病毒性心肌炎環(huán)肽疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種新型有效的病毒性心肌炎環(huán)肽疫苗，所述環(huán)肽疫苗是由B3型柯薩奇病毒VP1環(huán)肽任選輔以藥用賦形劑和/或佐劑組成。所述VP1環(huán)肽是通過蛋白質(zhì)內(nèi)含子反式剪接將B3型柯薩奇病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1環(huán)化獲得。與傳統(tǒng)多肽疫苗相比，本發(fā)明的環(huán)肽疫苗不僅具備傳統(tǒng)多肽疫苗的優(yōu)點(diǎn)，如具有很強(qiáng)的免疫原性，免疫動(dòng)物可誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，且重組表達(dá)的環(huán)肽疫苗不合有感染性組分，無致病性，應(yīng)用前景廣闊。同時(shí)環(huán)肽疫苗克服了線狀多肽疫苗易降解的缺點(diǎn)，可以在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下，抵御各種酶的降解，提高其生物活性，延長(zhǎng)半衰期，提高蛋白的代謝穩(wěn)定性和生物利用度，增強(qiáng)多肽疫苗的免疫應(yīng)答，是一種安全、有效的預(yù)防和/或治療CVB3型病毒性心肌炎的多肽疫苗。
【專利說明】病毒性心肌炎環(huán)肽疫苗及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)肽疫苗及其制備方法，具體地說，涉及一種病毒性心肌炎環(huán)肽疫苗 及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)肽鍵的結(jié)構(gòu)可將多肽分為直鏈肽和環(huán)肽。其中直鏈肽的研究最為廣泛和深 入，雖然許多直鏈肽在體外具有很好的生物活性和穩(wěn)定性，但是進(jìn)入體內(nèi)后因體內(nèi)環(huán)境復(fù) 雜，存在各種各樣的酶，導(dǎo)致直鏈肽在酶的作用下很快降解，活性喪失；另外，直鏈肽在液相 里的構(gòu)象柔性使得不大容易符合受體的構(gòu)象要求，這些不利因素造成多肽疫苗仍有許多問 題有待解決。而環(huán)肽因其具有明確的固定構(gòu)象，能夠與受體很好地契合，加上分子內(nèi)不存在 游離的氨基端和羧基端使得對(duì)氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低，因此其生物活性半衰期 長(zhǎng)，受體選擇性高，使得環(huán)肽的代謝穩(wěn)定性和生物利用度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于直鏈肽。
[0003] 病毒性心肌炎是指病毒感染引起的心肌局限性或彌漫性的急性或慢性炎癥病變， 屬于感染性心肌疾病。柯薩奇病毒性心肌炎主要由B3型柯薩奇病毒（CVB3)感染所致，青 壯年發(fā)病較高，是一種常見、多發(fā)的心血管系統(tǒng)疾病，目前尚無有效的預(yù)防或治療疫苗。
[0004] 多肽疫苗具有抗病毒、抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗寄生蟲感染功能。由于多肽疫苗價(jià)廉、安 全、特異性強(qiáng)、容易保存和應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)，越來越受到重視。但也因其免疫原性差、功效低以及 在體內(nèi)易降解和不可復(fù)制性等不足影響了免疫效果。
[0005] CVB3為球形二十面體對(duì)稱無包膜病毒，其核衣殼由4種多肽VP1、VP2、VP3和VP4 共60個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白組成，其中VP1為CVB3的主要結(jié)構(gòu)蛋白。研究表明VP1中含有多個(gè)可能 的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，具有較強(qiáng)的免疫原性，是其主要的中和抗原，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生 保護(hù)性免疫應(yīng)答，因此VP1是相對(duì)最好的預(yù)防或治療CVB3型病毒性心肌炎的疫苗候選靶抗 原。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種新型有效的病毒性心肌炎環(huán)肽疫苗。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供制備病毒性心肌炎環(huán)肽疫苗的方法。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的B3型柯薩奇病毒VP1環(huán)肽，其是通過蛋白質(zhì)內(nèi)含 子反式剪接將B3型柯薩奇病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1環(huán)化，即得VP1環(huán)肽。
