīng)成為藥物學(xué)研究的首要任務(wù)。這就需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾(FrancisFocus on Growth Factors,3:4-10；1992年5月，由Mediscript,Morntview Court,Friern Barnet Land,London N20,OLD,UK出版)將蛋白質(zhì)聚氧乙烯大分子化，則能夠有效的解決這些問題。目前還沒有很好的方法制備并分離出單一的聚氧乙烯大分子化的蛋白質(zhì)。而且有關(guān)此類蛋白質(zhì)的活性和穩(wěn)定性也缺乏深入的研究。本發(fā)明正是基于這一需要，對(duì)以上這些方面作出了具體的闡述。
通過本發(fā)明中的制備方法，我們從混合物中獲得了一種單一的新的具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這一單一產(chǎn)品較以前的基因工程蛋白質(zhì)有明顯的優(yōu)點(diǎn)。它的體內(nèi)半衰期延長，體內(nèi)生物活性增強(qiáng)，穩(wěn)定性增加，免疫原性降低。
本發(fā)明涉及活性的水溶性緩釋重組蛋白質(zhì)的單一制品及其制備和分離純化的方法。通過將重組蛋白質(zhì)與聚氧乙烯進(jìn)行反應(yīng)，如G-CSF和聚氧乙烯20,000反應(yīng)，經(jīng)過離子交換和分子篩層析分離純化，得到單一的聚氧乙烯大分子化的G-CSF。令人高興的是，把所得的各個(gè)單一樣品進(jìn)行生物活性測(cè)定，其中一種聚氧乙烯大分子化的G-CSF具有明顯的誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞的快速增殖作用。而且，更具優(yōu)勢(shì)的是這種聚氧乙烯大分子化的G-CSF的體內(nèi)生物活性比對(duì)照的G-CSF更加高，穩(wěn)定性更好，其在體內(nèi)的代謝清除率更低。這可能是由于POE與G-CSF連接使分子變大，或者蛋白質(zhì)代謝與排泄所要求的細(xì)胞受體的相互作用受到空間位阻。同時(shí)，聚氧乙烯本身具有良好的生物相容性。
因此，本發(fā)明的內(nèi)容對(duì)獲得水溶性的穩(wěn)定的重組蛋白質(zhì)具有積極的意義。
本發(fā)明涉及活性的水溶性緩釋重組蛋白質(zhì)的單一制品及其制備和分離純化的方法。以下對(duì)此進(jìn)行詳細(xì)描述首先，本發(fā)明涉及水溶性緩釋重組蛋白質(zhì)的制備和分離純化的方法。
本方法可以將聚氧乙烯大分子化蛋白質(zhì)。通過選擇合適的緩沖液和pH值，使活化的聚氧乙烯反應(yīng)到蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上。反應(yīng)效率達(dá)到70％。在用離子交換和分子篩層析柱，分離產(chǎn)物中的各組份，得到了單一的制品。并通過肽圖譜得以證實(shí)。
其次，本發(fā)明涉及獲得的活性水溶性緩釋重組蛋白質(zhì)。
將分離純化的單一樣品進(jìn)行生物活性的測(cè)定和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。比較后，確定了一種既具有生物學(xué)活性，又水溶液穩(wěn)定的單一制品。
實(shí)例一1、重組人G-CSF的制備人G-CSF的氨基酸序列如下Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu LysCys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu GlnGlu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu ValLeu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys ProSer Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser GlyLeu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro GluLeu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe AlaThr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala LeuGln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln ArgArg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu ValSer Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro我們將含有該序列的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，對(duì)獲得的菌體蛋白進(jìn)行復(fù)性，以及離子交換，分子篩柱純化，獲得G-CSF半成品即可作為聚氧乙烯化的原料。