專利名稱：一種大豆水溶性蛋白檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種大豆水溶性蛋白檢測方法。
背景技術(shù)：
大豆中所含的蛋白質(zhì)含量約為38%，是谷類食物的4 5倍，其氨基酸組成與牛奶蛋白質(zhì)相近，除蛋氨酸略低外，其余必需氨基酸含量均較豐富。在營養(yǎng)價(jià)值上，大豆蛋白質(zhì)可與動(dòng)物蛋白等同。大豆蛋白飲品中的精氨酸含量比牛奶高，其精氨酸與賴氨酸之比例也較合理，脂質(zhì)、亞油酸含量極為豐富且不含膽固醇，可防止成年期心血管疾病發(fā)生。此外，大豆還含有豐富的卵磷脂，可以清除血液中多余的固醇類。近年來，隨著人民生活水平的提高，大豆蛋白，特別是大豆水溶性蛋白，因其極易被人體直接吸收，且與人體內(nèi)蛋白質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)相似，不但其營養(yǎng)品質(zhì)得到了越來越高的重視，而且它的生理保健功能亦被逐步發(fā)現(xiàn)，如何提高大豆水溶性蛋白含量也成了栽培、 育種和遺傳研究的一個(gè)重要方向。因此，大豆水溶性蛋白含量成為檢測大豆品質(zhì)的重要指標(biāo)，對(duì)大豆品種進(jìn)行水溶性蛋白含量的分析具有重要指導(dǎo)意義。1988年，我國第一次根據(jù)水溶性蛋白含量對(duì)大豆進(jìn)行分級(jí)，2006年農(nóng)業(yè)部專門制定了大豆水溶性蛋白含量的測定的國家標(biāo)準(zhǔn)。國際標(biāo)準(zhǔn)中大豆水溶性蛋白的檢測方式是凱氏定氮法，該方法適用于所有蛋白的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，然而凱氏定氮法需用樣品用量大，單籽粒大豆在不影響其萌發(fā)率的前提下，所能提供的樣品水溶性蛋白含量很小，接近凱氏定氮法的檢測下限，誤差影響較大。因此該方法只適于樣品量較大的高世代材料的檢測，而對(duì)于大豆育種工作者前期基礎(chǔ)材料的篩選很不適合，且該方法操作危險(xiǎn)、步驟繁瑣，耗時(shí)過長，不適合大批量檢測。染料結(jié)合法是利用蛋白與染料結(jié)合后吸光度的改變來檢測蛋白含量，有人利用偶氮洋紅G染料快速測定大豆水溶性蛋白，但該研究還處在條件摸索階段，未應(yīng)用到大批量的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)中?？捡R斯亮藍(lán)法發(fā)明于1976年，也屬于染料結(jié)合法的一種，初時(shí)僅用于定性檢驗(yàn)，后隨著分光光度計(jì)檢測精度的提高，也應(yīng)用于乳品、中藥中蛋白質(zhì)的檢測，以及生理病理學(xué)中蛋白質(zhì)成分的鑒定，但在作物中還未見使用?？捡R斯亮藍(lán)法具有簡單、快速、靈敏的特點(diǎn)，但光電信號(hào)不穩(wěn)定、線性擬合度，限制了其檢測準(zhǔn)確度。低世代材料種子量少，樣品寶貴，還需要繼續(xù)向下遺傳從而獲得高世代材料，因而檢測和繁育同樣重要，這就要求在檢測的同時(shí)，保證種子的生命活性，所以提供一種適用于低世代大豆水溶性蛋白的檢測方法，具有現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種大豆水溶性蛋白檢測方法。該方法通過改進(jìn)大豆取樣方式，既滿足低世代大豆中水溶性蛋白的檢測，又不影響剩余部分的正常育苗，使低世代篩選與高世代遺傳分析得以實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還通過縮小反應(yīng)體系，改變蛋白樣品與考馬斯亮蘭染料之間的比例，提高了檢測方法的線性擬合度，適用于樣品量較少的樣本檢測。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案
本發(fā)明提供了一種大豆水溶性蛋白檢測方法，包括步驟1 沿與大豆種臍平行的方向，于種臍背側(cè)按照大豆質(zhì)量的1/11 1/7取樣， 浸提后獲得待測液；步驟2 取所述待測液與濃度為0. lmg/mL的考馬斯亮藍(lán)染液按照體積比為30 35 2000的比例混合，混勻后在595nm下檢測樣品吸光度值；制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用比色法得到所述待測液中水溶性蛋白含量。本發(fā)明通過等比例縮減反應(yīng)體系中待測液和考馬斯亮藍(lán)染液的量，發(fā)現(xiàn)較小的反應(yīng)體系中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系更好。因?yàn)榉止夤舛扔?jì)檢測最少需要2mL，所以選擇考馬斯亮藍(lán)染料用量定為2mL。