[0009] 本發(fā)明還提供上述VP1環(huán)肽的制備方法，將B3型柯薩奇病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因與 蛋白內(nèi)含子基因融合表達(dá)，以大腸桿菌為宿主，通過蛋白質(zhì)內(nèi)含子反式剪接將線狀VP1蛋 白環(huán)化獲得VP1環(huán)肽。
[0010] 本發(fā)明中涉及的蛋白內(nèi)含子包括但不限于Rma DnaB intein等任一可將VP1成功 環(huán)化的蛋白內(nèi)含子。
[0011] 具體地，前述制備方法包括以下步驟：
[0012] 1)將Rma DnaB intein第388-428位氨基酸序列Ic及下游外顯子第一個(gè)氨基酸 殘基Ser的編碼基因序列（Ic+Ser)與VP1編碼基因的5'端融合，將Rma DnaB intein第 1-105位氨基酸的編碼基因序列IN與VP1編碼基因的3'端融合；
[0013] 2)將融合蛋白的編碼基因在大腸桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)，通過Rma DnaB intein的Ic 和IN的反式剪接將VP1蛋白的N末端和C末端通過肽鍵連接形成VP1環(huán)肽；
[0014] 3)VP1環(huán)肽以包涵體形式存在于大腸桿菌內(nèi)，裂解細(xì)胞后通過變性法以His-tag 標(biāo)簽純化得到VP1環(huán)肽。
[0015] 前述的制備方法，在37°C下誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白可使VP1的環(huán)化效率達(dá)到100%。
[0016] 通過蛋白質(zhì)內(nèi)含子反式剪接制備環(huán)狀VP1蛋白的示意圖見圖7。
[0017] 本發(fā)明還提供病毒性心肌炎環(huán)肽疫苗，其是將所述B3型柯薩奇病毒VP1環(huán)肽任選 輔以藥用賦形劑和/或佐劑組成。所述環(huán)肽疫苗可以為液體劑型或凍干劑型。
[0018] 本發(fā)明還提供上述環(huán)肽疫苗的制備方法，其是將所述B3型柯薩奇病毒VP1環(huán)肽任 選與藥用賦形劑和/或佐劑混合。
[0019] 本發(fā)明還提供一種融合蛋白Ic-VPl-IN，其中，VP1為B3型柯薩奇病毒結(jié)構(gòu)蛋白， Ic為Rma DnaB intein第388-428位氨基酸序列及下游外顯子第一個(gè)氨基酸殘基Ser，IN 為Rma DnaB intein第1-105位氨基酸序列。
[0020] 本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體中含有編碼上述融合蛋白 Ic-VP1_IN 的基因。
[0021] 本發(fā)明還提供含有編碼上述融合蛋白Ic-VPl-IN的基因的宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 系及工程菌。
[0022] 本發(fā)明還提供上述環(huán)肽疫苗在預(yù)防和/或治療病毒性心肌炎中應(yīng)用。可以將環(huán)肽 疫苗通過肌肉注射及其他在體內(nèi)有效的免疫方式實(shí)施免疫。例如，在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中， 采用腿部肌肉注射方式，在小鼠體內(nèi)實(shí)施免疫后，VP1環(huán)狀蛋白有效誘導(dǎo)CVB3特異性體液 和細(xì)胞免疫應(yīng)答，這些特異性全身免疫應(yīng)答比VP1線性蛋白疫苗顯著性強(qiáng)。且由該疫苗誘 導(dǎo)的特異性全身免疫應(yīng)答可保護(hù)小鼠免受CVB3的攻擊，不發(fā)生病毒性心肌炎，從而具備防 治病毒性心肌炎的作用。
[0023] 本發(fā)明的環(huán)肽疫苗與傳統(tǒng)多肽疫苗相比，不僅具備傳統(tǒng)多肽疫苗的優(yōu)點(diǎn)，如具有 很強(qiáng)的免疫原性，免疫動(dòng)物可誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，且重組表達(dá)的環(huán)肽疫苗不合有感染 性組分，無致病性，是一種應(yīng)用前景廣闊的預(yù)防性疫苗。同時(shí)環(huán)肽疫苗克服了線狀多肽疫苗 易降解的缺點(diǎn)，可以在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下，抵御各種酶的降解，提高其生物活性，延長(zhǎng)半衰期， 提高蛋白的代謝穩(wěn)定性和生物利用度，增強(qiáng)多肽疫苗的免疫應(yīng)答，是一種安全、有效的具有 強(qiáng)保護(hù)力的預(yù)防和/或治療CVB3型病毒性心肌炎的多肽疫苗。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中Rma DnaB intein環(huán)化載體示意圖。
