一種七肽emlqppl及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種合成多肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物活性肽是對(duì)機(jī)體的功能或狀態(tài)具有積極作用并最終影響機(jī)體健康的特殊蛋 白質(zhì)片段。相較于蛋白質(zhì)而言，小分子肽片段的優(yōu)越性主要體現(xiàn)在：更易被人體吸收利用； 活性高，在較小濃度下即可發(fā)揮其特有的生理作用；分子量小，易于修飾和改造，能夠通過 人工化學(xué)合成等。而相較于單一的氨基酸而言，小分子肽除了具有特殊的生理活性外，在 吸收通道和吸收速度上也具有氨基酸無可比擬的優(yōu)越性。已有研究證實(shí)，人體小腸存在專 門的低聚肽吸收通道，人體攝入的蛋白質(zhì)經(jīng)過多種消化酶的水解，主要以低肽的形式被吸 收。許多研究表明，各種來源的生物活性肽具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降壓、降血糖等多種 作用，成為生物醫(yī)藥和保健品開發(fā)的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種具有體外抗腫瘤活性的合成多肽即合成七肽，可應(yīng)用于 生物制藥領(lǐng)域。
[0004] 本發(fā)明選取兩種腫瘤細(xì)胞MCF-7和Η印G-2為研究對(duì)象，使用MTT法測(cè)定合成肽的 體外抑制活性。
[0005] 本發(fā)明所述的合成多肽縮寫為EMLQPPL，分子量827. 5,序列為： Glu-Met-Leu-Gln-Pro-Pro-Leu。其中， Glu表示英文名稱為Glutamicacid，中文名稱為谷氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Met表示英文名稱為Methionine，中文名稱為甲硫氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Leu表示英文名稱為L(zhǎng)eucine，中文名稱為亮氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Gin表示英文名稱為Glutamine，中文名稱為谷氨酰胺的氨基酸的相應(yīng)殘基； Pro表示英文名稱為Proline，中文名稱為脯氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Leu表示英文名稱為L(zhǎng)eucine，中文名稱為亮氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基。
[0006] 本發(fā)明所述的氨基酸序列采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，通過樹脂的篩選，合理的多肽合 成方法。將目標(biāo)多肽的C-端羧基以共價(jià)鍵形式與一個(gè)不溶性的高分子樹脂相連，然后以這 個(gè)氨基酸的氨基作為起點(diǎn)，與另一分子氨基酸的羧基作用形成肽鍵。不斷重復(fù)這一過程，即 可以得到目標(biāo)多肽產(chǎn)物。合成反應(yīng)完成后，去除保護(hù)基，將肽鏈與樹脂分離，即得到目標(biāo)產(chǎn) 物。多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過程，固相合成順序從C端向N端合成。
[0007] 本發(fā)明將終濃度為100-500Pg/mL的合成多肽與兩種腫瘤細(xì)胞MCF-7和Η印G-2 混勻，孵育48h后，經(jīng)ΜΤΤ法檢測(cè)，對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率達(dá)到7. 46%~39. 95%，對(duì)肝癌細(xì)胞 Η印G-2和乳腺癌細(xì)胞MCF-7的體外增殖抑制率分別為14. 10%-39. 95%和7. 46%-34. 39%。所 述七肽EMLQPPL在濃度為50(^g/mL時(shí)，對(duì)肝癌細(xì)胞Η印G-2和乳腺癌細(xì)胞MCF-7的體外增 殖抑制率分別為39. 95%和34. 39%，可在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中應(yīng)用。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果： 本發(fā)明首次合成了該肽，并且采用MTT方法檢測(cè)了合成多肽的體外抗腫瘤活性，所述 合成多肽具有一定的腫瘤細(xì)胞抑制能力。
【附圖說明】
[0009]圖 1 為合成多肽Glu-Met-Leu-Gln-Pro-Pro-Leu的HPLC圖。
[0010] 圖 2 為合成多肽Glu-Met-Leu-Gln-Pro-Pro-Leu的ESI-MS圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 以下結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的實(shí)施和保護(hù)范圍不限于 此。對(duì)于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。
[0012] 多肽固相合成 選用高分子樹脂（中肽生化有限公司），按照氨基酸序列Glu-Met-Leu-Gln-Pro-Pro-Leu的特征，先將Leu的羧基以共價(jià)鍵的形式與一個(gè)樹脂相 連，然后Leu的氨基和Pro的羧基縮水反應(yīng)，處理后，再添加Pro,Pro的氨基和Pro的 羧基反應(yīng)，依次從右到左添加氨基酸，加好最后一個(gè)Glu氨基酸后，再切除樹脂即得到目 標(biāo)多肽。采用高效液相色譜進(jìn)行純化，色譜柱型號(hào)為PhenomenexC1S，尺寸4. 6*150mm， 流動(dòng)相A:含有0. 1%三氟乙酸（TFA)的水；流動(dòng)相B:含有0. 09%TFA的溶液（80%乙 腈+20%水）；20min內(nèi)B相由14. 0%上升到24. 0%，流速1. 0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。 液氮速凍，冷凍干燥，得到最后的產(chǎn)品，要求純度達(dá)到98. 2%以上，并經(jīng)ESI-MS鑒定結(jié) 構(gòu)。圖1為合成多肽Glu-Met-Leu-Gln-Pro-Pro-Leu的HPLC圖。圖2為合成多肽 Glu-Met-Leu-Gln-Pro-Pro-Leu的ESI-MS圖。
