Ch25h與25-ohc在免疫應答中的作用及其作為免疫調(diào)節(jié)劑在疫苗中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體涉及到一種基因及其編碼和代謝產(chǎn)物在調(diào)節(jié)免疫 應答中的作用，以及利用這種免疫調(diào)節(jié)作用在發(fā)展新型艾滋病藥物和疫苗中的應用。
【背景技術】
[0002] 膽固醇-25-輕化酶（cholesterol-25_hydroxylase，CH25H)及其催化形成的代謝 產(chǎn)物25-OHC(25羥基膽固醇）與脂代謝密切相關，例如25-OHC能抑制固醇的合成。近來的 研究表明CH25H屬于干擾素刺激基因家族成員（ISG基因），研究表明CH25H及其代謝產(chǎn)物 25-OHC具有廣譜抗病毒活性，然而其確切的抗病毒機制及其在調(diào)控免疫應答，尤其是調(diào)控 抗原特異性免疫應答方面還不清楚。
[0003] 人類獲得性免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV)及其引起的艾 滋病（AIDS)已成為全球公共衛(wèi)生的嚴峻挑戰(zhàn)。截止2013年底，全球現(xiàn)存HIV感染者已增 至3500多萬人，累記死亡病例超過3900萬人。加強艾滋病的預防和控制已是刻不容緩的 問題。
[0004] 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（antiretroviral therapy，ART)是當前控制HIV病毒感染和 傳播的有效方式，但無法治愈HIV感染，而且也未明顯改善HIV患者持續(xù)的炎癥反應和免疫 活化狀態(tài)，導致脂代謝異常、心血管疾病、神經(jīng)性疾病等并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。越來越多的 實驗和臨床數(shù)據(jù)表明炎癥因子與HIV的免疫病理和AIDS進程的發(fā)展相關。其中，IL-I β 和IL-6被認為與CD4+ T細胞周轉(zhuǎn)的頻率和免疫功能的衰減有關，而且IL-I β信號可能是 腸潘納斯細胞（Paneth cells)早期感知病毒感染并導致腸上皮損傷的重要因子；IL-17和 可溶性⑶14等直接或間接地參與了 AIDS相關疾病發(fā)生；TNF- α是導致HIV患者不能有效 控制病毒載量的另一重要炎癥性因子等。因此，亟需尋找和開發(fā)能夠同時調(diào)節(jié)機體代謝和 免疫應答的藥物來控制機體的全身性炎癥反應和免疫活化狀態(tài)，這樣更有益于減緩甚至治 愈HIV患者的疾病進程。
[0005] 此外，HIV疫苗仍然被認為是控制HIV傳播的最有效手段，但仍未有HIV疫苗研發(fā) 成功。誘導產(chǎn)生具有保護效應的CD8+ T細胞免疫反應和HIV廣譜中和抗體是當今HIV疫苗 設計的一個重要方向，而且⑶8+ T淋巴細胞和抗體的產(chǎn)生均與⑶4+ T淋巴細胞密切相關。 然而，HIV病毒的一個重要生物學特征是嗜⑶4+ T淋巴細胞，尤其是效應性的記憶⑶4+ T 淋巴細胞。這就提示我們艾滋病疫苗的難度非同尋常，因為接種了利用當今免疫學理論設 計出的常規(guī)疫苗后一般均會同時誘導產(chǎn)生⑶4+ T和⑶+ 8 T淋巴細胞免疫應答。事實上， 近期兩項HIV疫苗臨床試驗（STEP和HVTN-503)遭到失敗，其原因還待深入探討，但數(shù)據(jù)表 明這些疫苗產(chǎn)生的能高度增殖的HIV/SIV Gag/Tat特異性CD4+ T細胞可能與該疫苗的失 敗有相關性。