在確定了考馬斯亮藍(lán)染料用量定為2mL的基礎(chǔ)上，本發(fā)明對(duì)反應(yīng)體系中待測液和考馬斯亮藍(lán)染液的量進(jìn)行非等比例縮減，發(fā)現(xiàn)水溶性蛋白含量在過低濃度或過高濃度時(shí)， 檢測結(jié)果均會(huì)出現(xiàn)顯色不敏感。其中，20μ L/anL、25y L/anL、30y L/2mL的200 μ g/mL位置以及45μ 72ιΛ、50μ 72ιΛ的1000 μ g/mL位置，均出現(xiàn)程度不等的非線性偏移。30 35 μ L/2mL的反應(yīng)體系，線性關(guān)系最好。因此，本發(fā)明提供的檢測方法中，待測液和考馬斯亮藍(lán)染液的體積比選擇30 ；35 μ L 2mL。大豆的取樣方法，直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度，以及種子繼續(xù)向下遺傳從而獲得高世代材料，因此，本發(fā)明提供的一種檢測方法中，選用沿與大豆種臍平行的方向，于種臍背側(cè)取大豆待測樣品，所述大豆待測樣品與所述大豆的質(zhì)量比為1 11 1 7，如圖1所示。不從頂端取樣，以避免銼刀損傷到頂端距離很近的胚，影響子葉出土， 見圖2 ；不從底端取樣，是為了避免取樣時(shí)，尖嘴鉗固定大豆時(shí)容易傷害到胚，影響大豆生理活性，如圖3所示；只有平行于胚，在胚的背面取樣，既能夠滿足低世代大豆水溶性蛋白的檢測，又不影響大豆剩余部分的正常育苗。為了更準(zhǔn)備地檢測大豆樣品中水溶性蛋白的含量，本發(fā)明對(duì)浸提條件進(jìn)行了研究。本發(fā)明提供的檢測方法中，將浸提次數(shù)從3次縮減到了 2次，同時(shí)每次的浸提時(shí)間從 60min縮減到第1次15min、第2次30min，能夠在不影響浸提效果的前提下，將浸提時(shí)間從 180min縮減到45min，從而提高了浸提效率。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，步驟1中所述浸提為，在大豆待測樣品中加水，在18 22°C振蕩15 30min的條件下提取兩次。本發(fā)明提供的檢測方法中，水可以為蒸餾水或重蒸水。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，步驟1中離心為在離心力為3000 3500r/min的條件下離心5 lOmin。在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的過程中，發(fā)現(xiàn)在蛋白濃度為低濃度(O 400yg/mL)時(shí)，檢測值有偏離線性的趨勢(shì)，在高濃度(600 1000 μ g/mL)時(shí)，檢測值有偏離線性的趨勢(shì)，在中濃度 (400 600 μ g/mL)時(shí)，檢測值的線性擬合度較好，因此，本發(fā)明提供的檢測方法中，將檢測液的濃度調(diào)整為400 600 μ g/mL,能夠更準(zhǔn)確地獲得待測液中水溶性蛋白的含量。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，步驟1中所述待測液的濃度為400 600 μ g/mL。與之相對(duì)應(yīng)的，步驟1中所述標(biāo)準(zhǔn)待測液的濃度分別為Ομ g/mL、200y g/mL、 400 μ g/mL、600 μ g/mL、800 μ g/mL、1000 μ g/mL。在發(fā)明的一些實(shí)施例中，以g/mL計(jì)，在大豆待測樣品中加入質(zhì)量體積比為2 3 200的蒸餾水，提取兩次后，收集兩次的浸提液，加蒸餾水定容，制得大豆水溶性蛋白待測液；以g/mL計(jì)，大豆待測樣品與大豆水溶性蛋白待測液的質(zhì)量體積比為2 3 1000。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，步驟1中所述浸提為以g/mL計(jì)，在大豆待測樣品中加入質(zhì)量體積比為2 3 200的蒸餾水，18 22°C振蕩15min后，離心，收集上清為第一浸提液；收集第一次離心沉淀物，以g/mL計(jì)，在離心沉淀物中加入質(zhì)量體積比為2 3 200 的水，18 22°C振蕩30min后，離心，收集上清為第二浸提液；合并第一浸提液和第二浸提液，加水定容，制得大豆水溶性蛋白待測液；以g/mL計(jì)，大豆待測樣品與大豆水溶性蛋白待測液的質(zhì)量體積比為2 3 1000。在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的檢測方法步驟1中所述浸提為，取所述大豆待測樣品0. 02 0. 