專利名稱：P的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供與細胞增殖和致瘤性轉(zhuǎn)化有關(guān)的新多肽、編碼這些多肽的多核苷酸，與這些多肽反應(yīng)的抗體、用于檢測編碼這些新多肽的多核苷酸的多核苷酸雜交探針和PCR擴增探針、編碼這些多肽的轉(zhuǎn)基因、編碼這些多肽和/或同源整合進或接近編碼這些多肽的內(nèi)源基因的同源導(dǎo)向構(gòu)建體、包含功能性損壞的通常編碼這些多肽的內(nèi)源基因的非人類轉(zhuǎn)基因動物以及包含編碼這些多肽的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因非人類動物。本發(fā)明也提供在病人中檢測腫瘤疾病或腫瘤前疾病的方法、治療腫瘤疾病和腫瘤前疾病的方法、篩選抗腫瘤劑和致癌劑的方法、診斷腫瘤形成階段的方法、產(chǎn)生用作研究或診斷試劑的細胞增殖控制蛋白質(zhì)的方法、產(chǎn)生與所述新多肽反應(yīng)的抗體的方法以及產(chǎn)生表達由轉(zhuǎn)基因編碼的所述新多肽的轉(zhuǎn)基因非人類動物的方法。背景人們認為促進生長的原癌基因與抑制生長的腫瘤抑制基因抗衡調(diào)節(jié)正常細胞的增殖。增強原癌基因活性的突變產(chǎn)生迫使瘤細胞生長的癌基因。相反，滅活腫瘤抑制基因的遺傳損害可以使細胞不再受由這些基因強加的正常的復(fù)制抑制，所述遺傳損害一般經(jīng)過產(chǎn)生失活的腫瘤抑制基因等位基因純合細胞的突變產(chǎn)生。通常，失活的腫瘤抑制基因(例如，p53、RB、DCC、NF-1)與活化的癌基因(即，含有活化的結(jié)構(gòu)或調(diào)節(jié)突變的原癌基因)的組合可以產(chǎn)生生長基本上不受抑制的癌細胞(即，轉(zhuǎn)化細胞)。
而不同類型的遺傳改變可能都引起細胞生長調(diào)節(jié)基因表達或功能的改變和引起異常生長，一般認為引起正常細胞向惡性細胞的致瘤性轉(zhuǎn)化需要至少一種改變(Land et a1.，(1983)Nature304596；Weinberg RA(1989)CancerRes.493713)。引起大多數(shù)細胞類型的惡性轉(zhuǎn)化的精確分子途經(jīng)和輔助性改變還不清楚。已報道了大量的例子，在這些例子中某些蛋白質(zhì)(例如腫瘤抑制基因蛋白質(zhì)p53)的表達或活性的改變表現(xiàn)出與在瘤細胞中觀察到的異常細胞增殖和生長控制因果相聯(lián)。
分子遺傳學(xué)的最新進展揭示出大量基因，這些因基在克隆的人腫瘤中表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)改變，因而被假定為在癌發(fā)生中起重要作用。各種腫瘤相關(guān)基因已用明顯起作用的癌基因或隱性腫瘤抑制基因的廣泛類別進行分類(在Weinberg RA(1989)Cancer Res.493713和Marshall CJ(1991)Cell64313中進行了綜述)。由于發(fā)現(xiàn)在合適的試驗條件下可以作為癌基因或腫瘤抑制基因起作用的基因，這兩類間的區(qū)別已有些模糊。這一現(xiàn)象被p53基因例證，該基因的野生型具有腫瘤抑制性質(zhì)，而其某些突變型表現(xiàn)出明顯的類癌基因性質(zhì)(Lane DP and Benchimol S(1990)Genes Dev，41；Michalovitz et al.(1990)Cell62671；Eliyahu et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)868763；Finlay et al.(1989)Cell571083；Lane DP(1992)Nature35815)p53基因產(chǎn)物是一種涉及控制細胞增殖的核磷蛋白，通常發(fā)現(xiàn)p53基因中的突變與多種類型的人癌癥相關(guān)(Levine et al.(1991)Nature351453)。p53磷蛋白與SV40大T抗原、腺病毒E16蛋白和人乳頭瘤病毒E6蛋白質(zhì)(它們每一種均是與其各自病毒致瘤活性有關(guān)的蛋白質(zhì))相關(guān)。p53和病毒癌蛋白質(zhì)之間的這些關(guān)系可以通過以p53為靶快速降解或?qū)⒒[蔽在失活復(fù)合物中來抑制野生型p53活性。
(Scheffner et al.(1991)Cell631129；Oren et al.(1981)Mol.cell.Biol.1101；Yew PR and Berk AJ(1992)Nature35782).野生型p53表現(xiàn)出DNA-結(jié)合活性(Kern et al.(1991)Science2521708)和轉(zhuǎn)錄激活性質(zhì)(Fields s and Jang SK(1990)Science2491046；Raycroft et al.(1990)Science24901049；Bargonetti et al.(1991)Cell651083；Agoff et al.(1993)Sci-ence25984)。已觀察到與轉(zhuǎn)化細胞相關(guān)的p53點突變形式喪失了序列特異性DNA結(jié)合功能(Kern et al.(1991)op.cit；Bar-gonetti et al.(1991)op.cit.El-Deiry et al.(1992)NatureGenetics145)。而且，許多突變型p53蛋白質(zhì)可以用作抑制野生型p53這一活性的顯性負性物(negatives)。令人感興趣地是，某些病毒編碼的癌蛋白質(zhì)(例如sv40大型T抗原)也明顯地作為與p53蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的結(jié)果抑制p53 DNA-結(jié)合活性(Bargonetti etal.1991)op.cit.)。
已鑒別與p53蛋白質(zhì)共免疫沉淀的一種大鼠蛋白質(zhì)為小鼠MDMZ蛋白質(zhì)的大鼠同系物(Baraky and Oren M(1992)EM-BO J.112115)。MDM2基因原來已被鑒別為存在于小鼠雙鏈微小染色體上的顯性轉(zhuǎn)化癌基因；MDM2的人類似物已被克隆，且人MDM2蛋白質(zhì)結(jié)合p53(Fakharzadeh et al.(1991)EMBO J.101565；Oliner et al.(1992)Nature35880)。
已報道包含功能性破壞的p53基因的轉(zhuǎn)基因動物(Donehoweret al.(1992)Naturep356215)除有別的用途外，還用于致癌物篩選試驗中。
細胞增殖控制和瘤形成許多病理狀態(tài)引起(至少部分引起)細胞增殖、分化和/或細胞程序死亡的異?？刂?。例如，瘤形成以克隆衍生細胞群(具有降低的應(yīng)答正常細胞增殖控制信號的能力)為特征。細胞的致瘤性轉(zhuǎn)化引起細胞代謝、生理學(xué)和形態(tài)學(xué)上的大量的變化。致瘤性轉(zhuǎn)化細胞的一個特征性改變是喪失對細胞增殖和分化抑制(通常受細胞生長調(diào)節(jié)基因的合適表達的影響)的應(yīng)答性。
