含有利多卡因的抗腫瘤藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗腫瘤藥物，具體而言是一種用于治療膀胱癌的含有利多卡因的 抗腫瘤藥物。
【背景技術(shù)】
[0002] 膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在美國為第四位常見腫瘤，在我國則 排名第八位。90%的膀胱癌是移行細(xì)胞癌，其中70%是淺表性膀胱癌，即腫瘤局限于膀胱粘 膜固有層。膀胱癌復(fù)發(fā)率較高。單純手術(shù)治療者約有40%_70%在兩年內(nèi)復(fù)發(fā)，其中淺表性 膀胱癌五年的復(fù)發(fā)率可達(dá)90%，約有10%可進(jìn)展為浸潤性膀胱癌。根據(jù)膀胱癌易復(fù)發(fā)的特 點，實行術(shù)后藥物膀胱灌注可以達(dá)到清除殘余瘤體，預(yù)防復(fù)發(fā)和延緩進(jìn)展的目的。
[0003] 卡介苗（BacilleCalmette-Guerin,BCG)是最早用于膀胱腔內(nèi)灌注預(yù)防與治 療膀胱腫瘤的，其療效也得到了公認(rèn)。國外的研究報道術(shù)后膀胱內(nèi)灌注BCG的療效為 30°/『90%不等，是膀胱灌注治療中效果最為理想的藥物。但由于BCG具有較強的抗原性、致 敏性及殘余毒性，其帶來的并發(fā)癥也較多，主要表現(xiàn)為膀胱炎、發(fā)熱及結(jié)核感染，這些不良 反應(yīng)使BCG在臨床上難以推廣使用。而且目前在我國未有一家生物制品研究所的BCG獲 得膀胱灌注治療腫瘤的制藥許可證。
[0004] 由于BCG的毒副反應(yīng)較大，人們開始試用抗癌藥物膀胱腔內(nèi)灌注降低術(shù)后的復(fù)發(fā) 率。1955年Battmem報導(dǎo)了噻替派局部化療對惡性腫瘤有效，Johnts等也報導(dǎo)了膀胱內(nèi) 灌注噻替派可以治愈殘留移行細(xì)胞癌并明顯降低腫瘤復(fù)發(fā)的危險。但長期隨訪研究資料表 明，目前的治療仍不能降低遠(yuǎn)期的腫瘤復(fù)發(fā)率，這也成為膀胱腫瘤治療中需要解決的關(guān)鍵 問題之一。國內(nèi)許多學(xué)者也在提高膀胱灌注化療效果方面作了研究報道。灌注藥物多為臨 床常用的抗腫瘤藥。如：塞替派（TSPA)、阿霉素（ADM)、絲裂霉素（MMC)、順鉑（DDP)、吡柔比 星（THP)、羥基喜樹堿（0ΤΡ)等。膀胱腔內(nèi)灌注化療藥對淺表性膀胱癌的術(shù)后復(fù)發(fā)率有明 顯的降低作用，報道為15°/p60%不等。臨床實踐中我們發(fā)現(xiàn)使用膀胱灌注化療藥物均會有 程度不同毒副反應(yīng)的發(fā)生，比如骨髓抑制，化學(xué)性膀胱炎，接觸性皮炎，膀胱短暫性痙攣，膀 胱刺激不適感以及發(fā)熱，全身不適等癥狀。同時在臨床上還會遇到對多種抗腫瘤藥均不敏 感的病例，給治療工作造成了困難。
[0005] 利多卡因（lidocaine)又名賽羅卡因（xylocaine)，利多卡因分子式：C14H22N20,鹽 酸利多卡因分子式：(：14!123(：1隊0，性狀 ：白色結(jié)晶粉末，化學(xué)名以-二乙氨基乙酰-2,6-二甲 基苯胺。是目前應(yīng)用最多的局麻藥。相同濃度下與普魯卡因相比，利多卡因具有起效快、作 用強而持久、穿透力強及安全范圍較大等特點，同時無擴(kuò)張血管作用及對組織幾乎沒有刺 激性?？捎糜诙喾N形式的局部麻醉，有全能麻醉藥之稱，主要用于傳導(dǎo)麻醉和硬膜外麻醉。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種在正常體溫狀態(tài)下，提高腫瘤治療效果并在 腫瘤的局部用藥治療時降低局部疼痛的含有利多卡因的抗膀胱癌藥物。
[0007] 為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種含有利多卡因的抗腫瘤藥 物，是將利多卡因溶于醫(yī)學(xué)上可接受的溶劑中制成溶液，利多卡因濃度為1. 25mg/ml-5mg/ ml〇
[0008] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的溶液中含有抗膀胱癌的灌注藥物，與利多卡因組合 成灌注液，抗膀胱癌灌注藥物在溶液中的含量是醫(yī)學(xué)上可以接受的通常劑量。所述的抗膀 胱癌的灌注藥物優(yōu)選自絲裂霉素、吡柔比星、蘇復(fù)寧洗液和羥喜樹堿中的任意一種。
[0009] 作為另一種優(yōu)選的方案，所述的醫(yī)學(xué)上可接受的溶劑是生理鹽水和水。
[0010] 使用方法是將上述藥液配制好后立即使用，用導(dǎo)尿管將藥液灌注入膀胱腔內(nèi)，并 使藥液在膀胱腔內(nèi)保留60-90分鐘后，自行排出即可。