[0013] 合成多肽的體外抗腫瘤活性 通過MTT比色法分析各多肽組分對(duì)肝癌細(xì)胞Η印G-2和乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長(zhǎng)抑制 作用。具體操作步驟如下： 1) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)0. 25%(體積)的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入相應(yīng)的 完全培養(yǎng)基終止消化并重懸細(xì)胞，血球平板計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度至5X104個(gè)/mL， 加至96孔板中，每孔100μL，于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 2) 培養(yǎng)24h后細(xì)胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為200μL的含有不同濃度待測(cè) 樣品的新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并以PBS為陰性對(duì)照，于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 3) 48h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鮮基礎(chǔ)培 養(yǎng)基180μL;于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)； 4) 4h后，棄去含有MTT的培養(yǎng)液，加入150μLDMS0后于微型振蕩器上振蕩15min， 490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值并計(jì)算抑制率： 癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%)=((對(duì)照組0D-空白組0D)-(給藥組0D-空白組0D))八（對(duì)照 組0D-空白組0D) )X100 應(yīng)用實(shí)施例1 腫瘤細(xì)胞MCF-7和Η印G-2各100μL細(xì)胞懸液（5X104個(gè)/mL)，加至96孔板中，于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后細(xì)胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為200μL的100 Kg/mL的多肽樣品的新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并以PBS為陰性對(duì)照，于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中培 養(yǎng).。48h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng) 基180μL;于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；4h后，棄去含有ΜΤΤ的培養(yǎng)液，加入150 μLDMSO后于微型振蕩器上振蕩15min，490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值并計(jì)算抑制率，由表 1可知，100Kg/mL的多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞Η印G-2和MCF-7的抑制率分別14. 10%和7. 46%。
[0014]表 1
應(yīng)用實(shí)施例2 腫瘤細(xì)胞MCF-7和Η印G-2各100μL細(xì)胞懸液（5Χ104個(gè)/mL)，加至96孔板中，于 37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后細(xì)胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為200μL 的200Pg/mL的多肽樣品的新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并以PBS為陰性對(duì)照，于37 °C恒溫C02培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)。48h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鮮基 礎(chǔ)培養(yǎng)基180μL;于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；4h后，棄去含有ΜΤΤ的培養(yǎng)液， 加入150μLDMS0后于微型振蕩器上振蕩15min，490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值并計(jì)算抑 制率，由表1可知，200Pg/mL的多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞Η印G-2和MCF-7的抑制率分別19. 77%和 19. 25%〇
[0015] 應(yīng)用實(shí)施例3 腫瘤細(xì)胞MCF-7和Η印G-2各100μL細(xì)胞懸液（5X104個(gè)/mL)，加至96孔板中，于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24h后細(xì)胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為200μL的300 Kg/mL的多肽樣品的新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并以PBS為陰性對(duì)照，于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中培 養(yǎng).48h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng) 基180μL;于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；4h后，棄去含有ΜΤΤ的培養(yǎng)液，加入150 μLDMS0后于微型振蕩器上振蕩15min，490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值并計(jì)算抑制率，由表 1可知，300Pg/mL的多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞Η印G-2和MCF-7的抑制率分別26. 48%和29. 92%。
