MUC1-Fc多肽疫苗及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤DNA疫苗和病毒載體疫苗領(lǐng)域，尤其涉及一種MUCl-Fc多肽疫苗 及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤細(xì)胞在其發(fā)生、發(fā)展過程中，由于細(xì)胞的基因突變或表達(dá)調(diào)控會表達(dá)一些新 的抗原或過表達(dá)一些抗原，而這些新抗原作為"非己物質(zhì)"，可以被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識別和 殺傷，機(jī)體可以通過天然和獲得性免疫抵抗腫瘤。然而，腫瘤在人體的免疫功能作用下仍然 能夠發(fā)展、轉(zhuǎn)移，表明腫瘤也有自己的保護(hù)機(jī)制。腫瘤細(xì)胞可以通過對自身表明抗原的修飾 及改變腫瘤周圍的微環(huán)境來逃避機(jī)體的免疫識別和攻擊，即腫瘤的免疫逃逸。而腫瘤疫苗 則可以打破自身免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的耐受，活化腫瘤特異性T細(xì)胞或誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤特異 的抗體，激活免疫識別，達(dá)到殺傷腫瘤的目的。
[0003] 許多研宄表明，腫瘤細(xì)胞表面的抗原多肽能夠有效激發(fā)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，有 學(xué)者通過從腫瘤表面洗脫的抗原肽以及來自腫瘤內(nèi)部特異性的蛋白制備出肽疫苗，其可以 通過DC細(xì)胞的提呈作用引發(fā)CTL反應(yīng)，另外熱休克蛋白-肽復(fù)合物具有良好的免疫原性， 可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答，此外HSP70可誘導(dǎo)T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤，并誘發(fā)TFA-a、IL-2等細(xì)胞因 子的表達(dá)。自1989年第一個人類特異性抗原報道以來，目前已經(jīng)有許多腫瘤抗原被發(fā)現(xiàn)。 相對于其他類型的抗原（蛋白質(zhì)、DNA疫苗、病毒載體抗原等），來源于腫瘤相關(guān)抗原的抗 原肽具有特異性高、安全等優(yōu)勢，而且，還可以通過氨基酸置換、改變肽的構(gòu)象及修飾氨基 酸殘基等方法提高肽的免疫原性。然而腫瘤細(xì)胞表達(dá)遞呈的抗原多肽，既有優(yōu)勢表位，也存 在弱勢甚至抑制性表位，而且表面抗原肽的表達(dá)量很低，必須通過大量腫瘤細(xì)胞的免疫，才 能提供足夠的抗原。因此不得不探索如何尋找高純度高效的特異性腫瘤抗原多肽來制備疫 苗。
[0004]MUCl是由mucl基因表達(dá)的一種高糖基化（糖基化大于50% )、高分子量 (Mr>200X103)蛋白，又稱附膜蛋白，是跨膜分子。它在上皮更新與分化，維持上皮完整性 和癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移等方面起到重要的作用。MUCl的多肽骨架含有空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定一致的可 變數(shù)目重復(fù)序列（VNTR)，抗原決定簇主要集中在這一區(qū)域。正常細(xì)胞表面的MUCl的核心 肽被外周糖鏈掩蓋，而在癌變細(xì)胞表面，由于畸形糖基化和糖基化不完全等原因，腫瘤細(xì)胞 的MUCl在糖鏈上有所改變，導(dǎo)致蛋白核心肽的部分暴露，使新的腫瘤相關(guān)抗原表位和糖原 表位暴露出來。糖基化不完全的MUCl廣泛分布（90%的實體瘤和多種非實體瘤）并異常豐 富的表達(dá)于癌細(xì)胞表面。因此MUCl已經(jīng)成為一種非常有潛力的治療性腫瘤疫苗靶標(biāo)。 [0005] 然而目前所用的MUCl多肽疫苗由于表位太小，因此只能針對MHCI或MHCII，具 有MHC限制性因素，不能有效的激活CTL反應(yīng)。2011年，以色列的研宄人員開發(fā)了一種相對 較長的MUCl多肽腫瘤疫苗，此多肽疫苗同時包含有MHCI和MHCII結(jié)合表位，并且經(jīng)試驗 能和超過50%白種人群的CD4+和CD8+T細(xì)胞的HLA結(jié)合。經(jīng)體外和小鼠體內(nèi)實驗表明，其 能有效的激活CD4+細(xì)胞以及CD8+細(xì)胞的CTL反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種MUCl-Fc多肽疫苗及其制備方法和應(yīng)用，特別是一種能同時含 有MHCI和MHCII結(jié)合表位的MUCl+免疫球蛋白Fc段的多肽疫苗及其制備方法和應(yīng)用。
[0007] 為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] 第一方面，本發(fā)明提供了一種MUCl-Fc多肽疫苗，其包含帶免疫球蛋白Fc段的 MUCl抗原多肽。
[0009] 本發(fā)明首先利用生物信息學(xué)的方法，在MUCl蛋白原始序列基礎(chǔ)上進(jìn)行MUCl腫瘤 多肽以及人類白細(xì)胞抗原（HLA)結(jié)合預(yù)測，然后對預(yù)測的序列進(jìn)行化學(xué)合成多肽，優(yōu)化改 良，得到效果最好的肽段后將其表達(dá)序列與免疫球蛋白Fc段融合表達(dá)，最后純化得到本發(fā) 明的帶免疫球蛋白Fc段的MUCl抗原多肽序列。
[0010] 本發(fā)明中，所述帶免疫球蛋白Fc段的MUCl抗原多肽序列如SEQIDNO: 1所示：
[0011]SEQIDNO:I:Kosak序列+MUCl+接頭（linker)+Fc段，其序列如下:
【主權(quán)項】
1. 一種MUCl-Fc多肽疫苗，其特征在于，其包含帶免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽。
2. 如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述帶免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽的 序列如SEQ ID NO: 1所示。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗還包括載體； 優(yōu)選地，所述載體為生物可降解材料； 優(yōu)選地，所述載體為聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚乙二醇、水溶性維生素E衍生物、聚乳 酸、聚己內(nèi)酯或1，2-二油?；?3-三甲基氨基內(nèi)烷中的任意一種或至少兩種的組合； 優(yōu)選地，所述載體為1，2-二油酰基-3-三甲基氨基內(nèi)烷。