除了在研究構(gòu)成轉(zhuǎn)化表型和瘤形成的基礎(chǔ)的分子機制的更確定的模型方面的進展外，幾乎沒有形成常規(guī)化學(xué)療法之外的可用于治療癌癥的有效療法。異常p53功能常常與瘤形成相關(guān)的觀察結(jié)果支持了其中p53蛋白質(zhì)涉及細胞增殖控制，也可以涉及轉(zhuǎn)導(dǎo)生長調(diào)節(jié)信號的一種或多種信號途徑的模型。如果這樣一種模型是正確的，則p53和與p53特異性相互作用的生物大分子(即蛋白質(zhì))將是治療操作的候選靶標。例如但不限于，如果假設(shè)的蛋白質(zhì)×結(jié)合到p53上形成復(fù)合物，且由此刺激細胞的致癌性生長，則選擇性抑制蛋白質(zhì)×p53復(fù)合物形成或者另外調(diào)節(jié)p53活性的試劑可以是候選的抗腫瘤劑。
對與p53蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的鑒別提供了識別特異性干涉p53蛋白質(zhì)和這些蛋白質(zhì)之間分子間聯(lián)系的藥劑的篩選試驗的基礎(chǔ)。這些篩選試驗可用于識別可用作候選治療劑的候選p53調(diào)節(jié)劑。這樣的p53調(diào)節(jié)劑可提供用于治療瘤形成，細胞增殖性疾病、關(guān)節(jié)炎、炎癥、自身免疫疾病等的新的化學(xué)治療劑。本發(fā)明滿足了這些和其它需要。
因此，本領(lǐng)域需要識別和分離與瘤形成相關(guān)的新基因，將這些基因用于診斷和治療用途的方法，具有這些基因的修飾變體的多核苷酸構(gòu)建體和轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明滿足了以上各種需要。
本文討論的參考文獻僅提供了其在本申請申請日前公開的內(nèi)容。本文不構(gòu)成任何對發(fā)明人無權(quán)借助在先發(fā)明做出比其更先進的發(fā)明的承認。發(fā)明概述本發(fā)明提供了幾種調(diào)節(jié)p53活性和篩選p53活性調(diào)節(jié)劑的新方法和組合物。這些方法采用編碼p53相互作用蛋白質(zhì)的多核苷酸序列和基本上與天然產(chǎn)生的編碼這種p53-相互作用蛋白質(zhì)的多核苷酸序列(例如cDNA或基因組基因)相同的多核苷酸序列。
本發(fā)明的一個方面提供了p53相互作用多肽和其組合物。在一個實施方案中，p53-相互作用多肽包括基本上與

圖1 1A-1D所示序列(命名為WBP1)或圖2所示序列(命名為p53UBC)或另一種中的同族基因序列相同的多肽序列。
提供了編碼p53-相互作用多肽的多核苷酸序列。圖1A-1D或圖2給出了克隆序列(包括核苷酸和預(yù)測的氨基酸序列)的特征。包括這些序列的多核苷酸可以用作p53-相互作用多肽(例如人WBP1和人p53UBC)大量重組表達的模板。包含這些序列的多核苷酸可以用作在單個淋巴細胞(或其它細胞類型)中經(jīng)原位雜交和在特定細胞群中經(jīng)Northern印跡分析和/或原位雜交(Alwine et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sei.U.S.A745350)和/或PCR擴增和/或LCR檢測法中檢測p53-相互作用多肽mRNA(例如WBP1和p53UBC)的轉(zhuǎn)錄率和mRNA豐度的核酸雜交探針。除了對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然的用途外，這些重組多肽和核酸雜交探針具有在治療劑(例如抗腫瘤劑)的體外篩選方法上，在診斷和治療腫瘤疾病、腫瘤前病理疾病和遺傳病上和法醫(yī)鑒別人個體上的用途。
在一個實施方案中，候選治療劑通過其阻斷p53-相互作用多肽與p53多肽結(jié)合的能力來識別。p53多肽最好是全長成熟p53蛋白質(zhì)并通常是磷酸化的(盡管單個p53種的磷酸化狀態(tài)可能是易變的)。一般來說，p53多肽包括與野生型p53蛋白質(zhì)序列相同的氨基酸序列，盡管如果在控制試驗條件(例如生理條件)下突變型p53多肽結(jié)合到p53-相互作用多肽上時有時使用突變型p53多肽。試驗藥劑在合適的結(jié)合試驗條件下改變p53多肽與p53-相互作用多肽之間的結(jié)合的能力。檢測p53多肽與p53-相互作用多肽結(jié)合的一種方法是固定化p53多肽(例如經(jīng)共價鍵或非共價鍵比學(xué)鍵合到固體支持物上)，并使固定化的p53多肽與已用可檢測的標記標記過(如經(jīng)摻入放射性標記的氨基酸，經(jīng)表位標記和用螢光標記的抗表位標記抗體報道，等等)的p53-相互作用多肽接觸。這種接觸一般在含水條件下完成，含水條件下允許p53多肽與包含功能性p53結(jié)合位點的p53-相互作用多肽的結(jié)合。通過測定標記的p53-相互作用多肽固定化(作為特定結(jié)合作用的結(jié)果)程度來測定標記p53-相互作用多肽與固定化p53的結(jié)合。這種特異性結(jié)合可以是可逆的，或者如果在合適的實驗條件下加入交聯(lián)劑，可以是選擇性不可逆的。作為選擇，p53多肽可以是標記的，而p53-相互作用多肽可以是固定化的。在一個變化的實施方案中，用可溶性(即，非固定化的)p53和p53-結(jié)合多肽進行結(jié)合試驗，從未結(jié)合的p53和p53-結(jié)合多肽分離所形成的結(jié)合復(fù)合物(p53p53-結(jié)合多肽)，并定量分析結(jié)合的復(fù)合物。由此識別作為p53-調(diào)節(jié)劑和候選治療劑的抑制和促進結(jié)合的復(fù)合物形成(與缺乏所述藥劑的對照結(jié)合反應(yīng)相比)的藥劑。
在一個變化的實施方案中，結(jié)合試驗在細胞中，例如酵母細胞(如糖酵母)中體內(nèi)進行，且抑制p53蛋白質(zhì)和p53-相互作用多肽之間分子內(nèi)結(jié)合的藥劑以p53-調(diào)節(jié)劑被識別。通常，體內(nèi)篩選試驗是一個酵母二雜合體系統(tǒng)，其中，酵母細胞表達(1)包含p53和第一轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白序列(例如，GAL4激活域)的第一融合蛋白，(2)包含p53相互作用多肽和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白序列(例如，GAL4 DNA-結(jié)合域)的第二融合蛋白，和(3)報道基因(例如，β-半乳糖苷酶)，當(dāng)包含第一融合蛋白和第二融合蛋白的分子內(nèi)復(fù)合物形成時，該基因被轉(zhuǎn)錄。如果功能性p53p53-相互作用多肽復(fù)合物形成(例如在缺乏藥劑的對照試驗中)，則細胞表達可被檢測的報道基因。抑制或促進功能性p53p53-相互作用多肽復(fù)合物形成(且報道基因由此被表達)的藥劑從而作為p53-調(diào)節(jié)劑被識別。