[0016] 應(yīng)用實(shí)施例4 腫瘤細(xì)胞MCF-7和Η印G-2各100μL細(xì)胞懸液（5X104個(gè)/mL)，加至96孔板中，于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24h后細(xì)胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為200μL的400 Kg/mL的多肽樣品的新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并以PBS為陰性對(duì)照，于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中培 養(yǎng).48h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng) 基180μL;于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；4h后，棄去含有ΜΤΤ的培養(yǎng)液，加入150 μLDMS0后于微型振蕩器上振蕩15min，490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值并計(jì)算抑制率，由表 1可知，400Pg/mL的多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞Η印G-2和MCF-7的抑制率分別30. 14%和32. 01%。
[0017] 應(yīng)用實(shí)施例5 腫瘤細(xì)胞MCF-7和Η印G-2各100μL細(xì)胞懸液（5X104個(gè)/mL)，加至96孔板中，于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24h后細(xì)胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為200μL的500 Kg/mL的多肽樣品的新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并以PBS為陰性對(duì)照，于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中培 養(yǎng).48h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng) 基180μL;于37 °C恒溫C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；4h后，棄去含有ΜΤΤ的培養(yǎng)液，加入150 μLDMSO后于微型振蕩器上振蕩15min，490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值并計(jì)算抑制率，由表 1可知，500Pg/mL的多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞Η印G-2和MCF-7的抑制率分別39. 95%和34. 39%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種七肽EMLQPPL，其特征是該合成七肽EMLQPPL的氨基酸序列為Glu-Met-Leu-Gln-P r〇-Pr〇-Leu〇2. 權(quán)利要求1所述一種七肽EMLQPPL的應(yīng)用，其特征在于將終濃度為100-500噸/ mL的合成多肽與兩種腫瘤細(xì)胞MCF-7和H印G-2混勻，孵育48 h后，對(duì)肝癌細(xì)胞H印G-2和 乳腺癌細(xì)胞MCF-7的體外增殖抑制率分別為14. 10%-39. 95%和7. 46%-34. 39% ;所述七肽 EMLQPPL 的濃度為 100-500 Pg/mL。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述七肽EMLQPPL在濃度為500Pg/mL時(shí)， 對(duì)肝癌細(xì)胞H印G-2和乳腺癌細(xì)胞MCF-7的體外增殖抑制率分別為39. 95%和34. 39%。4. 權(quán)利要求1所述的七肽EMLQPPL在制備生物醫(yī)藥中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種七肽EMLQPPL及其應(yīng)用，所述合成多肽的氨基酸序列如下所示：Glu-Met-Leu-Gln-Pro-Pro-Leu，縮寫為EMLQPPL，分子量827.5，純度98.2%。本發(fā)明的多肽使用多肽合成儀，采用固相合成法合成。通過體外抗腫瘤活性檢測(cè)，在100-500μg/mL范圍內(nèi)，本發(fā)明的多肽對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2和乳腺癌細(xì)胞MCF-7均呈現(xiàn)出了一定的抑制效果。在500μg/mL時(shí)，對(duì)HepG-2和MCF-7的體外增殖抑制率分別為39.95%和34.39%。本發(fā)明提供一種具有體外抗腫瘤活性的合成多肽，可應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域。
【IPC分類】C07K7/06, A61K38/08, A61P35/00
【公開號(hào)】CN105237624
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510634091
【發(fā)明人】張學(xué)武, 何勝潔
【申請(qǐng)人】華南理工大學(xué)
【公開日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2015年9月28日