[0025] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中VP1環(huán)肽的表達(dá)、純化及Western Blot鑒定結(jié)果；其中， Μ為蛋白Mark，1為未誘導(dǎo)的對(duì)照，2為IPTG終濃度ImM，37°C誘導(dǎo)4h ;3為IPTG終濃度ImM， 25°C誘導(dǎo)過夜；4為純化的VP1環(huán)肽，5為Western Blot檢測(cè)，P代表前體蛋白，即RB intein 和VP1的融合蛋白（RBc-VPl-RBn)，S代表RB intein剪接后的產(chǎn)物，即VP1環(huán)肽（C-VP1)。
[0026] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中C-VP1免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的CVB3特異性血清IgG水平。
[0027] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中C-VP1免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的CVB3特異性脾臟淋巴T細(xì) 胞CTL殺傷能力。
[0028] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中C-VP1免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的CVB3特異性脾臟Τ細(xì)胞增 殖能力。
[0029] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例3中C-VP1免疫小鼠產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用；末次免疫后2周， 以3倍LD 5(I劑量的CVB3腹腔感染小鼠，感染第7天體重下降水平（Α);小鼠第7天心臟病 理改變情況（B);感染第7天免疫小鼠的心功能情況（C)。
[0030] 圖7為通過蛋白質(zhì)內(nèi)含子反式剪接制備環(huán)狀VP1蛋白的示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí) 施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning :a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0032] 實(shí)施例1病毒性心肌炎環(huán)肽疫苗及其制備方法
[0033] 本實(shí)施例主要是通過將蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接結(jié)構(gòu)域與VP1蛋白融合表達(dá)，以大腸 桿菌為宿主，加入IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，蛋白質(zhì)內(nèi)含子在體內(nèi)自發(fā)發(fā)生反式剪接將VP1 蛋白的N末端和C末端以肽鍵連接形成VP1環(huán)肽。VP1環(huán)肽以包涵體的形式存在于大腸桿 菌體內(nèi)，經(jīng)過純化、復(fù)性等過程后獲得純的VP1環(huán)肽，即為病毒性心肌炎環(huán)肽疫苗。
[0034] 1.實(shí)施例中使用的質(zhì)粒、菌種、細(xì)胞、動(dòng)物及試劑如下：
[0035] 質(zhì)粒、病毒、動(dòng)物和細(xì)胞株：嗜心性CVB3 Nancy株，Hela細(xì)胞、基因工程S0型斷裂 蛋白內(nèi)含子Rma DnaB，即Rma DnaB intein由蘇州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院熊思東教授提供。 雄性BALB/c(H-2d)小鼠，6周齡，體重18-20克，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。宿主細(xì)菌 DH5 a、BL21 購自 Invitrogen 公司。
[0036] 免疫學(xué)試劑及材料：VP1237_249由上海吉爾生化有限公司合成；戊巴比妥鈉 (Sigma公司）；Brdu細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（Roche) ;LB培養(yǎng)基、Gibco血清（美國(guó)Life Technology公司）；基因合成委托上海Invitrogen公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠 IgG多克隆抗 體（SouthernBiotech公司）；限制性核酸內(nèi)切酶Bsal和BfuAI (NEB公司），HindllI和 BamHI (Takara 公司）；T4 DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶（Takara 公司）。
[0037] 2.實(shí)施過程如下：