2、聚氧乙烯大分子化的G-CSF的制備將1中制備的1.5mg/ml G-CSF溶液，用100mM(pH8.0)的磷酸鈉緩沖液透析過夜，加入溶解于此緩沖液的平均分子量為20000的甲氧基環(huán)氧丙基聚氧乙烯(EPO-MPOE)(摩爾比為聚氧乙烯∶G-CSF=20∶1)，4℃緩慢攪拌16小時(shí)。3、產(chǎn)物混合物的分離純化將2中制備的產(chǎn)物用20mM乙酸鈉(pH4.0)透析過夜。然后上樣于Pharmacia CM SepharoseFF柱(1ml樹脂結(jié)合1mg蛋白質(zhì))，以緩沖液A(20mM醋酸鈉，pH4.0)平衡柱。將蛋白質(zhì)上樣，再以緩沖液B(1M的氯化鈉)，其濃度梯度為0-30％進(jìn)行濃度梯度洗脫。流速為3ml/min，洗脫液在280nm處監(jiān)測(cè)，部分收集蛋白含量大于0.5mg/ml的部分。合并不同峰的餾分進(jìn)行分析(結(jié)果見

圖1)。如圖所示，產(chǎn)物POE-GCSF通過離子交換層析柱的得率為70％左右。
將離子交換層析柱獲得的蛋白質(zhì)進(jìn)行分子篩層析。柱為PharmaciaSephcryl S-200HR,300ml。以20mm醋酸鈉(pH4.0)緩沖液平衡。上樣蛋白以6ml/min流速洗脫200min，在280nm處監(jiān)測(cè)蛋白的流出情況，合并目的蛋白峰(結(jié)果見圖2)。如圖所示，產(chǎn)物POE-GCSF通過分子篩層析柱的得率為95％以上。4、產(chǎn)物生物活性測(cè)定(1)體外活性測(cè)定利用對(duì)G-CSF依賴的細(xì)胞株NFS-60，在含有10％經(jīng)熱滅活的胎牛血清和G-CSF的IMDM培養(yǎng)基中，于37℃,5％CO2培養(yǎng)72小時(shí)后。用無G-CSF的培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次，以每孔10000個(gè)細(xì)胞/50μl加入96孔板，并加入用IMDM-FBS配成的20、40、80、160、320pg/ml的美國Amgen公司G-CSF標(biāo)準(zhǔn)品和自制POE-GCSF樣品。37℃,5％CO2培養(yǎng)48小時(shí)后，按CellTiter 96 Aqueous細(xì)胞生長的非同位素檢測(cè)試劑盒中的說明，加入新鮮配制的以20∶1混合的MTS/PMS溶液20μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，用BioTek酶標(biāo)儀讀取490nm的值。酶標(biāo)儀上自帶的軟件可顯示出標(biāo)準(zhǔn)曲線及計(jì)算出待測(cè)樣品的生物活性(結(jié)果見圖3)。如圖所示，采用本發(fā)明獨(dú)特的方法制備得到的POE-GCSF樣品具有明顯的體外誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞的快速增殖作用。(2)體內(nèi)活性測(cè)定選擇ICR小鼠，以10μg蛋白質(zhì)/kg劑量靜脈注射自制POE-GCSF樣品，并以美國Amgen公司G-CSF標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照。注射后，間隔一定時(shí)間，取外周血，對(duì)嗜中性粒細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(結(jié)果見圖4)。如圖所示，采用本發(fā)明的方法制備得到的POE-GCSF樣品在體內(nèi)仍然具有生物學(xué)活性。5、產(chǎn)物等電點(diǎn)測(cè)定分別取樣品POE-GCSF原液和美國Amgen公司G-CSF標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照液及等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)液各2μl分別加入IEF膠的加樣孔中，進(jìn)行聚焦。100V 15分鐘，200V 15分鐘，450V 60分鐘，停止聚焦(此時(shí)電流趨于零)。然后，膠進(jìn)行固定和脫色(結(jié)果見圖5)。結(jié)果顯示，樣品POE-GCSF與G-CSF標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的等電點(diǎn)。6、產(chǎn)物分子量及胰肽酶切分離圖譜分析(1)SDS-PAGE電泳利用10％的變性SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，并用考馬斯亮藍(lán)染色(結(jié)果見圖6)。