03g置于2mL離心管中，加入2mL蒸餾水，18 22°C振蕩15min 后，3000 3500r/min離心5 lOmin，收集第一次離心后上清為第一浸提液；收集第一次離心沉淀物，再加入2mL蒸餾水，18 22°C振蕩30min后，3000 3500r/min離心5 lOmin，收集第二次離心后上清為第二浸提液；合并第一浸提液和第二浸提液，加水定容至 IOmL,制得所述大豆水溶性蛋白待測液。其中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的制備方法為準(zhǔn)確稱取IOOmg牛血清白蛋白(solarbio索萊寶生物科技有限公司)，溶于IOOmL蒸餾水中，即為1000 μ g/mL的原液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法為取不同濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)液與考馬斯亮藍(lán)染液按照體積比為 30 35 2000的比例混合，混勻后在595nm下檢測標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。考馬斯亮藍(lán)染液的配制方法為稱取IOOmg考馬斯亮藍(lán)G-250 (wolsen沃爾森生物技術(shù)有限公司)，溶于50mL90%乙醇(市售)中，加入85% (W/V)的磷酸(市售)100mL，最后用蒸餾水定容到1000mL。每一批次樣品使用同一批考馬斯亮藍(lán)染液。本發(fā)明提供的檢測方法中，大豆優(yōu)選為低世代大豆。該檢測方法也同樣適用于高世代大豆中水溶性蛋白的檢測，同時(shí)在對(duì)豆?jié){、豆奶中水溶性蛋白檢測的試驗(yàn)中，與傳統(tǒng)的凱氏定氮法相比，檢測結(jié)果無顯著差異。本發(fā)明提供一種大豆水溶性蛋白檢測方法。該方法通過改進(jìn)大豆取樣方式，既滿足低世代大豆中水溶性蛋白的檢測，又不影響剩余部分的正常育苗，使低世代篩選與高世代遺傳分析得以實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還通過縮小反應(yīng)體系，改變蛋白樣品與考馬斯亮蘭染料之間的比例，提高了檢測方法的線性擬合度，適用于樣品量較少的樣本檢測。同時(shí)通過浸提時(shí)間的優(yōu)化，進(jìn)一步縮短了檢測時(shí)間，提高了檢測效率。本發(fā)明提供的檢測方法，具有簡便快捷、 種子破壞性小，適用于低世代大豆中水溶性蛋白的檢測，也同樣適用于高世代大豆及豆?jié){、 豆奶中水溶性蛋白的檢測。


圖1示大豆頂端取樣方法。圖2示大豆底端取樣方法。圖3示本發(fā)明提供的大豆取樣方法。圖4示浸提次數(shù)對(duì)大豆水溶性蛋白提取率的影響；其中，第1-2柱形示第一次浸提 60min，第3-4柱形示第二次浸提60min，第5_6柱形示第三次浸提60min ；第7-8柱形示第一次浸提30min，第9-10柱形示第二次浸提30min，第11-12柱形示第三次浸提30min ’第13-14柱形示第一次浸提15min，第15-16柱形示第二次浸提15min，第17-18柱形示第三次浸提15min ；第19-20柱形示本發(fā)明提供的檢測方法第一次浸提15min，第21-22柱形示本發(fā)明提供的檢測方法第二次浸提30min，第23-M柱形示本發(fā)明提供的檢測方法第三次浸提15min ；其中，示凱氏定氮法的檢測結(jié)果，i示考馬斯亮藍(lán)法的檢測結(jié)果。圖5示各次浸提對(duì)大豆水溶性蛋白提取率的累加影響；其中，第1-2柱形示第一次浸提60min，第3-4柱形示第二次浸提60min后與第一次浸提液混合，第5_6柱形示第三次浸提60min后與前兩次浸提液混合；第7-8柱形示第一次浸提30min，第9_10柱形示第二次浸提30min后與第一次浸提液混合，第11-12柱形示第三次浸提30min后與前兩次浸提液混合；第13-14柱形示第一次浸提15min，第15-16柱形示第二次浸提15min后與第一次浸提液混合，第17-18柱形示第三次浸提15min后與前兩次浸提液混合；第19-20柱形示本發(fā)明提供的檢測方法第一次浸提15min，第21-22柱形示本發(fā)明提供的檢測方法第二次浸提30min后與第一次浸提液混合，第2314柱形示本發(fā)明提供的檢測方法第三次浸提15min 后與前兩次浸提液混合；其中，示凱氏定氮法的檢測結(jié)果，i示考馬斯亮藍(lán)法的檢測結(jié)果。圖6示等比例縮減反應(yīng)體系120 μ L/6mL標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖，其中，橫坐標(biāo)為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標(biāo)為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0006χ-0. 