本發(fā)明也提供了與編碼p53-相互作用多肽序列的多核苷酸序列互補的反義多核苷酸。這些反義多核苷酸用于抑制p53-相互作用多肽mRNA種類的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，且從而影響細胞(例如，病人淋巴細胞白血病細胞)中各自p-53相互作用多肽的數(shù)量的減少。這些反義多核苷酸可以通過抑制p53-相互作用多肽的形成作為p53調(diào)節(jié)劑起作用，所述多肽是為p53-相互作用多肽調(diào)節(jié)p53功能所需要的。
在本發(fā)明的一種變化的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸用于診斷涉及與p53功能相關(guān)的其它病態(tài)的瘤形成的病理狀態(tài)或遺傳病，更具體地說，用于診斷涉及p53相互作用多肽(例如WBP/或p53UBC)的結(jié)構(gòu)或豐度改變的病態(tài)和疾病。
本發(fā)明也提供了以至少約1×107M-1的親和力結(jié)合到Lyar上并且缺乏結(jié)合p53相互作用多肽(例如WBP1或p53UBC)的特異性高親和力的抗體。這些抗體可以用作識別病人細胞樣品(例如淋巴細胞樣品，固體組織活檢)中表現(xiàn)出改變的p53功能的細胞(例如前致瘤性或致瘤性細胞)的診斷劑，與相同細胞類型的非致瘤性細胞相比，所述細胞含有增加量的p53相互作用多肽。通常，抗p53相互作用多肽抗體包括在用于細胞樣品原位免疫組織病理學(xué)染色的診斷劑中。此外，抗p53相互作用多肽抗體也可以經(jīng)導(dǎo)向轉(zhuǎn)運(例如，經(jīng)陽離子化或經(jīng)脂質(zhì)體/免疫脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運)到致瘤性細胞作為治療劑使用。
本發(fā)明還提供了診斷疾病狀態(tài)(例如，瘤形成或前瘤形成)的p53相互作用多肽多核苷酸探針，所述的診斷是通過檢測從病人移植的細胞中p53相互作用多肽mRNA或p53相互作用多肽基因的重排或擴增，或者通過檢測特定的p53相互作用多肽等位基因(例如，經(jīng)RFLP或等位基因特異性PCR分析)進行的。盡管可以使用基于從細胞樣品分離的批量RNA或polyA+RNA的Northern印跡法、斑點印跡法或溶液雜交，但所述檢測一般經(jīng)采用標記的(例如，32P、35S、14C、3H、熒光的、生物素化的、洋地黃毒苷化的)p53-相互作用多肽多核苷酸(它可以使用p53-相互作用多肽特異性引物PCR擴增)的原位雜交進行。與相同類型的非致瘤性細胞比較含有改變量的p53-相互作用多肽的mRNA的細胞將作為候選病態(tài)細胞被識別。類似地，檢測細胞樣品中p53相互作用多肽基因座或緊密連接的基因座的特殊病征的重排或增殖將鑒別出病理狀態(tài)或發(fā)展病理狀態(tài)的誘因(例如癌癥，遺傳病)。所述多核苷酸探針也用于對個體的法醫(yī)鑒別，例如，親權(quán)認定或嫌疑犯或不明死亡的鑒別。
本發(fā)明也提供了一種診斷病人疾病(例如瘤形成)的方法，其中，診斷試驗(例如，用特異性結(jié)合到人p53相互作用多肽上的抗體進行的固定細胞的免疫組織化學(xué)染色)用于確定在得自病人的生物樣品中是否存在p53相互作用多肽或其編碼mRNA的預(yù)定的特殊病征的濃度。如果試驗表明p53相互作用多肽或其編碼mRNA的存在量超出正常范圍(例如在預(yù)定的特殊病征濃度之外)，則病人被診斷為患有疾病或具有疾病誘因。
本發(fā)明也提供了經(jīng)調(diào)節(jié)p53功能(通過抑制或增強p53p53相互作用多肽復(fù)合物的形成)抑制瘤形成或細胞程序死亡的治療劑，該治療劑可用作藥物。這些藥物可用于治療各種人和獸醫(yī)疾病，例如，再輸注(reperfusion)損傷、心肌梗塞、中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷、神經(jīng)變性疾病、老化、局部缺血、毒血癥、傳染病、AIDS、肝炎等。
本發(fā)明還提供了鑒別結(jié)合到p53相互作用多肽上的多肽序列的方法。按照定義，相互作用蛋白質(zhì)組的一個成員是p53。例如，酵母二雜交篩選系統(tǒng)可用于鑒別結(jié)合到WBP1或p53UBC上的多肽序列。酵母二雜交系統(tǒng)(其中一種GAL4融合蛋白包含p53相互作用多肽序列，該序列通常為全長接近全長WPB1或p53UBC的多肽序列(例如圖1A-D或2的多肽序列)，且其它GAL4融合蛋白包含cDNA文庫成員)可用于鑒別cONA編碼的蛋白質(zhì)(該蛋白與p53相互作用多肽相互作用)，可按Chien et al.(1991)OP.cit.的一般方法篩選。作為選擇，大腸桿菌/BCCP相互作用篩選系統(tǒng)(Germino etal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90933；Guarente L(1993)Proc.Natl.Acad.Sei.(U.S.A.901639本文引用以供參考)可用于鑒別相互作用的蛋白質(zhì)序列。表達文庫(例如λgt11 cD-NA表達文庫)也可以用標記的p53相互作用多肽篩選，以識別特異性結(jié)合p53相互作用多肽的cDNA編碼多肽。對這些方法來說，cD-NA文庫通常包括哺乳動物(典型地是人、小鼠或大鼠)cDNA群，并且可以體現(xiàn)從一種細胞類型、組織或器官和一種或多種發(fā)育階段的RNA產(chǎn)生的cDNA。篩選cDNA表達文庫的特異性結(jié)合通常是經(jīng)在接觸標記的p53相互作用多肽(和/或標記的抗p-53相互作用多肽抗體)之前和/或同時包含進一種或多種封閉劑(例如白蛋白、脫脂干奶固形物等)產(chǎn)生的。附圖簡要說明圖1A-1D顯示了人WBP1的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列。
圖2顯示了人p53UBC的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列。翻譯讀框表示為p53UBC蛋白質(zhì)的推斷的氨基酸序列。定義除非有別的定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。盡管在實施和試驗本發(fā)明中可以使用類似或等價于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料，但本文描述了優(yōu)選的方法和材料。為達到本發(fā)明的目的，下列術(shù)語定義如下如本文所用的，20種常見氨基酸和它們的縮寫按常規(guī)用法(Im-munology-A Synthesis，and Edition，E.S.Golub and D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Massachusetts(1991)，本文引用以供參考)。20種常見氨基酸的立體異構(gòu)體(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸(例如α，α-＝取代的氨基酸、N-烷基化氨本酸、乳酸)和其它稀有氨基酸也可以是本發(fā)明的多肽的合適的組分。稀有氨基酸的例子包括4-羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙?；嚢彼?、O-磷酸絲氨酸、N-乙?；z氨酸N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、ω-N-甲基情氨酸和其它類似氨基酸和亞氨基酸(例如，4-羥基脯氨酸)。在本文使用的多肽表示法中，按照標準用法和常規(guī)，左邊方向是氨基末端方向，右邊方向是羧基末端方向。類似地，除非有其它限定，單鏈多核苷酸序列的左邊末端是5′末端，雙鏈多核苷酸序列的左邊方向稱作5′方向。新生RNA轉(zhuǎn)錄物的5′到3′添加的方向指轉(zhuǎn)錄方向；在具有與RNA相同序列的DNA鏈(為RNA轉(zhuǎn)錄物的5′到5′末端)上的序列區(qū)稱作“上游序列”；在具有與RNA相同序列的DNA鏈(為RNA轉(zhuǎn)錄物的3′到3′末端)上的序列區(qū)稱作“下游序列”。