(2)分子排阻HPLC采用TSK gel SW3000凝膠柱，以10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)為流動(dòng)相，進(jìn)行分子排阻HPLC，流速為1.0ml/min，洗脫液在280nm處監(jiān)測(cè)(結(jié)果見圖7)。圖中結(jié)果通過計(jì)算機(jī)對(duì)峰面積進(jìn)行積分處理后顯示，樣品經(jīng)分子篩層析柱純化，純度達(dá)到98％以上。(3)胰肽酶切分離圖譜500μg POE-GCSF及對(duì)照品G-CSF樣品真空干燥，將其溶解在含有6M的鹽酸胍及1mM EDTA的0.3M Tris-HCl中(pH8.4)。配成1mg/950μl濃度。樣品中加碘乙酸進(jìn)行S-羧甲基化，并在37℃反應(yīng)20分鐘。然后樣品用Sephadex G-25快速離心蛋白分離柱(Quick SpinProtein Columns)脫鹽處理。加入上述緩沖液至蛋白終濃度為0.5mg/ml。
將以上蛋白質(zhì)樣品及對(duì)照品用蛋白質(zhì)內(nèi)切酶SV8(酶與底物比為1∶25)消化，以不加樣品的胰酶溶液作空白。25℃消化26小時(shí)。取出，裝Vydac C4柱，以溶液B(95％乙腈，5％水，0.1％三氟乙酸)3％-76％梯度洗脫，通過HPLC作肽圖。從而說明POE-GCSF為單個(gè)POE化學(xué)修飾的產(chǎn)物。7、產(chǎn)物穩(wěn)定性研究將POE-GCSF的注射液置于37℃放置48天，分別于0天，第6天，第12天，第24天，第36天，第48天取樣，進(jìn)行還原型SDS-PAGE電泳(結(jié)果見圖8)，及分子排阻HPLC。結(jié)果顯示，POE-GCSF經(jīng)過37℃放置48天后，仍然沒有降解，性質(zhì)非常穩(wěn)定。
實(shí)例二將HPLC純的重組人生長激素(hGH)1.5mg/ml溶液，其中人生長激素的氨基酸序列如下Met Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys TyrSer Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile ProThr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu LeuLeu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln PheLeu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser AsnVal Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly
Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr TyrSer Lys phe Asp Thr Asn Ser his Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn TyrGly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr PheLeu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe用100mM(pH8.3)碳酸銨緩沖液透析過夜，加入溶解于此緩沖液的平均分子量為20000的甲氧基環(huán)氧丙基聚氧乙烯(EPO-MPOE)(摩爾比為聚氧乙烯∶hGH=20∶1)，4℃緩慢攪拌16小時(shí)。然后，在4℃環(huán)境下，以10mM NaCl/20mM Tris(pH7.5)溶液對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行超濾(截流分子量20kD)。將去除了未反應(yīng)人生長激素蛋白質(zhì)的原液上樣于Pharmacia Q Sepharose FF柱(1ml樹脂結(jié)合1.2mg蛋白質(zhì))，以緩沖液A(50mM NaCl/20mM Tris(pH7.5))平衡柱。將蛋白質(zhì)上樣，再以緩沖液B(1M的氯化鈉)，其濃度梯度為0-20％進(jìn)行濃度梯度洗脫。流速為3ml/min，洗脫液在280nm處監(jiān)測(cè)，部分收集蛋白含量大于0.5mg/ml的部分。合并不同峰的餾分進(jìn)行分析。將離子交換層析柱獲得的蛋白質(zhì)進(jìn)行分子篩層析。柱為Pharmacia Sephcryl S-200HR,300ml。以20mm醋酸鈉(pH4.0)緩沖液平衡。上樣蛋白以6ml/min流速洗脫200min，在280nm處監(jiān)測(cè)蛋白的流出情況，合并目的蛋白峰。通過分離純化得到單一的POE-hGH，進(jìn)行胰肽酶切分離圖譜分析。活性測(cè)定結(jié)果顯示其仍然具有促進(jìn)骨生長、增加骨骼長度的作用。