[0011] 本發(fā)明同時還要求保護(hù)利多卡因在制備抗膀胱癌藥物中的應(yīng)用。
[0012] 利多卡因作為一種麻醉劑應(yīng)用多年，我們在實驗研究中發(fā)現(xiàn)，利多卡因?qū)δ[瘤細(xì) 胞也具有一定的抑制作用。利多卡因在一定濃度下能夠直接抑制腫瘤細(xì)胞，且抑制效果隨 著藥物濃度的升高而增強。在與抗腫瘤藥物組合應(yīng)用時，利多卡因能夠增強抗腫瘤藥物的 抑瘤作用，提高化療藥物的抗腫瘤作用，這一發(fā)現(xiàn)可以擴(kuò)大利多卡因在腫瘤的治療中的作 用，特別是在腫瘤的局部用藥治療時降低化療藥物對機(jī)體的刺激性及毒性作用，降低局部 疼痛，提高腫瘤治療效果的作用。
【具體實施方式】
[0013] 實施例1 利多卡因單用或與絲裂霉素組合對人膀胱癌細(xì)胞BIU-87抑制作用的影響。
[0014] 以人膀胱癌細(xì)胞株BIU-87為靶細(xì)胞，采用MTT比色法檢測利多卡因、絲裂霉素單 用和組合應(yīng)用對靶細(xì)胞的抑制作用。
[0015] 1材料 1.1細(xì)胞株人膀胱癌細(xì)胞株BIU-87,山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科楊曉峰主 任惠贈。
[0016] 1.2藥物鹽酸利多卡因注射液，規(guī)格：10ml:0. 2g，批號：20141118,有效期至 2017. 10;注射用絲裂霉素，規(guī)格：2mg，批號：130803,有效期至2016. 07,浙江海正藥業(yè)股份 有限公司。
[0017] 1.3試劑及耗材RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四 季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶購自上海生工生物工程有限公司，四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)，購自Solarbio公司，二甲基亞砜（DMS0)購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司。96孔 細(xì)胞培養(yǎng)板，購自加拿大BBI公司。
[0018] 1.4儀器生物安全柜，青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司；C02培養(yǎng)箱，美國 NuAire公司NU-5500E;倒置顯微鏡，德國Leica090-135. 001 ;光學(xué)顯微鏡，日本Olympus CX21FS1;精密電子天平，日本島津制作所AEG-220 ;SunRise酶標(biāo)儀，奧地利Tecan公司。
[0019] 2實驗方法 2. 1細(xì)胞培養(yǎng)BIU-87細(xì)胞培養(yǎng)于含0· 05g/L鏈霉素、0· 05g/L青霉素、0· 8g/LNaHC03、 3. 6g/LHEPES、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37°C、5%C02及飽和濕度的恒溫孵育箱 中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以〇. 25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液進(jìn)行實驗。
[0020] 2.2實驗分組陰性對照組，絲裂霉素單獨作用組（0.66mg/ml)，利多卡因不同濃 度單獨作用組（5mg/ml、2. 5mg/ml、l. 25mg/ml)，絲裂霉素與利多卡因聯(lián)合用藥組。
[0021] 2. 2MTT法檢測BIU-87細(xì)胞抑制率 BIU-87細(xì)胞以5X103個/孔接種于96孔板中，每孔加入培養(yǎng)基100ul，置于37°C、5%C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)24h，棄去原培養(yǎng)基，按上述分組方法加入含有不同濃度藥 物的培養(yǎng)基200ul，陰性對照組加入等量的培養(yǎng)基，并設(shè)立無細(xì)胞的培養(yǎng)基為調(diào)零組，每組 設(shè)5個復(fù)孔。加藥2h后向每孔加入5mg/ml的MTT溶液20ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸去孔內(nèi) 培養(yǎng)液，每孔加入150ulDMS0,置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀測定在 570nm波長下的吸光值（0D值)。計算各組對BIU-87細(xì)胞的抑制率。