[0038] 2. lpGEX-5X-l_VPl 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0039] 按照RNAex Reagent&System Kit (上海華舜生物技術(shù)有限公司）試劑盒說明書 操作，提取B3型柯薩奇病毒Nancy株總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照2-N First Strand cDNA Synthesis Kit (上海生工生物工程股份有限公司）進(jìn)行。設(shè)計(jì)VP1上、下游 引物（上游引物 Y -CCCAAGCTTGCCACCATGGGCCCAGTGGAAGACGCG-3 ^，下游引物 Y -CGGGA TCCTTACTAAAATGCGCCCGTATTTGTC-3')，分別含有 HindllI 和 BamHI 酶切位點(diǎn)，通過 PCR 擴(kuò) 增獲得VP1基因片段。純化回收VP1 DNA片段（小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，Axygen 公司），經(jīng)雙酶切后連入經(jīng)同樣雙酶切的載體PGEX-5X-1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感 受態(tài)細(xì)胞，篩選單陽性克隆。通過質(zhì)粒小量抽提試劑盒（Axygen公司）抽提質(zhì)粒，經(jīng)酶切及 測(cè)序鑒定成功構(gòu)建PGEX-5X-1-VP1重組質(zhì)粒。
[0040] 2. 2pERB-VPl重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0041] 基因工程S0型斷裂蛋白內(nèi)含子Rma DnaB，將其剪接結(jié)構(gòu)域的C端（包含下游外 顯子的第一個(gè)氨基酸Ser)和N端融合構(gòu)建到pET-28a載體上得到環(huán)化載體pERB，C端和N 端中間含有Bsal和BfuAI酶切位點(diǎn)（圖1)。
[0042] 以重組質(zhì)粒pGEX-5X-l-VPl為模板，通過PCR擴(kuò)增得到含有Bsal和BfuAI酶切位 點(diǎn)的VP1 DNA序列，并通過引物在VP1的C端引入His-tag純化標(biāo)簽（上游引物：5' -ggtc tcgctGGCCCCGTGGAAGACGCGATAAC-3'，下游引物：5' -acctgcagaccgccGTGGTGGTGGTGGTGGT GATTTGTCATTGTAGTGATGCTTTGC-3')。用 Bsal 和 BfuAI 分別雙酶切 PCR 產(chǎn)物和載體 pERB 序 列，T4連接酶連接上述產(chǎn)物，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，氨芐青霉素篩選，小抽陽性克隆 并送測(cè)序鑒定，正確的克隆即為PERB-VP1重組質(zhì)粒。
[0043] 2. 3融合蛋白的表達(dá)及VP1環(huán)狀蛋白的純化
[0044] 鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株，挑取單克隆接種到含氨芐抗 性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，按1 : 100的體積比將培養(yǎng)物接種于含氨芐抗性的 新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D6(l(lnm約為0. 8時(shí)加入終濃度為ImM的IPTG，37°C誘導(dǎo) 表達(dá)6h，或25°C誘導(dǎo)過夜。SDS-PAGE分析不同溫度誘導(dǎo)下VP1蛋白的環(huán)化效率，結(jié)果如圖 2所示，37°C下誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白可以使VP1的環(huán)化效率達(dá)到100%。離心收集37°C下誘 導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的菌體，超生破碎后得到包涵體蛋白沉淀，在變性條件下通過His-tag標(biāo) 簽純化得到VP1環(huán)肽，復(fù)性后用BCA法測(cè)定純化蛋白的濃度，并通過SDS-PAGE和Western Blot鑒定（圖2)。
[0045] 純化得到VP1環(huán)肽即為病毒性心肌炎環(huán)肽疫苗（C-VP1)。
[0046] 實(shí)施例2病毒性心肌炎環(huán)肽疫苗誘導(dǎo)的CVB3特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答
[0047] 實(shí)施例2和3通過肌肉注射的方式用實(shí)施例1中制備的VP1環(huán)肽疫苗免疫小鼠， 檢測(cè)該疫苗誘導(dǎo)的特異性全身免疫應(yīng)答水平以及保護(hù)小鼠免受CVB3的攻擊的能力，并與 線性VP1蛋白相比較。
[0048] 1、VP1蛋白免疫方法及血清收集