4. 如權(quán)利要求1-3任一項所述的疫苗的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟： (1) 融合免疫球蛋白Fe段到MUCl多肽片段，獲得帶免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽 序列，并通過Red/ET同源重組或酶切酶連的方法制備對應(yīng)的表達(dá)載體，再通過生物表達(dá)和 純化得到帶免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽； (2) 利用載體包被所述的帶免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽。
5. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟⑴中，利用Red/ET同源重 組方法，設(shè)計上游同源臂：(HindIII) CTCTAGCGTTTAAACTTMOeiI;下游同源臂：(BamHI) GGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGA，將所述帶免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽序列構(gòu)建到載體 上，然后在大腸桿菌中表達(dá)和純化； 優(yōu)選地，所述載體為pET32a、pET22b、pET28a、pET29a、pET9a或pET3a中的任意一種。
6. 如權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)中，所述載體為生物可降 解材料； 優(yōu)選地，所述載體為聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚乙二醇、水溶性維生素E衍生物、聚乳 酸、聚己內(nèi)酯或1，2-二油酰基-3-三甲基氨基內(nèi)烷中的任意一種或至少兩種的組合； 優(yōu)選地，所述載體為1，2-二油?；?3-三甲基氨基內(nèi)烷。
7. 如權(quán)利要求3-6任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)中，所述包被包括以 下步驟： 1) 將載體用有機(jī)溶劑溶解至濃度為I uM/mL ; 2) 用氮?dú)夂懔鲗⒂袡C(jī)溶劑吹干，使載體形成均勻的膜結(jié)構(gòu)并將其干燥過夜； 3) 加入用PBS稀釋過的所述帶免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽，使載體被充分水合， 超聲10-15min，過濾，4°C保存?zhèn)溆茫? 優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑為氯仿與甲醇的體積比為2:1。
8. 如權(quán)利要求3-7任一項所述的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (1) 融合免疫球蛋白Fe段到MUCl多肽片段，獲得帶免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽 序列，利用Red/ET同源重組方法，設(shè)計上游同源臂：(HindIII) CTCTAGCGTTTAAACTTAAGCTT： 下游同源臂：(BamHI)GGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGA,將帶免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽 序列構(gòu)建到pET32a載體上，然后在大腸桿菌中表達(dá)和純化得到帶免疫球蛋白Fe段的MUCl 抗原多肽； (2) 將1，2-二油?；?3-三甲基氨基內(nèi)烷用有機(jī)溶劑溶解至濃度為Iy M/mL，其中， 所述有機(jī)溶劑為氯仿與甲醇的體積比為2:1 ;用氮?dú)夂懔鲗⒂袡C(jī)溶劑吹干，使1，2-二油酰 基-3-三甲基氨基內(nèi)烷形成均勻的膜結(jié)構(gòu)并將其干燥過夜；加入用PBS稀釋過的所述帶免 疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽，使1，2-二油酰基-3-三甲基氨基內(nèi)烷被充分水合，水合 結(jié)束后，在被冰塊預(yù)冷的超聲洗滌槽中，超聲10-15min，用0. 22 yM過濾器過濾3次，4°C保 存?zhèn)溆谩?br>9. 如權(quán)利要求1-3任一項所述的疫苗在制備治療或預(yù)防癌癥藥物中的應(yīng)用。
10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述癌癥為乳腺癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、 前列腺癌、宮頸癌或食道癌中的任意一種或至少兩種的組合。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種MUC1-Fc多肽疫苗及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明所述的多肽疫苗包含帶免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽，所述多肽的序列如SEQ ID NO:1所示；通過基因工程技術(shù)，將所述的帶免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列構(gòu)建到載體上，然后在大腸桿菌中表達(dá)和純化，再經(jīng)脂質(zhì)體等載體包被即可得到本發(fā)明的MUC1-Fc多肽疫苗。本發(fā)明的MUC1-Fc多肽疫苗同時包含有MHC I和MHC II結(jié)合表位，可以突破MHC限制性因素，有效激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)，對腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用，可以取得更好的預(yù)防和治療效果。
【IPC分類】A61K39-395, A61P35-00, A61P35-04, A61K39-00
【公開號】CN104800838
【申請?zhí)枴緾N201510175146
【發(fā)明人】于浩洋, 李正成, 蘇靜
【申請人】蘇靜
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年4月14日