相關(guān)專利美國專利 4,002,531美國專利 4,179,337美國專利 4,414,147美國專利 4,810,643美國專利 4,894,226美國專利 4,897,471美國專利 4,904,584美國專利 5,252,714美國專利 5,349,052美國專利 5,773,581歐洲專利 0098110歐洲專利 0154316歐洲專利 0236987歐洲專利 0243153歐洲專利 0335423歐洲專利 0338916歐洲專利 0401384歐洲專利 0442724歐洲專利 0459630歐洲專利 0473268歐洲專利 0539167英國專利 9016138英國專利 9018414英國專利 9018418世界專利 8604145世界專利 8906546世界專利 8910932世界專利 9004606世界專利 9105798世界專利 9417185
相關(guān)文獻(xiàn)Woodland et al.,Journal of Medicinal Chemistry,1973,16,897-901；Wise et al.,Journal of Pharmacy and Pharmacology,1978,30,686-689Proceed Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.16,(1989)No.268 pp.509-510；Biotechnology 8,(1990)pp.755-758Mumtaz S,Bachhawat BK,Indian J Biochem Biophys 1991 Oct-Dec；28(5-6):346-5權(quán)利要求
1．水溶性緩釋重組蛋白質(zhì)的制備方法包括(1)在合適的pH條件下，將水溶性多聚物與重組蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)。(2)獲得水溶性多聚物加成至重組蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的混合物。(3)通過分子篩和離子交換層析分離未反應(yīng)物及其它副產(chǎn)物，得到單一的水溶性緩釋重組蛋白質(zhì)。
2．權(quán)利要求1的制品中所說的水溶性多聚物是指葡聚糖、多聚(n-乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇(polypropylene glycol)均聚體、聚氧化丙烯/氧化乙烯(polypropylene oxide/ethylene oxide)共聚體、聚氧乙烯多元醇(polyoxyethylated polyols)及聚乙烯醇的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾。
3．權(quán)利要求1中所說的重組蛋白質(zhì)是指白細(xì)胞介素-11(IL-11)、人生長激素(hGH)、人粒細(xì)胞集落刺激因子(hG-CSF)、和干擾素(IFN)。
4．權(quán)利要求1中所說的水溶性緩釋重組蛋白質(zhì)為單一制品。該制品可制成不同的制劑，這些制劑包括藥用上可接受的稀釋劑、載體或佐劑。
5．權(quán)利要求1中的方法，其中所說的水溶性多聚物是指聚氧乙烯(POE)。包括環(huán)氧丙基甲基聚氧乙烯(EPO-MPOE)，氯丙基甲基聚氧乙烯(CM-POE)及琥珀酰亞胺丙酸酯基甲基聚氧乙烯(SPA-MPOE)。
6．權(quán)利要求1中的方法，其中所說的水溶性緩釋重組蛋白質(zhì)是指水溶性緩釋白細(xì)胞介素-11(POE-IL-11)、水溶性緩釋人生長激素(POE-hGH)、水溶性緩釋集落細(xì)胞刺激因子(POE-G-CSF)、和水溶性緩釋干擾素(POE-IFN)。
7．權(quán)利要求5中的聚氧乙烯(POE)具有從4KDa-80KDa的分子量。
8．權(quán)利要求5中所說的水溶性多聚物是符合GMP生產(chǎn)要求的，是藥用上可以接受的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種水溶性緩釋重組蛋白質(zhì)的制備和純化方法。提供了三種能使蛋白質(zhì)在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定的水溶性多聚物。通過本發(fā)明中的制備方法，我們從混合物中獲得了一種單一的新的具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這一單一產(chǎn)品較以前的基因工程蛋白質(zhì)有明顯的優(yōu)點(diǎn)。它的體內(nèi)半衰期延長，體內(nèi)生物活性增強(qiáng)，穩(wěn)定性增加，免疫原性降低。提供了用相關(guān)方法修飾的人生長激素(hGH)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G－CSF)、白細(xì)胞介素－11(IL－11)、和干擾素(IFN)。
文檔編號(hào)C07K17/10GK1316436SQ0011534
公開日2001年10月10日 申請(qǐng)日期2000年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月6日
發(fā)明者趙劍, 金蓓文, 陳虎 申請(qǐng)人:趙劍