[0049] 以C-VP1環(huán)肽疫苗免疫6周齡BALB/c小鼠。方法如下：將6-8周BALB/c雄性小鼠 分為C-VP1組，L-VP1組和PBS組3組，每組6只小鼠。VP1蛋白免疫組每只免疫25 μ g的 蛋白，分別于第1、3、5周免疫，共免疫3次，第1次混合等體積的完全弗氏佐劑，第2、3次混 合等體積的不完全弗氏佐劑。免疫方法是將混合好的蛋白疫苗緩慢注射到小鼠腿部肌肉。
[0050] 于0周、2周、4周、6周分別收集小鼠血清，方法是以毛細(xì)管經(jīng)小鼠眼眶后眥靜脈采 血，37°C靜置30min，5000rpm離心lOmin，吸取上清分裝凍存于-70°C。
[0051] 2、VP1環(huán)肽疫苗免疫誘生CVB3特異性血清IgG的ELISA檢測(cè)
[0052] 以 10μ g/ml CVB4 VP1237_24913肽包板（pH9. 6 Na2C03,0. 1%BSA)，4°C過夜，PBST洗 3遍；以1%85八^^5封閉，371：111，洗3遍；加入10(^11:40稀釋血清原液，371：211，洗 3遍；加入ΙΟΟμΙ HRP-羊抗小鼠 IgG，37°Clh，洗4遍；加入ΙΟΟμΙ TMB底物，室溫避光顯 色7min，最后加入50 μ 12N H2S04終止反應(yīng)，測(cè)0D49(lnm值。
[0053] 結(jié)果如圖3所示，與L-VP1免疫組相比，C-VP1誘生了較高水平的特異性血清IgG 的產(chǎn)生，其0D值達(dá)到約1. 5,接近L-VP1組的三倍。
[0054] 3、VP1環(huán)肽疫苗免疫誘生CVB3特異性CTL的應(yīng)答
[0055] 處死末次免疫后2周小鼠，無菌取脾臟，脾細(xì)胞在體外經(jīng)特異性抗原刺激培養(yǎng)3 天后作為效應(yīng)細(xì)胞；以滅活的CVB3刺激培養(yǎng)24h的SP2/0細(xì)胞作為靶細(xì)胞。靶細(xì)胞按 100 μ 1/1 X 104/孔加入96孔U底板，將效應(yīng)細(xì)胞濃度調(diào)至5 X 106/ml，以該濃度為起始濃 度（即效靶比50 : 1)在板外進(jìn)行倍比稀釋，依次為2.5X106/ml(25 : 1)、L 25X 106/ ml (12. 5 : 1)，各按100 μ 1/孔加入96孔板中，LDH釋放對(duì)照組的設(shè)計(jì)（每組均設(shè)3個(gè)復(fù) 孔）：（1)培養(yǎng)液對(duì)照組：?jiǎn)渭儫o血清1640培養(yǎng)液200 μ 1/孔；（2) LDH低釋放組：靶細(xì)胞 100 μ 1/孔+無血清1640培養(yǎng)液100 μ 1/孔；(3) LDH高釋放組：祀細(xì)胞100 μ 1/孔+細(xì)胞 裂解液（2%TritonX-100溶液）100μ 1/孔；（4)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組：分別為效應(yīng)細(xì)胞5Χ105/ 孔，2. 5Χ 105/孔，1. 25Χ 105/孔+培養(yǎng)液100 μ 1/孔。將已加入細(xì)胞的96孔板置于37°C， 體積分?jǐn)?shù)5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)板以250g速度離心lOmin。每孔 取100 μ 1細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加入96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中，于每孔中加入100 μ 1 LDH反應(yīng) 液（Roche)，室溫避光放置30min。將細(xì)胞板置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)492nm的吸光度（Α)值。
[0056] 特異性CTL活性的計(jì)算方法：CTL細(xì)胞毒相對(duì)活性=[(A效靶細(xì)胞混合-A效應(yīng)細(xì) 胞對(duì)照-A低釋放對(duì)照）ΛΑ高釋放對(duì)照-A) ] X 100 %
[0057] 結(jié)果如圖4所示，從圖4可以看出，效靶比為25 : 1時(shí)，C-VP1免疫組特異性殺傷 率達(dá)38 %，而L-VP1組的特異性殺傷率只有20 %，統(tǒng)計(jì)顯示有顯著差異，提示C-VP1環(huán)肽疫 苗誘生了較強(qiáng)的CVB3特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。
[0058] 4、Brdu檢測(cè)特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)
[0059] 處死末次免疫后2周小鼠，無菌取脾臟，制備無紅細(xì)胞的淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度 為 4X 106/ml，加入 96 孔板，100 μ 1/ 孔，以 1640、20 μ g/ml VP1237_249 為刺激物，培養(yǎng) 72h 加 入 Ο.?μ? Brdu labeling solution/孔，至 24h 收集細(xì)胞，F(xiàn)ixDenat 固定細(xì)胞后，加入 Ιμ? anti-Brdu-POD，PBS 洗滌后，ΤΜΒ 室溫顯色 10min，測(cè) 0D45(lnm 值。