因此，在T細胞靶向的HIV疫苗研究中，精確調(diào)控疫苗誘導產(chǎn)生的CD4+ T細 胞免疫反應和保護性CD8+ T細胞免疫反應將非常重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述存在的問題，本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)CH25H及其代謝產(chǎn)物25-OHC能有 效調(diào)節(jié)機體的免疫應答，表現(xiàn)為顯著抑制炎癥反應，降低非特異的細胞增殖和激活，降低艾 滋病毒特異性⑶4+ T淋巴細胞免疫應答。本發(fā)明進一步CH25H及其代謝產(chǎn)物25-OHC的 這種免疫調(diào)節(jié)作用可作為新型艾滋病疫苗的免疫調(diào)節(jié)劑，研究表明這種新型艾滋病疫苗產(chǎn) 生了理想的免疫應答效果。本發(fā)明將有利于開發(fā)新型有效的T細胞靶向的艾滋病藥物和疫 苗。
[0007] 本發(fā)明的目的在于提供25-OHC在調(diào)節(jié)免疫應答中的應用。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供25-OHC作為免疫調(diào)節(jié)劑在發(fā)展新型疫苗中的應用。
[0009] 本發(fā)明所采取的技術方案是： 一種免疫調(diào)節(jié)劑，該免疫調(diào)節(jié)劑為膽固醇-25-羥化酶的編碼基因、膽固醇-25-羥化 酶、25-羥基膽固醇中的至少一種。
[0010] 進一步的，上述免疫調(diào)節(jié)劑作為疫苗的免疫調(diào)節(jié)劑的應用。
[0011] 進一步的，上述疫苗為艾滋病疫苗。
[0012] 進一步的，上述艾滋病疫苗中抗原的基因選自gag、env、pol、nef、vif、tat、vpr、 vpx、rev中至少一種。
[0013] 進一步的，上述疫苗的形式為重組蛋白疫苗、重組質(zhì)粒DNA疫苗或重組病毒載體 疫苗。
[0014] 上述免疫調(diào)節(jié)劑在制備防治炎癥藥物中的應用。
[0015] 進一步的，上述炎癥為脂多糖引起的炎癥。
[0016] 進一步的，上述炎癥為病毒引起的炎癥。
[0017] 進一步的，上述病毒為HIV。
[0018] 進一步的，上述炎癥為炎癥應答、非特異細胞增殖中的至少一種。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是： 1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 25-OHC能顯著抑制炎癥免疫反應，其可抑制免疫細胞過高表達的 IL-Ib和TNF-a，對病毒(如HIV)感染患者持續(xù)性免疫活化和炎癥反應的調(diào)節(jié)有很重要的應 用價值。
[0020] 2)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 25-OHC能在不影響抗原特異性T淋巴細胞增殖的情況下，強烈抑 制有絲分裂原刺激的淋巴細胞過度增殖效應，這對減少HIV病毒感染導致細胞增殖活化以 及減少HIV感染的靶標細胞有重要意義。
[0021] 3)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 25-OHC能調(diào)節(jié)機體的抗原性特異免疫應答，例如可抑制CD4+ T 淋巴細胞分泌IL-2和TNF-a的能力，但卻不影響CD8+ T細胞的免疫應答和體液免疫應答。 這對減少HIV病毒感染的靶標細胞有重要意義。
[0022] 4)將25-OHC作為HIV疫苗的免疫調(diào)節(jié)劑，提高疫苗的免疫效果，可普遍用于預防 和治療艾滋病。以上所述的免疫調(diào)節(jié)作用有助于新一代HIV疫苗的設計，即在不影響機體 保護性CD8+T細胞免疫功能的情況下，盡量降低CD4+ T細胞免疫應答。這些實驗數(shù)據(jù)為新 型HIV疫苗策略進入臨床前和臨床試驗奠定了基礎。
[0023] 5)本發(fā)明所述的抗炎癥反應和弱化⑶4+ T淋巴細胞免疫反應的方法同樣適用于 其它相關自身免疫性疾病的防治。
【附圖說明】