當(dāng)用于某一目標物時，本文使用的術(shù)語“天然產(chǎn)生的”指可在天然中發(fā)現(xiàn)的一種物質(zhì)這一事實。例如，存在于有機體(包括病毒)(它是能從天然來源分離的)中的且沒有經(jīng)人在實驗室有意識地修飾的多肽或多核苷酸序列是天然產(chǎn)生的。
本文使用的術(shù)語“相應(yīng)于”指一種多核苷酸序列同源于(即，相同的，非嚴格進化相關(guān)的)對照多核苷酸序列的全部或部分，或者一種多肽序列與對照多肽序列相同。相反，術(shù)語“互補于”本文用來指互補序列同源于對照多核苷酸序列的全部或部分。舉例來說，核苷酸序列“TATAC”相應(yīng)于對照序列“TATAC”，并互補于對照序列“GTATA”。
下列術(shù)語用于描述兩個或多個多核苷酸之間的序列關(guān)系“參照序列”、“比較窗”、“序列相同”、“序列相同百分比”和“基本上相同”?！皡⒄招蛄小笔且环N用作序列比較基礎(chǔ)的指定的序列；一種參照序列可以是較大序列的亞單位(例如，為序列表中給出的全長cDNA或基因序列(如圖1A-1D或圖2的核苷酸序列)的一個區(qū)段)或者可以包含完整的cDNA或基因序列。參照序列長度一般為至少20個核苷酸，長度通常為至少25個核苷酸，并且長度常常為至少50個核苷酸。因為兩種多核苷酸可以(1)各自包含兩種多核苷酸間相似的序列(即，完整的多核苷酸序列的部分)和(2)各自進一步包含兩種多核苷酸間不同的序列，因此，兩種(或多種)多核苷酸間的序列比較典型地是通過在“比較窗”上比較兩種核苷酸序列以鑒別和比較序列局部區(qū)的類似性來進行。本文使用的“比較窗”指至少20個毗連核苷酸位置的概念區(qū)段，其中一種多核苷酸序列可以與至少20個毗連核苷酸的參照序列比較，且為了進行兩種序列的最佳對比，其中的在比較窗中的多核苷酸序列部分可以包含與參照序列(不包含添加或缺失)比較的20％或少于20％的添加或缺失(即，缺口)。為對比比較窗的序列的最佳對比可以用以下方法進行Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math，2482的局部同源性規(guī)則、Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的同源性對比規(guī)則、Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci，(U.S.A.)852444的類似性研究方法、這些規(guī)則的計算機化補充(Wisconsin Genetics Software PackageRelease 7.0，Genetics Computer Group(575 Science Dr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者觀察，并且選擇各種方法產(chǎn)生的最佳對比(即，在比較窗上形成同源性的最高百分比)。術(shù)語“序列相同”指兩種多核苷酸序列在比較窗上是相同的(即，在核苷酸對核苷酸的基礎(chǔ)上)。術(shù)語“序列相同百分比”是由以下方法計算的在比較窗上比較兩個最佳對比的序列；確定在兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(如，A、T、C、G、U或I)的位置的數(shù)目以得到配對位置的數(shù)目；用配對位置的數(shù)目除以比較窗中位置的總數(shù)目(即，窗大小)；并且將所得結(jié)果乘以100，即得到序列相同百分比。本文使用的術(shù)語“基本上相同”指多核苷酸序列的一個特征，其中，當(dāng)與至少20個核苷酸位置的比較窗(通常為至少25-50個核苷酸的窗)上的參照序列比較時，所述多核苷酸包含至少85％的序列(優(yōu)選地至少90-95％的序列，最常見地至少99％的序列)與參照序列的相同。其中序列相同百分比是通過將參照序列與可以包含缺失或添加(總共為比較窗上參照序列的20％或更低)的多核苷酸序列計算出的。所述參照序列可以是較大序列的亞單位，例如，為圖1A-1D所示的人WBP1多核苷酸序列或者圖2所示的人p53UBC多核苷酸序列的一個區(qū)段。
當(dāng)用于多肽時，術(shù)語“基本上相同”指兩種肽序列當(dāng)用例如采用缺失缺口重量的程序GAP或BESTFIT進行最佳比較時具有至少80％的序列相同，優(yōu)選地是至少90％的序列相同，更優(yōu)選地是至少95％的序列相同(例如99％的序列相同)。不相同的殘基位置最好由保守氨基酸取代區(qū)別。保守氨基酸取代指具有類似側(cè)鏈的殘基的可交換性。例如具有脂肪族側(cè)鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族羥基側(cè)鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側(cè)鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代基團是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸；苯丙氨酸-酪氨酸；賴氨酸-精氨酸；丙氨酸-纈氨酸；和天冬酰胺-谷氨酰胺。
本文使用的術(shù)語“WBP1天然蛋白質(zhì)”和“p53UBC天然蛋白質(zhì)”指天然產(chǎn)生的WBP1或p53UBC多肽，所述多肽分別相應(yīng)于圖1A-1D或2所示的推斷的氨基酸序列，或者相應(yīng)于從哺乳動物mRNA樣品(例如人mRNA樣品)產(chǎn)生的WBP1或p53UBC全長cDNA推斷的氨基酸序列。還例如，存在于表達WBP1或p53UBC基因的天然人細胞中的天然WBP1或p53UBC蛋白質(zhì)被認為是全長蛋白質(zhì)。
本文使用的術(shù)語“片段”指具有氨基末端和/或羧基末端缺失，但其剩下的氨基酸序列與從例如全長cDNA序列(即，圖1A-1D或2所示的cDNA序列)推斷的天然產(chǎn)生(例如，成熟蛋白質(zhì))序列中相應(yīng)位置相同的多肽。片段長度典型地為至少14個氨基酸，優(yōu)選地為至少20個氨基酸，常見的為至少50個氨基酸或更長。