[0060] 結(jié)果如圖5所示，與L-VP1免疫組相比，C-VP1免疫組脾臟淋巴細(xì)胞對(duì)VP1237_ 24913 短肽產(chǎn)生的特異性細(xì)胞增殖反應(yīng)具有顯著差異，提示C-VP1免疫能夠產(chǎn)生很強(qiáng)烈的CVB3特 異性脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。
[0061] 實(shí)施例3病毒性心肌炎環(huán)肽疫苗在防治病毒性心肌炎中的應(yīng)用
[0062] 1、CVB3病毒傳代
[0063] 用含10% NBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和硫酸卡那霉素的RPMI-1640培 養(yǎng)基，在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)Hela細(xì)胞，隔天傳代。以100μ1 CVB3病毒凍存液感染 約5 X 106Hela細(xì)胞，培養(yǎng)40hr后80 %細(xì)胞被復(fù)制病毒裂解，將液體及細(xì)胞碎片以3000rpm/ min離心20min，所得上清即新鮮CVB3懸液，于-70°C保存。
[0064] 2、CVB3病毒的LD5(I (半數(shù)致死量）滴定
[0065] 取出生48h的BALB/c乳鼠，分為8組，每組6只小鼠，將新鮮制備的CVB3懸液以 10倍梯度稀釋法依次稀釋為10'10'10'10'10'10'10'10'分別取1〇〇 μ 1經(jīng)腹腔 注射8組乳鼠，逐日觀察乳鼠存活情況，按病毒學(xué)常規(guī)方法計(jì)算該批次CVB3病毒的LD5(I效 價(jià)。
[0066] 距離比例=(大于50 %的死亡百分?jǐn)?shù)-50V (大于50 %的死亡百分?jǐn)?shù)-小于50 % 的死亡百分?jǐn)?shù)）
[0067] LD5(I =大于50 %的死亡率稀釋度的對(duì)數(shù)（Log) +距離比例
[0068] 本試驗(yàn)中同一批次內(nèi)CVB3的LD5Q效價(jià)為ΚΓ5 5"^1。
[0069] 3、CVB3感染后免疫小鼠體重和心肌損傷血清學(xué)指標(biāo)變化情況
[0070] 環(huán)狀VP1蛋白末次免疫后2周，以3倍LD5(I劑量的活CVB3病毒100 μ 1經(jīng)腹腔感 染小鼠，逐日觀察小鼠存活情況至攻擊后28天。通過小鼠體重變化，心臟組織病理切片，小 鼠存活率以及心臟超聲等手段觀察各組小鼠發(fā)病情況。通過稱取第〇天和第7天體重改變， 初步評(píng)估心肌炎嚴(yán)重程度。結(jié)果顯示，感染初期，各組小鼠體重基本相同，但至第7天，PBS 組小鼠體重下降最為顯著，其次為L(zhǎng)-VP1組而C-VP1組體重變化最?。▓D6Α)。
[0071] 觀察小鼠在28天內(nèi)的存活率，結(jié)果顯示，PBS組小鼠在7天內(nèi)全部死亡，L-VP1組 有50 %小鼠實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期存活，而C-VP1免疫組小鼠存活率高達(dá)70 %，上述結(jié)果表明C-VP1可 有效保護(hù)小鼠免受病毒攻擊，起到有效的免疫保護(hù)效果。
[0072] 心肌細(xì)胞HE染色顯示，C-VP1免疫組小鼠的心肌細(xì)胞無明顯病變及炎性細(xì)胞浸 潤(rùn)，類似于正常小鼠心肌，而L-VP1組心肌細(xì)胞呈現(xiàn)較為嚴(yán)重的灶性壞死，并伴隨有炎性細(xì) 胞浸潤(rùn)，表明C-VP1誘導(dǎo)的CVB3特異性免疫應(yīng)答可較好的清除CVB3,使心肌不受感染或感 染程度較輕（圖6B)。
[0073] 小鼠心功能檢測(cè)：CVB3攻擊后第7天進(jìn)行小鼠心臟收縮功能監(jiān)測(cè)，每只小鼠腹腔 注射150 μ 10. 75 %戊巴比妥鈉，待輕度麻醉后采用RMV707B型高頻超聲探頭對(duì)小鼠進(jìn)行超 聲心動(dòng)圖檢查。心功能的各種收縮和舒張指標(biāo)如：左室舒張末期容積（LVEDV)、左室射血分 數(shù)（LVEF% )、左室短軸縮短率均由軟件自動(dòng)計(jì)算得出，所有數(shù)據(jù)及計(jì)算值均根據(jù)ASE推薦 方法獲得，每組原始數(shù)據(jù)取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期的平均值，超聲檢查的操作及分析均由專業(yè) 人員完成。
[0074] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析（圖6C)，C-pVPl免疫組小鼠的LVEF以及LVFS的數(shù)值明顯高于 L-VP1免疫組，這表明免疫C-VP1疫苗的小鼠有效的抵抗了 CVB3病毒的攻擊，從而可有效預(yù) 防CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎。