[0024] 圖1為一定濃度的25-OHC對體外培養(yǎng)的淋巴細胞無明顯毒性作用；（A)原代淋 巴細胞或淋巴細胞系用不同濃度25-OHC處理24 h后的細胞存活率；（B)原代淋巴細胞 用不同濃度25-OHC處理120 h后的細胞存活率；通過CCK-8 kit進行檢測并計算得到 細胞存活率； 圖2為25-OHC抑制LPS誘導的炎癥反應；獼猴PBMC與不同濃度25-OHC和LPS共孵 育后，qRT -PCR定量檢測炎癥細胞因子的表達量變化，包括（A)/Z7戌（B) TM^(C) (D) CCL4-, 圖3為25-OHC顯著抑制有絲分裂原刺激的淋巴細胞非特異性增殖；CFSE染色的淋巴 細胞用25-OHC和非特異性刺激物共孵育4天后，通過多色流式技術分析淋巴細胞亞群的增 殖情況，A為淋巴細胞亞群增殖流式結果分析策略，B為25-OHC對ConA刺激的小鼠脾臟T 淋巴細胞增殖的影響；C為25-OHC對有絲分裂原PMA+Ionomycin或ConA刺激的獼猴PBMC 中T淋巴細胞亞群增殖的影響；D為25-OHC對用R848+IL-2刺激的小鼠脾臟B淋巴細胞增 殖的影響，圖示所述的"stimulator"為R848和IL-2 ; 圖4為免疫期間連續(xù)尾靜脈注射25-OHC不對小鼠主要生理指標產(chǎn)生明顯的影響；（A) 小鼠免疫策略；B為小鼠實驗期間的體重變化記錄；C和D分別為小鼠全血白細胞（WBC)絕 對數(shù)目和淋巴細胞（LYM)比例；E和H分別為小鼠嗜中性粒細胞（NEU)、單核細胞（MONO)，嗜 酸性粒細胞（EOS)和嗜堿性粒細胞（BASO)占全血比重檢測；圖中Gl組為Ad5-Empty(不攜帶 目的基因的腺病毒免疫原)+乙醇（Eth);G2組為Ad5-SIVenv(攜帶SIV Env基因的腺病毒免 疫原)+乙醇；G3 組為 Ad5-SIVenv+l yg/20 g 體重的 25-OHC;G4 組為 Ad5-SIVenv+4yg/20 g體重的25-OHC ; 圖5為低劑量的25-OHC促進體內(nèi)IFN- γ ELISP0T細胞免疫應答；A和B分別為小鼠 初免3周和加強免疫2周后脾臟抗原特異性總IFN- γ的應答能力； 圖6為25-OHC顯著抑制體內(nèi)抗原特異性CD4+ T淋巴細胞分泌細胞因子的能力；小鼠初 免3周后，多色流式技術分析小鼠脾淋巴細胞分泌細胞因子的能力；（A)單獨分泌IFN- γ， TNF- α或者IL-2的⑶4+ T淋巴細胞比例；（B)雙功能⑶4+ T淋巴細胞分泌IL-2/TNF- α或 IL-2/IFN- γ的能力；（C)分泌IFN- γ，TNF- α或者IL-2的CD8+ T淋巴細胞比例；（D)雙 功能CD8+ T淋巴細胞分泌E-2/TNF- α的能力；圖中Gl組為Ad5-Empty (不攜帶目的基因 的腺病毒免疫原）+乙醇（Eth);G2組為Ad5-SIVenV(攜帶SIVEnV基因的腺病毒免疫原）+ 乙醇；G3 組為 Ad5-SIVenv+l μ g/20 g 體重的 25-OHC ;G4 組為 Ad5-SIVenv+4 μ g/20 g 體 重的 25-OHC ; 圖7為適量的25-OHC不影響脾臟或骨髓中IgG抗體分泌B淋巴細胞的形成；A和C分 別為ELISP0T檢測SIV gpl40特異性的抗體分泌的漿細胞和記憶B淋巴細胞的數(shù)目；B和 D分別為ELISP0T檢測總的的漿細胞和記憶B淋巴細胞的數(shù)目；E為小鼠血清中SIV env抗 原特異性結合抗體滴度； 圖8為構建表達Ch25h基因的重組腺病毒（Ad5-Ch25h)的過程；A為Ad5-Ch25h構建 示意圖；B、C、D均為構建Ad5-Ch25h重組腺病毒載體的電泳鑒定圖。
【具體實施方式】
[0025] -種免疫調(diào)節(jié)劑，該免疫調(diào)節(jié)劑為膽固醇-25-羥化酶的編碼基因、膽固醇-25-羥 化酶、25-羥基膽固醇中的至少一種。
[0026] 優(yōu)選的，上述免疫調(diào)節(jié)劑作為疫苗的免疫調(diào)節(jié)劑的應用