本文使用的術(shù)語“類似物”指由至少25個氨基酸的區(qū)段組成的多肽，所述區(qū)段與圖1A-1D或圖2所示的推斷的氨基酸序列的部分基本相同，所述多肽具有至少一種以下性質(zhì)(1)在合適的結(jié)合條件下特異性地結(jié)合到p53多肽(如人p53磷蛋白)或(2)當(dāng)在哺乳動物細胞(例如，模擬p53突變體表型)中表達時，能調(diào)節(jié)p53活性。相對于天然產(chǎn)生的序列來說，類似物多肽典型地包含保守氨基酸取代(或添加或缺失)類似物典型地是至少20個氨基酸長，優(yōu)選地是至少50個氨基酸長或更長，最常見地是與天然產(chǎn)生的p53相互作用多肽全長(例如，如圖1A-1D或圖2所示的)一樣長。某些p53相互作用多肽類似物可以缺乏生物學(xué)活性，但仍可用于各種用途，例如用于產(chǎn)生針對p53相互作用多肽表位的抗體；用作免疫試劑以便經(jīng)親和層析檢測和/或純化α-p53相互作用多肽抗體；用作天然p53相互使用多肽功能的競爭性或非競爭性興奮劑、拮抗劑或部分興奮劑。
本文使用的術(shù)語“多肽”作為一般性的術(shù)語指天然蛋白質(zhì)、多肽序列的片段或類似物。因此，天然蛋白質(zhì)、片段和類似物是多肽類的不同類別。優(yōu)選的p53相互作用多肽包括包含圖1A-1D或2所示的多肽序列的人全長蛋白質(zhì)，或基本上由表III或表IV所示序列構(gòu)成的多肽。
本文使用的術(shù)語“相關(guān)的”指物種間進化和功能相關(guān)的基因序列。例如但不限于，在人基因組中，人CD4基因是小鼠CD4基因的相關(guān)基因，因為這兩種基因的序列和結(jié)構(gòu)表明它們是高度同源的，并且兩種基因都編碼在信號T細胞激活中經(jīng)MHCII類限制性抗原識別起作用的蛋白質(zhì)。因此，與人WBP1基因相關(guān)的鼠基因是編碼表達蛋白質(zhì)(它具有與人WBP1蛋白質(zhì)最大程度的序列相同性)并且表現(xiàn)出類似于人WBP1基因表達模式的鼠基因。優(yōu)選的相關(guān)WBP1和p53UBC基因是大鼠WBP1或p53UBC、兔WBP1或p53UBC、犬WBP1或p53UBC、非人靈長目動物WBP1或p53UBC、豬WBP1或p53UBC、牛WBP1或p53UBC、鼠WBP1或p53UBC和倉鼠WBP1或p53UBC。
本文使用的術(shù)語“p53調(diào)節(jié)作用”指提高或抑制p53功能性性質(zhì)(如，DNA結(jié)合活性、轉(zhuǎn)錄增強活性、細胞復(fù)制表型)的能力。這種增強作用或抑制作用在特異現(xiàn)象上可以是偶然的(如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的激活作用)，或者僅在特定的細胞類型中證實。p53調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄增強或抑制的能力的改變可以影響基因的誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄，或者可以影響基因的基礎(chǔ)水平轉(zhuǎn)錄，或者兩者。
本文使用的術(shù)語“試劑”指化合物、化合物的混合物、生物大分子或從生物材料(例如細菌、植物、真菌或動物(特別是哺乳動物)細胞或組織)制備的提取物。在以下所述的篩選試驗中經(jīng)包涵物估價試劑作為p53調(diào)節(jié)劑(例如，抗瘤形成劑、細胞毒性劑、細胞增殖促進劑等)的潛在的能力。
本文使用的術(shù)語“候選試劑”指由本發(fā)明的一種或多種篩選方法鑒別作為推定的p53調(diào)節(jié)劑的試劑。某些候選p53調(diào)節(jié)劑可以具有作為人用藥物的治療潛力。
本文使用的術(shù)語“標記”或“標記的”指摻入可檢測的標記，例如通過摻入放射性標記的氨基酸或連接到可由標記的抗生物素蛋白質(zhì)(例如，含有熒光標記或能被光學(xué)或比色方法檢測的酶活性的鏈霉抗生物素蛋白質(zhì))檢測的生物素標記位點的多肽。標記多肽和糖蛋白的各種方法是本領(lǐng)域公知的，可以使用。用于多肽的標記的例子包括但不限于下列放射性同位素(如3H、14C、35S、125I、131I)、熒光標記(如，F(xiàn)ITC、羅丹明、鑭系元靠燐光體)、酶標記(如辣根過氧化物酶，β一半乳糖苷酸、熒光素酶、堿性磷酸酶)、生物素?；⒈坏诙蟮婪肿幼R別的預(yù)定的多肽表位(例如，殼氨酸拉鏈對序列、第二抗體結(jié)合位點、金屬結(jié)合區(qū)、表位標記)。在某些實施方案中，標記物被各種長度的間隔臂連接，以降低潛在的主體位阻。
本文使用的“基本上純化的”指一種目標物質(zhì)是存在的主要物質(zhì)(即，在混合物中，從摩爾數(shù)看，目標物比任何其它單個大分子物質(zhì)多得多)，基本上純化的組分優(yōu)選是一種其中包含的目標物質(zhì)至少為存在的所有大分子物質(zhì)的50％左右(基于摩爾數(shù))的組合物。一般，一種基本上純化的組合物含有為組合物中存在的所有大分子物質(zhì)的80-90％以上的目標物。最優(yōu)選的是，目標物質(zhì)純化成基本上同質(zhì)的(用常規(guī)檢測方法不能在組合物中檢測到雜質(zhì)物質(zhì))，其中組合物基本上由單一大分子物質(zhì)組成。添劑物質(zhì)，小分子(＜500道爾頓)和元素離子物質(zhì)不被認為是大分子物質(zhì)。
本文使用的術(shù)語“特殊病證濃度”、“特殊病征量”和“特殊病征染色模式”分別指樣品中p53相互作用多肽或mRNA的濃度、量或定位模式表現(xiàn)出在疾病狀態(tài)或形成疾病的誘因(如瘤形成或開始衰老)的情況下所存在的濃度、量或定位模式。特殊病征量是細胞或細胞樣品中p53相互作用多肽或編碼mRNA的量，該量落在由預(yù)期的和/或回顧的統(tǒng)計學(xué)臨床研究建立的正常臨床值范圍之外。一般來說，患有疾病(如瘤形成)的個體的細胞或組織樣品中p53相互作用多肽或mRNA的量明顯高于或低于正常的未患病個體濃度范圍。特殊病征濃度典型地為平均正常值之上或之下約1個標準偏差，更常見地是平均正常值之上或之下約2個標準偏差或更大。然而，基本上所有臨床診斷試驗產(chǎn)生某種百分比的假陽性和假陰性。診斷試驗的敏感性和選擇性必須足以滿足診斷目標和任何相關(guān)規(guī)章的要求。一般來說，本發(fā)明的診斷方法用于鑒別可能患有疾病的個體，在由合格的健康專家判斷的疾病的鑒別診斷中提供另外的參數(shù)。詳細描述總的來說，下文使用的命名法和以下描述的細胞培養(yǎng)、分子遺傳、核酸化學(xué)和雜交的實驗室方法是公知的且是本領(lǐng)域通常采用的。將標準技術(shù)用于重組核酸方法、多核苷酸合成、微生物培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(如，電穿孔、脂轉(zhuǎn)染)。一般按照制造者的說明進行酶促反應(yīng)和純化步驟。一般按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法和各種一般性的參考文獻(secgenerally，Sambrook et al. Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Har-bor，n.y.，本文引用以供參考)實施所述技術(shù)和方法，該參考文獻通過本說明書提供。其中的方法被認為是本領(lǐng)域熟知的，提供出來是為了方便讀者。本文引用其中包含的所有信息以供參考。
