一種體外構(gòu)建組織工程軟骨用的凝膠狀支架配方及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及軟骨修復(fù)領(lǐng)域，尤其涉及一種軟骨組織工程支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]關(guān)節(jié)軟骨損傷，無論是外傷還是病理原因造成的損傷都不能自發(fā)修復(fù)，而且通常都會導(dǎo)致軟骨的退行性病變，進而造成骨性關(guān)節(jié)炎。目前，應(yīng)用軟骨組織工程技術(shù)能夠治療此類外傷性(或剝脫性骨軟骨炎)的膝關(guān)節(jié)面軟骨缺損，近幾年，人們也利用生物工程化支架材料作為細胞運送載體的優(yōu)勢，開發(fā)出新的關(guān)節(jié)鏡設(shè)備，并且應(yīng)用于軟骨組織工程技術(shù)中。
[0003]例如:中國專利公開號為CN103877615B的專利公開一種軟骨組織工程支架及其制備方法，方法包括，制備脫鈣骨基質(zhì)，配制天然高分子水凝膠溶液，將所述天然高分子水凝膠溶液注射至所述脫鈣骨基質(zhì)中，使得所述天然高分子水凝膠溶液完全滲入所述脫鈣骨基質(zhì)中，并在預(yù)設(shè)溫度下進行凝膠化反應(yīng)，得到所述軟骨組織工程支架。通過上述的技術(shù)方案，可以制得軟管工程支架，但是不能較好的維持細胞原代活性。
[0004]申請人研究發(fā)現(xiàn)，無論在動物實驗中還是臨床病例里，軟骨細胞在體外培養(yǎng)的過程中其表達二型膠原(透明軟骨細胞主要功能蛋白)能力會明顯下降，而一型膠原(軟骨組織工程主要并發(fā)癥纖維化主要表達蛋白)表達明顯上升，如何使軟骨細胞在體外培養(yǎng)能到一定的數(shù)量級、且使其能保持原代活性一直是研究的重點。事實上，軟骨細胞來源一般取自患者自體非負重區(qū)域的軟骨，需要越多的軟骨細胞，就需要取越多的軟骨，會給病人造成二次損傷，對于大面積的軟骨缺損，軟骨組織工程有很好的療效，但由于上述原因，盡管等待關(guān)節(jié)軟骨方面治療的數(shù)量龐大，但現(xiàn)有的可行性的細胞治療手段不能有效滿足這一要求。此外，傳統(tǒng)的軟骨細胞體外培養(yǎng)條件一一以自體血清或牛血清(研究用)作為培養(yǎng)基添加成分，常常會引發(fā)培養(yǎng)細胞的非生理反應(yīng)，這是因為人體內(nèi)的軟骨組織是在沒有血供的情況下生存的，僅依賴細胞自分泌或旁分泌因子來維持代謝平衡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種能使在體外培養(yǎng)的軟骨細胞保持原代活性，且在軟骨組織工程臨床應(yīng)用中能根據(jù)病人軟骨缺損形狀塑性的凝膠狀支架配方及制備方法。
[0006]—種能夠維持細胞原代活性的工程軟骨用的凝膠狀支架配方及制備方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0008]—種體外構(gòu)建組織工程軟骨用的凝膠狀支架配方，其特征在于，包括凝膠和添加劑，凝膠為纖維蛋白、膠原蛋白、透明質(zhì)酸、凝血酶；所述添加劑在培養(yǎng)基的濃度為:
[0009]維生素C:233 μΜ?287 μΜ，亞油酸:3.7 μΜ ?8.9 μΜ，膽固醇:9 μΜ ?17 μΜ，地塞米松:6ηΜ?15ηΜ，乙酰半胱氨酸:43 μ M?58 μ Μ，轉(zhuǎn)鐵蛋白:18 μ g/mL?32 μ g/mL，亞砸酸鈉:22nM?52nM，泛酸鈉:13 μ M?24 μ M，生物素:28 μ M?43 μ M，胰島素:7 μ g/mL?18 μ g/mL,表皮生長因子:2ng/mL?9ng/mL，成纖維生長因子:2ng/mL?9ng/mL，血小板衍生生長因子:2ng/mL?9ng/mL，人血清白蛋白0.5%?2.5%。
[0010]進一步，纖維蛋白100mg/ml ;膠原蛋白25mg/ml ;透明質(zhì)酸5% ;凝血酶50U/ml。。
[0011]進一步，所述培養(yǎng)基為DMEM/F12。
[0012]制備方法，其特征在于，所述方法包括:
[0013]I)將維生素C，亞油酸，膽固醇，地塞米松，乙酰半胱氨酸，轉(zhuǎn)鐵蛋白，亞砸酸鈉，泛酸鈉，生物素，胰島素，表皮生長因子，成纖維生長因子，血小板衍生生長因子，人血清白蛋白添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，使得添加劑在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的最終濃度為:
[0014]維生素C:233 μΜ?287 μΜ，亞油酸:3.7 μΜ ?8.9 μΜ，膽固醇:9 μΜ ?17 μΜ，地塞米松:6ηΜ?15ηΜ，乙酰半胱氨酸:43 μ M?58 μ Μ，轉(zhuǎn)鐵蛋白:18 μ g/mL?32 μ g/mL,亞砸酸鈉:22nM?52nM，泛酸鈉:13 μ M?24 μ M，生物素:28 μ M?43 μ Μ，胰島素:7 μ g/mL?18 μ g/mL,表皮生長因子:2ng/mL?9ng/mL，成纖維生長因子:2ng/mL?9ng/mL，血小板衍生生長因子:2ng/mL?9ng/mL，人血清白蛋白0.5%?2.5% ；
[0015]2)將纖維蛋白、膠原蛋白、透明質(zhì)酸和凝血酶用步驟I)中配置的溶液溶解稀釋，使其終濃度為纖維蛋白100mg/ml ;膠原蛋白25mg/ml ;透明質(zhì)酸5% ;凝血酶50U/ml。
[0016]進一步，添加劑在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的最終濃度為:
[0017]維生素C:250 μΜ，亞油酸:4.5μΜ，膽固醇:13μΜ，地塞米松:10ηΜ，乙酰半胱氨酸:50μΜ，轉(zhuǎn)鐵蛋白:25yg/mL，亞砸酸鈉:30nM，泛酸鈉:17μΜ，生物素:33μΜ，胰島素:10yg/mL，表皮生長因子:5ng/mL，成纖維生長因子:5ng/mL，血小板衍生生長因子:5ng/mL，人血清白蛋白1%。
[0018]進一步，培養(yǎng)基為DMEM/F12。
[0019]本發(fā)明提供的技術(shù)方案所帶來的有益技術(shù)效果是:
[0020]本發(fā)明提供了一種體外構(gòu)建組織工程軟骨用的凝膠狀支架配方及制備方法，通過使用該配方及方法制備的支架，能使在體外培養(yǎng)的軟骨細胞保持原代活性，且在軟骨組織工程臨床應(yīng)用中能根據(jù)病人軟骨缺損形狀，提供塑性的凝膠狀支架。該支架配方包括纖維蛋白、膠原蛋白、透明質(zhì)酸、維生素C、亞油酸、膽固醇、地塞米松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、生物素等，在培養(yǎng)過程中只需用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不用添加血清，避免了以自體血清或牛血清(研究用)作為培養(yǎng)基添加成分而引發(fā)的培養(yǎng)細胞的非生理反應(yīng)。再次，在凝膠支架中體外培養(yǎng)的第三代軟骨細胞特異性基因表達亦能得到原代水平，使得軟骨組織工程軟骨細胞體外培養(yǎng)易去分化、擴增效率低等問題可能得到解決。
【附圖說明】
[0021]圖1是軟骨組織工程支架的軟骨誘導(dǎo)能力對比示意圖；
[0022]圖2是軟骨特異性基因檢測圖。
【具體實施方式】
[0023]為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合圖示與具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
[0024]實施例1:
[0025]本實施例提供了體外構(gòu)建組織工程軟骨用的凝膠狀支架配方，包括凝膠和添加劑，其中凝膠包括纖維蛋白100mg/ml、膠原蛋白25mg/ml、透明質(zhì)酸5%、凝血酶50U/ml ;添加劑在DMEM/F12 (1:1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的最終濃度為:
[0026]維生素C:233 μΜ?287 μΜ，亞油酸:3.7 μΜ ?8.9 μΜ，膽固醇:9 μΜ ?17 μΜ，地塞米松:6ηΜ?15ηΜ，乙酰半胱氨酸:43 μ M?58 μ Μ，轉(zhuǎn)鐵蛋白:18 μ g/mL?32 μ g/mL,亞砸酸鈉:22nM?52nM，泛酸鈉:13 μ M?24 μ M，生物素:28 μ M?43 μ Μ，胰島素:7 μ g/mL?18 μ g/mL,表皮生長因子:2ng/mL?9ng/mL，成纖維生長因子:2ng/mL?9ng/mL，血小板衍生生長因子:2ng/mL?9ng/mL，人血清白蛋白0.5%?2.5%。
[0027]纖維蛋白和凝血酶混合時，模擬凝血鏈級反應(yīng)的最后一步，通過凝血酶對纖維蛋白原的激活作用，使纖維蛋白原逐漸聚合，最終形成纖維蛋白固化物；膠原蛋白的作用是模擬軟骨細胞在體內(nèi)的生長環(huán)境；透明質(zhì)酸的作用是固定添加劑，使添加劑能有效存在膠原支架中。
[0028]實施例2:
[0029]本實施例提供了體外構(gòu)建組織工程軟骨用的凝膠狀支架的制備方法，包括:
[0030]I)將維生素C，亞油酸，膽固醇，地塞米松，乙酰半胱氨酸，轉(zhuǎn)鐵蛋白，亞砸酸鈉，泛酸鈉，生物素，胰島素，表皮生長因子，成纖維生長因子，血小板衍生生長因子，人血清白蛋白添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12，使得添加劑在基礎(chǔ)培