[0022] 細(xì)胞抑制率（％) = (1-實驗組平均0D值/對照組平均0D值）X100% 2. 3統(tǒng)計方法 采用SPSS17. 0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，多組比較采用單因素方差分析，方差齊時采 用檢驗，方差不齊時采用71·?檢驗。代0. 05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0023] 3 結(jié)果 利多卡因單藥（1. 25、2. 5、5mg/ml)的細(xì)胞抑制率分別為45. 91%、62. 16%、80. 00% (K0. 05)，絲裂霉素單藥（0. 66mg/ml)的細(xì)胞抑制率為90. 45% (K0. 05)，不同濃度的 利多卡因與絲裂霉素聯(lián)合用藥均對靶細(xì)胞的抑制作用較絲裂霉素單藥明顯增強，分別為 94. 77%、96. 14%和97. 95% (K0. 05)。利多卡因單用對人膀胱癌細(xì)胞BIU-87有明顯的抑制 作用；利多卡因與絲裂霉素聯(lián)合用藥對人膀胱癌細(xì)胞BIU-87的抑制有增效作用。（表1)。
[0024] 表1利多卡因與絲裂霉素單用以及兩藥組合對BIU-87細(xì)胞的抑制率
注：*與對照組比較代0. 05,A與絲裂霉素比較代0. 05 實施例2 利多卡因單用或與吡柔比星組合殺傷BIU-87細(xì)胞的影響。
[0025] 以人膀胱癌細(xì)胞株BIU-87為靶細(xì)胞，采用MTT比色法檢測吡柔比星單用和組合應(yīng) 用利多卡因?qū)Π屑?xì)胞的抑制作用。
[0026] 1材料 1.1細(xì)胞株人膀胱癌細(xì)胞株BIU-87,山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科楊曉峰主 任惠贈。
[0027] 1.2藥物鹽酸利多卡因注射液，規(guī)格：10ml:0. 2g，批號：20141118,有效期至 2017. 10 ;注射用鹽酸吡柔比星，規(guī)格：10mg，批號：1410C15,有效期至2016. 09,深圳萬樂藥 業(yè)有限公司。
[0028] 1.3試劑及耗材RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四 季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶購自上海生工生物工程有限公司，四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)，購自Solarbio公司，二甲基亞砜（DMSO)購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司。96孔 細(xì)胞培養(yǎng)板，購自加拿大BBI公司。
[0029] 1.4儀器生物安全柜，青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司；C02培養(yǎng)箱，美國 NuAire公司NU-5500E;倒置顯微鏡，德國Leica090-135. 001 ;光學(xué)顯微鏡，日本Olympus CX21FS1 ;精密電子天平，日本島津制作所AEG-220;SunRise酶標(biāo)儀，奧地利Tecan公司。
[0030] 2實驗方法 2. 1細(xì)胞培養(yǎng)BIU-87細(xì)胞培養(yǎng)于含0· 05g/L鏈霉素、0· 05g/L青霉素、0· 8g/LNaHC03、 3. 6g/LHEPES、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37°C、5%C02及飽和濕度的恒溫孵育箱 中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以〇. 25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液進(jìn)行實驗。
[0031] 2.2實驗分組陰性對照組，吡柔比星單獨作用組（0.75mg/ml)，利多卡因不同濃 度單獨作用組（5mg/ml、2. 5mg/ml、1. 25mg/ml)，吡柔比星與利多卡因聯(lián)合用藥組。
[0032] 2. 2MTT法檢測BIU-87細(xì)胞抑制率 BIU-87細(xì)胞以1. 3X104個/孔接種于96孔板中，每孔加入培養(yǎng)基100ul，置于37°C、 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，按上述分組方法加入含有不同濃度藥物的 培養(yǎng)基200ul，陰性對照組加入等量的培養(yǎng)基，并設(shè)立無細(xì)胞的培養(yǎng)基為調(diào)零組，每組設(shè)