寡核苷酸可以按照制造者提供的說明在Applied Bio Systems寡核苷酸合成器上合成。
本領(lǐng)域描述了PCR擴增方法(PCR TechnologyPrinciples andApplications for DNAAmplificationed.HA Erlich，F(xiàn)reeman Press，New York，NY(1992)；PCR ProtocolsA Guide to Methods and Ap-plications，eds.Innis，Gelfland，Snisky，and White，Academic Press，SanDiego，CA(1990)；Mattila et al.(1991)Nucleic Acids Res.194967；Eckert，K.A.and Kunkel，T.A.(1991)PCR Methods and Applica-tions117；PCR，eds.Mcpherson，Quirkes，and Taylor，IRL Press，ox-ford；和U.S.專利4,683,202，本文引用這些文獻作為參考文獻)p53相互作用多肽序列的鑒別與哺乳動物p53多肽序列相互作用的多肽序列可由多種方法鑒別，這些方法包括但不限于(1)哺乳動物細胞或細胞核提取物中p53相關(guān)蛋白質(zhì)的共免疫沉淀；(2)采用二雜交報道系統(tǒng)(如酵母二雜交系統(tǒng))的表達文庫的篩選(ehien et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)889578；Zervos et al(1993)Cell72223)；和(3)用標記的p53蛋白質(zhì)(或后續(xù)用標記的抗體檢測的p53蛋白質(zhì))篩選cDNA表達文庫(Ayer et al.(1993)Cell72211)。作為選擇，大腸桿菌/BCCP相互作用篩選系統(tǒng)(Germino et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90933；Guarente L(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)901639，本文引用以供參考)可用于鑒別相互作用蛋白質(zhì)序列。
對用α-p53抗體經(jīng)與p53共免疫沉淀分離的蛋白質(zhì)來說，一般將分離的p53相互作用多肽純化至同質(zhì)，并由Edman降解法測序。從由此產(chǎn)生的氨基酸序列產(chǎn)生和標記用于篩選cDNA或基因組文庫的編碼所述氨基酸序列的簡并寡核苷酸探針。
對用p53蛋白質(zhì)經(jīng)二雜交篩選或cDNA文庫篩選識別的多肽序列來說，分離和測序(如用Sanger二脫氧測序法)編碼p53相互作用多肽序列的多核苷酸序列，并且確定正確推斷的氨基酸序列。
舉例來說，經(jīng)篩選編碼結(jié)合到人p53融合蛋白上的多肽序列的多核苷酸序列的二雜交酵母表達系統(tǒng)分離到人WBP1和p53UBC多核苷酸和推斷的多肽序列(參見以下的實驗性實施例)。
本發(fā)明還提供了鑒別結(jié)合到p53相互使用多肽上的多肽序列的方法。例如，可以用這些方法鑒別編碼結(jié)合到WBP1或p53UBC上的多肽序列的多核苷酸。按定義，各相互作用蛋白質(zhì)組的一個成員是p53。例如，酵母二雜交篩選系統(tǒng)可用于篩選鑒別cDNA物種的哺乳動物(如人)cDNA庫，所述cDNA物種編碼結(jié)合到WBP1或p53UBC上的多肽序列，并鑒別編碼p53(野生型)的克隆(如果該p53克隆存在于克隆庫的話)。
WBP1和p53UBC多核苷酸的克隆用常規(guī)雜交篩選方法(如Benton WD和Davis RW(1977)Sci-ence196180；Goodspeed et al.(1989)Gene761；Dunn et al.(1989)J.Biol.Chem.26413057)，采用以圖1A-1D和圖2所示的核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計的雜交探針可以方便地從克隆文庫(如從Clontech，Pa1o Alto，CA獲得的)分離編碼WBPI或p53UBC的基因組成cD-NA克隆。在需要cDNA克隆的文庫中，含有得自表達大量WBPI或p53UBC mRNA的細胞的cDNA的克隆文庫是優(yōu)選的。作為選擇，可以經(jīng)寡核苷酸的化學(xué)合成構(gòu)建相應(yīng)于圖1A-1D和2所示的全部或部分序列的合成多核苷酸序列。此外，采用基于圖1A-ID和2公開的序列信息的引物的聚合酶鏈反應(yīng)可以用于擴增來自基因組DNA、mRNA庫或cDNA克隆文庫的DNA片段。美國專利4,683,195和4,683,202描述了該PCR方法。此外也可以使用基于圖1A-1D或圖2公開的序列信息的一種引物和不基于所述序列信息的第二種引物的PCR方法。例如可以使用同源于或互補于多聚腺苷酸化片段或隨機片段(randomer)的第二種引物。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，很明顯，核苷酸取代、缺失和添加可以摻入本發(fā)明的多核苷酸中。核苷酸序列變異體可以從各種WBP1或p53UBC等位基因的多態(tài)性，小的測序誤差等產(chǎn)生。然而，這些核苷酸取代、缺失和添加應(yīng)基本上不破壞所述核苷酸在足以嚴格產(chǎn)生特異性雜交的雜交條件下雜交到圖1A-1D或2所示的多核苷酸序列之一上的能力。
本文將特異性雜交限定為在探針多核苷酸(如可以包含取代、缺失和/或添加的本發(fā)明的一種多核苷酸)和特異性靶多核苷酸(如具有圖1A-1D或圖2所示序列的多核苷酸)之間形成的雜交。其中，探針優(yōu)先雜交到特異性靶上，以便例如，相應(yīng)于WBP1或p53UBCmRNA的單一帶(或相應(yīng)于WBP1或p53UBC基因的多種可變剪接產(chǎn)物的帶)可以在從合適細胞源(如表達WBP1或p53UBCmRNA的細胞)制備的RNA的Northern印跡上被識別?？梢园凑毡绢I(lǐng)域公知的和Maniatis et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，andEd，(1989)，Cold Spring Harbor，N.y.和Berger and Kimmel，Meth-ods in Enzymology，Volume 152，Guide to Molecular Cloning Tech-niques(1987)，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(本文引用以供參考)中描述的方法，以圖1A-1D或圖2給出的序列信息為基礎(chǔ)制備本發(fā)明的和重組產(chǎn)生的WBP1或p53UBC的多核苷酸、和其片段或類似物。