[0075] 以上實(shí)施例表明，以VP1環(huán)肽為靶抗原肌肉注射免疫小鼠，可有效增強(qiáng)B3型柯薩 奇病毒特異性血清抗體應(yīng)答，明顯加強(qiáng)全身特異性CD4/CD8 T細(xì)胞殺傷能力，顯著提高免疫 小鼠抵御病毒感染的能力，具備作為新型蛋白疫苗的應(yīng)用價(jià)值和潛力。
[0076] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0077] 序列表 <110> 申請(qǐng)人:名稱；蘇州大學(xué) <120〉病毒性心肌炎環(huán)肽疫苗及其制備方法 <160> 4 <170〉Patentln version 3, 3 <210> 1 <211> 36 <212〉 DNA <213>人工序列 <400> 1 cccaagcttg ccaccatggg cccagtggaa gacgcg 36 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <2i3>人工序列 <400> 2 cgggatcctt actaaaatgc gcccgtattt gtc 33 <210〉 3 <211> 32 <212> DNA <2i3>人工序列 <!00> 3 ggtctcgctg gccccgtgga agacgcgata ac 32 <210> 4 <211> 57 <212> DNA <213〉人工序列 C100> 4 acctgcagac cgccgtggtg gtggtggtgg tgatttgtca ttgtagtgat gctttgc 57
【權(quán)利要求】
1. B3型柯薩奇病毒VP1環(huán)肽，其特征在于，其是通過蛋白質(zhì)內(nèi)含子反式剪接將B3型柯 薩奇病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1環(huán)化，即得VP1環(huán)肽。
2. 權(quán)利要求1所述VP1環(huán)肽的制備方法，其特征在于，將B3型柯薩奇病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1 基因與蛋白內(nèi)含子基因融合表達(dá)，以大腸桿菌為宿主，通過蛋白質(zhì)內(nèi)含子反式剪接將線狀 VP1蛋白環(huán)化獲得VP1環(huán)肽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述蛋白內(nèi)含子包括但不限于Rma DnaB intein〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 將Rma DnaB intein第388-428位氨基酸序列Ic及下游外顯子第一個(gè)氨基酸殘基 361*的編碼基因序列與￥?1編碼基因的5'端融合，將1^^〇1^8丨拉6丨11第1-105位氨基酸 的編碼基因序列1 1<與％1編碼基因的3'端融合； 2) 將融合蛋白的編碼基因在大腸桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)，通過Rma DnaB intein的Ic和IN 的反式剪接將VP1蛋白的N末端和C末端通過肽鍵連接形成VP1環(huán)肽； 3. VP1環(huán)肽以包涵體形式存在于大腸桿菌內(nèi)，裂解細(xì)胞后通過變性法以His-tag標(biāo)簽 純化得到VP1環(huán)肽。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，在37°C下誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。
6. 病毒性心肌炎環(huán)肽疫苗，其特征在于，所述環(huán)肽疫苗是由權(quán)利要求1所述VP1環(huán)肽任 選輔以藥用賦形劑和/或佐劑組成。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的環(huán)肽疫苗，其特征在于，所述環(huán)肽疫苗為液體劑型或凍干劑 型。
8. 權(quán)利要求6所述環(huán)肽疫苗的制備方法，其特征在于，將權(quán)利要求1所述VP1環(huán)肽任選 與藥用賦形劑和/或佐劑混合。
9. 融合蛋白Ic-VPl-IN，其特征在于，VP1為B3型柯薩奇病毒結(jié)構(gòu)蛋白，Ic為Rma DnaB intein第388-428位氨基酸序列及下游外顯子第一個(gè)氨基酸殘基Ser，INS Rma DnaB intein第1-105位氨基酸序列。
10. -種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體中含有編碼權(quán)利要求9所述融 合蛋白的基因。
【文檔編號(hào)】A61K39/125GK104151402SQ201410384017
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】熊思東, 齊興梅 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)