0173，相關(guān)系數(shù)為R2 =0.9741。圖7示等比例縮減反應(yīng)體系100 μ L/5mL標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖，其中，橫坐標(biāo)為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標(biāo)為吸光度，線性回歸方程y = 0. 0006χ-0. 0008，相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.9847。圖8示等比例縮減反應(yīng)體系80 μ L/4mL標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖，其中，橫坐標(biāo)為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標(biāo)為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0006x+0. 0115，相關(guān)系數(shù)為R2 =0.9871。圖9示等比例縮減反應(yīng)體系60 μ L/3mL標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖，其中，橫坐標(biāo)為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標(biāo)為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0005x+0. 0313，相關(guān)系數(shù)為R2 =0.9891。圖10示等比例縮減反應(yīng)體系40 μ L/2mL標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖，其中，橫坐標(biāo)為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標(biāo)為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0007χ-0. 0139，相關(guān)系數(shù)為R2 =0.9896。圖11示非等比例縮減反應(yīng)體系50 μ L/2mL標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖，其中，橫坐標(biāo)為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標(biāo)為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0007X+0. 0436，相關(guān)系數(shù)為 R2 = 0. 9846。圖12示非等比例縮減反應(yīng)體系45μ L/2mL標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖，其中，橫坐標(biāo)為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標(biāo)為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0007X+0. 0338，相關(guān)系數(shù)為 R2 = 0. 9878。圖13示非等比例縮減反應(yīng)體系40yL/2mL標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖，其中，橫坐標(biāo)為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標(biāo)為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0006X+0. 0341，相關(guān)系數(shù)為 R2 = 0. 9885。圖14示非等比例縮減反應(yīng)體系35 μ L/2mL標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖，其中，橫坐標(biāo)為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標(biāo)為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0006X+0. 0209，相關(guān)系數(shù)為R2 = 0. 9944。