WBP1或p53UBC多核苷酸可以是短的寡核苷酸)如，25-100堿基長)，如用作雜交探針和PCR(或LCR)引物。WBP1或p53UBC多核苷酸序列也可以包括較大多核苷酸的一部分(如包含WBP1或p53UBC克隆的克隆載體)，并且可以經(jīng)多核苷酸連接融合進具有編碼不同蛋白質(zhì)(如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶或β-半乳糖苷酶)的其它多核苷酸序列的讀框以便編碼表達融合蛋白質(zhì)。WBP1和p53UBC多核苷酸典型地包含至少25個核苷酸的與天然產(chǎn)生的WBP1或p53UBC序列(如圖1A-1D或圖2)基本上相同的連續(xù)核苷酸，WBP1和p53UBC多核苷酸更常見地包含至少50-100個核苷酸的與天然產(chǎn)生的WBPI或p53UBC序列基本上相同的連續(xù)核苷酸。然而，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員會認識到，需要分別特異性雜交到WBP1或p53UBC上的WBP1或p53UBC多核苷酸的最低長度，靶序列將取決于幾個因素，其中有G/C含量、錯配堿基(如果有的話)的位置、與靶多核苷酸群體比較的序列獨特程度和多核苷酸的化學(xué)性質(zhì)(如甲基磷酸酯骨架、磷酸硫醇酯(phosphorothiolate)等。
作為舉例但不作為限制，檢測和/或定量樣品中存在的WBP1mRNA的合適雜交探針一般包含至少1種，優(yōu)選地是至少2種，常常是5種，偶爾是9種，更優(yōu)選地是所有表I所示的下列人WBP1序列或它們的互補序列表I選擇的人WBP1多核苷酸序列5’-GCACGAGGCGGACAGTGCGGAACTAAAGCAAATGGTTATG-3’5’-CTTCAAAAATTACCATTTTATGATTTACTGGATGAACT-3’5’-CATCAGACAACAGTCAGCGCTTTCGAGAAACCTGTTTTGC-3’5’-CACAACAAGTGCAGCAAATCAGTAGTTCCATGGATA-3’5’-GTACAGGTCCAGTTAAGGTTTTGTTTATCAGAAACCAGTTG-3’5’-TGAAAGTGAATACAAAACCTTGCAGCCTTCCAGG-3’5’-CCACCTACAAAAAATGGCGTGGAACCAAAGCGACCCAGCCGAC-3’5’-GACTGTCCACAACAGTACCAAACACGATTGTTG-3’5’-GGAAGAAACTATTCCATGGCAGTATATCTTGTAAAACAGT-3’5’-CAGAGGTTACGAGCAAAGGGAATAAGGAATCCGGATCATTCTAGAG-35’-GGATCCAGACAGTGAAATAGCTACAACCAGCCTAAG-3’5’-CTTGGTAAAATGCGGCTGACAATTCCGTGTCGGGCCCTTAC-3’5’-CATCTACAATGTTTTGACGCAACTCTTTACATTCAGATG-3’5’-GTCCTGTCTGTGATAAGAAGGCTCCATATGAACACC-3’5’-TCCTAAAGTACTGTACAGACTGTGATGAAATACAATTTAAGGAGGATG-3’5’-GGAAGTACAGGAAGTTTCTGCCTCTTACATGGAGTC-3’5’-CTTGAGCTCCACATTGGAGCATCAGGTAGCGTCTCACCAC-3’5’-AGTGATTGACCTAACCATAGACAGTTCATCTGATGAAGAGGA-3’5’-CCAAGAGGACCTGTCCTTCCCTATCTCCCACATCACCACT-3’5’-CTTCCACATCAAGCATCTCCAGTATCCCGCACCCCAAGCCTTC-3’5’-TAATACCTCCCTCATCCAAGACTATAGGCATCCTTTCC-3’5’-CCATGCCTTACGACTTACAAGGATTAGATTTCTTTCCTTTCTTATCA-3’5’-ACAACACCTCCTTGCTTGCCGCTGCAGCAGCAGCAGTTTCAGAT-3’5’-CTACACTCGTCTCGGTTTTTCCCGTATACCTCCTCACAG-3’5’-GGAGGCAGTACTTCTCTGCCAACCACCAATGGAAGC-3’5’-GGTTTCTTCCAACAGCCTAAGGGAAAGCCATAGCCACAC-3’5’-CGGACACGGCATCCATCTTTGGCATCATACCAGACATTAT-3’5’-GCTGCTCCCATCCCCACCCCAGATCGAATGAACTTGGCAGA-3’5’-GTGCTCTGTTTTACCTTACTCTGTTTAGAAAAGTATACAAGCGTG-3’5’-GAAATGTACAGAGAACAAAACTATATTTTCAGTT-3’5’-CTTTTGTATATAAATCTAAGACTGCCTGTGTGATAAAACACTTG-3’不依賴于形成作為雜交探針有用的WBP1多核苷酸選擇表I的序列或它們的互補序列。典型地，這些序列以與在天然產(chǎn)生的WBP1mRNA和/或基因中發(fā)現(xiàn)的相同的取向和順序置入，并且可以包含無關(guān)序列(如，pBR322，隨機序列等)的一個或多個間隔區(qū)。這些間隔序列典型地是獨立選擇，它包含0-300個核苷酸(如果在翻譯讀框中融合時為0-100個氨基酸)。
也作為舉例但不作為限制的是，下列PCR引物(擴增引物)對可用于擴增鼠或人WBP1序列(例如，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶啟動的得自WBP1表達細胞的RNA的PCR)(正向)5′-CACGAGGCGGACAGTGCGGAACTAAAGCAAATGG-3’(逆向)5′-CAAGTGTTTTATCACACAGGCAGTCTTAGAT-3’如果需要，擴增基本上全長cDNA拷貝的PCR擴增引物可以由操作者的判斷選擇。類似地，可以選擇擴增單個WBP1外顯子或WBP1基因(鼠或人)的部分的擴增引物。
這些序列的每一序列均可用作檢測WBP1mRNA存在(例如診斷以細胞中存在提高的WBP1mRNA水平為特征的疾病或進行組織分型(即，鑒別以表達WBP1mRNA為特征的組織)等)的雜交探針或PCR擴增引物。所述序列也可以用來檢測DNA樣品中基因組WBP1基因序列，如用于法醫(yī)DNA分析(如，經(jīng)RFLP分析，PCR產(chǎn)物長度分布等)或用于診斷以WBP1基因擴增和/或重排為特征的疾病。
作為舉例但不作為限定，檢測和/或定量樣品中存在p53UBCmRNA的合適雜交探針一般包括至少1種，優(yōu)選地是至少2種，更優(yōu)選地是所有表II所示的下列人p53UBC序體或它們的互補序列表II選擇的人p53UBC多核苷酸序列5’-GGACTTTGAACATGTCGGGGATCGCCCTCAGCAGACTCGCCCAG-3’5’-AAGACCACCCATTTGGTTTCGTGGCTGTCCCAACA-3’5’-CTCATGAACTGGGAGAGCGCCATTCCAGGAAAGAAAGGGAC-3’5’-ACTACGGATGCTTTTCAAAGATGATTATCCATCTTC-3’5’-CACCCGAATGTGTACTTCGGGACAGTGTGCCTGTCCATC-3’5’-AGGACAAGGACTGGAGGCCAGCCATCACAATCAAACAGATC-3’5’-TGAACCAAATATCCAAGACCCAGCTCAAGCAGAGGCCTACACG-3’5’-AACAGAGTGGAGTACGAGAAAAGGGTCCGAGCTCAAGCCA-3’5’-AGCGACCTTGTGGCATCGTCAGAAGGAAGGGATTGGTTTGGC-3’5’-TTGCAAATCTAAAGTTGCTCCATACAATGACTAGTCACCT-3’5’-TCTTCCATTGCCGCCGCGGGTGTGCGGTCTCGATTCGCTG-3’5’-CATACAGGGTCTCTTCTTCGGTCTTTTGTATTTTTGATTG-3’5’-ATATTGATGTCAGTATTTCAACTGCTGTAAAATTATAAAC-3’