圖15示非等比例縮減反應(yīng)體系30 μ L/2mL標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖，其中，橫坐標(biāo)為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標(biāo)為吸光度，線性回歸方程為y = 0. ΟΟΟδχ+Ο. 0169，相關(guān)系數(shù)為 R2 = 0. 9927。圖16示非等比例縮減反應(yīng)體系25 μ L/2mL標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖，其中，橫坐標(biāo)為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標(biāo)為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0004X+0. 0251，相關(guān)系數(shù)為 R2 = 0. 9795。圖17示非等比例縮減反應(yīng)體系20 μ L/2mL標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖，其中，橫坐標(biāo)為蛋白濃度，單位為μ g/mL ；縱坐標(biāo)為吸光度，線性回歸方程為y = 0. 0004X+0. 0215，相關(guān)系數(shù)為 R2 = 0. 9793。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種大豆水溶性蛋白檢測方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。各大豆樣品由國家大豆改良中心石家莊分中心提供，各試劑均可由市場購得。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明實(shí)施例1取質(zhì)量為0.020g的大豆，沿與該大豆種臍平行的方向，于種臍背側(cè)取樣，取樣量為0. 01 0. 07g/粒。取樣量與萌芽之間的關(guān)系檢測結(jié)果見表1。表1大豆籽粒取用量與萌芽之間的關(guān)系
檢測重量萌芽率萌芽率方差檢測值檢測值方差0.Olg/ 粒100. 00%0. 00%31. 33%1. 37%0. 02g/ 粒100. 00%0. 00%31. 45%0. 99%0.03g/ 粒95. 00%2. 65%31. 48%0. 83%0. 04g/ 粒90. 33%3. 06%31. 46%0. 73%0.05g/ 粒83. 33%4. 04%31. 57%0. 62%0. 06g/ 粒80. 33%4. 16%31. 36%0. 55%0.07g/ 粒65. 33%5. 51%31. 62%0. 51% 早期篩選獲得的種子量較少，必須要盡量保證95 100%的萌芽率，否則對(duì)后續(xù)的遺傳研究會(huì)造成極大的誤差。在取用0. Olg 0. 03g/粒時(shí)，籽粒萌芽率能保證95 100%，但取0. Olg時(shí)檢測結(jié)果方差較大，優(yōu)選取用量為0. 02g。浸提方法對(duì)照組國標(biāo)法樣品反復(fù)浸提3次，每次60min。試驗(yàn)組浸提對(duì)水溶性蛋白浸提率的檢測結(jié)果見表2。表2不同浸提處理下，水溶性蛋白的檢測結(jié)果
浸提時(shí)間浸提次數(shù)凱氏定氮法法改良考馬斯亮藍(lán)法平均方差平均方差60min第1次26.28%0.41%26.19%0.39%第2次4.05%0.16%3.97%0.26%第3次0.13%0.06%0.13%0.03%2次混合30.32%0.27%30.24%0.37%3次混合30.55%0.14%30.27%0.27%3 Omin第1次25.85%0.13%25.66%0.64%第2次4.13%0.09%4.09%0.18%第3次0.15%0.02%0.14%0.03%2次混合30.21%0.15%30.05%0.56%3次混合30.48%0.40%30.28%0.52%15min第1次24.62%0.26%24.32%0.63%第2次5.00%0.25%4.89%0.24%第3次0.12%0.03%0.16%0.04%2次混合29.15%0.24%29.02%0.30%3次混合29.20%0.95%29.04%0.33%本發(fā)明提供的檢測方法第1次15min 第2次3 Omin 第3次60min第1次24.85%0.41%24.64%0.43%第2次5.49%0.28%5.48%0.08%第3次0.12%0.02%0.11%0.01%2次混合30.30%0.45%30.16%0.27%3次混合30.40%0.58%30.18%0.70% 試驗(yàn)結(jié)果(如圖4、5所示)，第1次浸提時(shí)，60min浸提蛋白最多，15min浸提蛋白最少；第2次浸提時(shí)，15min浸提蛋白最多，60min浸提蛋白最少；第3次浸提過后各浸提時(shí)間下浸提效果無顯著差異。經(jīng)顯著性檢驗(yàn)，本方法與3次60min浸提效果無顯著差異，可代替。同時(shí)第三次浸提對(duì)于結(jié)果的前后影響沒有顯著差異。故在大批量大豆水溶性蛋白的檢測過程中，其浸提次數(shù)可以減為2次，浸提時(shí)間可以縮減75 %，提取效率可以提高300 %。
綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，在大豆水溶性蛋白的浸提過程中，本方法將浸提次數(shù)從3次縮減到了 2次，同時(shí)每次的浸提時(shí)間從60min縮減到第1次15min、第2次30min，在不影響浸提效果的前提下，將浸提時(shí)間從ISOmin縮減到了 45min，效率提高了 300%。在大豆水溶性蛋白的檢測過程中，受儀器以及方法本身的限制，凱氏定氮法的最大效率能達(dá)到12個(gè)樣品X3重復(fù)/天/人。本發(fā)明提供的檢測方法顯色快，只要將所得蛋白提取液稀釋到合適濃度，加顯色液后(30s)即可顯色檢測，檢測時(shí)間也非常迅速(Imin)， 因此用考馬斯亮藍(lán)法的檢測速度能達(dá)到48樣品X 9重復(fù)/天/人，若只進(jìn)行水溶性蛋白的初步篩選，此速度還能加倍，最高效率是傳統(tǒng)凱氏定氮法的12倍。反應(yīng)體系對(duì)照組傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)法蛋白-染料反應(yīng)體系為100 μ L/5mL,反應(yīng)在IOmL試管中進(jìn)行。試驗(yàn)組蛋白-染料反應(yīng)體系分別為120 μ L/6mL、80 μ L/4mL、60 μ L/3mL、 40 μ L/2mL,反應(yīng)在IOmL試管中進(jìn)行。等比例縮減反應(yīng)體系見表3，結(jié)果如圖4至10所示。表3等比例縮減反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種大豆水溶性蛋白檢測方法，其特征在于，包括步驟1 沿與大豆種臍平行的方向，于種臍背側(cè)按照大豆質(zhì)量的1/11 1/7取樣，加水浸提后獲得待測液；步驟2 取所述待測液與濃度為0. lmg/mL的考馬斯亮藍(lán)染液按照體積比為30 35 2000的比例混合，混勻后在595nm下檢測樣品吸光度值；制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用比色法得到所述待測液中水溶性蛋白含量。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟1中所述浸提為，在18 22°C振蕩15 30min的條件下提取兩次。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于，步驟1中離心為在離心力為3000 3500r/min的條件下離心5 lOmin。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟1中所述待測液的濃度為400 600 μ g/mL0
5.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，步驟2中制備所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的濃度分別為 0 μ g/mL、200 μ g/mL、400 μ g/mL、600 μ g/mL、800 μ g/mL、1000 μ g/mL。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述大豆為低世代大豆。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大豆水溶性蛋白檢測方法。該方法通過改進(jìn)大豆取樣方式，既滿足早期世代大豆中水溶性蛋白的檢測，又不影響剩余部分的正常育苗，使低世代篩選與高世代遺傳分析得以實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還通過縮小反應(yīng)體系，改變蛋白樣品與考馬斯亮蘭染料之間的比例，提高了檢測方法的線性擬合度，適用于樣品量較少的樣本檢測。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102393362SQ20111023631
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者唐曉東, 張孟臣 申請(qǐng)人:河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所