5’-GGGCGAGTTCCTCGCTCTGGGATGCAGGCATGCTTCTCAC-3’5’-GGCCTCAGCTGGCTGTATGGAAATGCACCCTCCCTCCTGCGCTC-3’5’-CTTCTAGAACCTGGGCTGTGCTGCTTTTGAGCCTCAGACCCCAGG-3’5’-TCTGCGCCACTTCCTTTGTGTTTATATGGCGTTTTGTCTGTG-3’5’-CTGTGTTGCTGTTTAGAGTAAATAAACTGTTTATATA-3’5’-TCACCACCTCAGTTATACTCTTATTCCTAGATATTTGGGACA-3’5’-CCTCCTCAAATACAGAATAAAAGCTGCTATGCCTGAGGCAT-3’5’-TTGTTGGTCCGGCACATCATATTTTACTATTTGTTTGAGGTATTTG-3’5’-GTGAATAATCTTGTCTTTTTATTTTAATATACACAGCACAG-3’5’-TAATTGCGTTTTGTGGACTTTACAACATGGCTAAACCCAT-3’5’-TAAATTGAAATGAATTAGGCCAGAGGAGATCAGACAT-3’5’-GAATTTAAAGTTAGTCTTGAGAGAAACTTAGGTAAAAAG-3’5’-TGTGAGAGTTGAAAGATATAAGTTCCAGAATG了TGTGGCA-3’5’-CTGGTTCCTAAAGACGGAGGAGACTCTCTCCCAGCACCTGACTTCCA-3’5’-TGCCTGGGCTGTTCCTAGCCTGGAGCACTGTCCCCCGTCTCGAT-3’5’-ACCCCTGCAGGGGCTGCCCTCTTTTGGCCTCCCACTGTGTCCCTTC-3’5’-CTGGCCTTGAATGTCTCTTTCTCACCAGTACCTTGCACAG-3’也作為舉例但不作為限制的是，下列PCR引物(擴增引物)對可用于擴增鼠或人p53UBC序列(例如，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶啟動的得自p53UBC表達細胞的RNA的PCR)(正向)5’-GAGGGACTTTGAACATGTCGGGGATCGCCCTCAG-3’(逆向)5’-GAGACATTCAAGGCCAGGCTGAGATCTAATGCACA-3’如果需要，擴增基本上全長cDNA拷貝的PCR擴增引物可以由操作者的判斷選擇。類似地，可以選擇擴增單個p53UBC外顯子或p53UBC基因(鼠或人)的部分的擴增引物。
這些序列的每一序列均可用作檢測p53UBCmRNA存在(例如診斷以細胞中存在提高的p53UBCmRNA水平為特征的疾病或進行組織分型(即，鑒別以表達p53UBCmRNA為特征的組織)等)的雜交探針或PCR擴增引物。所述序列也可以用來檢測DNA樣品中基因組p53UBC基因序列，如用于法醫(yī)DNA分析(如，經(jīng)RFLP分析、PCR產(chǎn)物長度分布等)或用于診斷以p53UBC基因擴增和/或重排為特征的疾病。
WBP1和p53UBC多肽的產(chǎn)生圖1A-1D和2所示的核苷酸和氨基酸序列能使本領(lǐng)域的技術(shù)人員產(chǎn)生分別相應(yīng)于全長人WBP1或P53UBC多肽序列的全部或部分的多肽序列。這些多肽可以通過編碼WBP1或p53UBC的多核苷酸或其片段和類似物在原核或真核宿主細胞中表達產(chǎn)生。作為選擇，這些多肽可以經(jīng)化學(xué)方法合成或經(jīng)采用多核苷酸模板指導(dǎo)翻譯經(jīng)體外翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生。在重組宿主中表達異源蛋白質(zhì)、化學(xué)合成多肽和體外翻譯的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且在下列文獻中進一步被描述Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(1989)，2nd Ed.，Cold Spring Harbor，n.y.Berger and Kim-mel，Methods in Enzymology，Volume 152，Guide to MolecularCloning Technigues(1987)，Academic Press，Inc.，San Diego，CA.
WBP1或p53UBC片段或類似物可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員制備。WBP1或p53UBC片段或類似物優(yōu)選的氨基和羧基末端出現(xiàn)在功能域邊界附近。作為舉例但不作為限定，這些功能域包括(1)賦予結(jié)合到p53上的性質(zhì)的區(qū)域，或(2)賦予誘導(dǎo)主要的p53突變體表型(當(dāng)在表達野生型p53細胞中以足夠的水平表達時)的性質(zhì)的區(qū)域。此外，這些功能域可以包括(1)賦予結(jié)合到RNA聚合酶種類上的性質(zhì)的區(qū)域，(2)具有直接改變局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)之能力的區(qū)域，它可以包含催化活性(如拓撲異構(gòu)酶、核酸內(nèi)切酶)和/或它可以包含結(jié)構(gòu)特征(如鋅指結(jié)構(gòu)、組蛋白結(jié)合部分)，和(3)可以與輔助蛋白質(zhì)和/或轉(zhuǎn)錄因子相互作用的區(qū)域。
一種可以鑒別結(jié)構(gòu)和功能域的方法是將圖1A-1D和2所示的核苷酸和/或氨基酸序列信息與公共或?qū)Ｓ行蛄袛?shù)據(jù)庫比較。優(yōu)選地是用計算機化的比較方法來鑒別序列區(qū)域或預(yù)言的蛋白質(zhì)構(gòu)象域(出現(xiàn)在已知結(jié)構(gòu)和/或功能(如鋅指結(jié)構(gòu))的其它蛋白質(zhì)中)。例如，脫氫酶(特別是乳酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶)的NAD-結(jié)合域是構(gòu)象相似的，且具有可檢測的同源的氨基酸序列(Proteins，Structuresand Moleeular Principles，(1984)Creighton(ed.)，W.H.Free-man and Company，New York，本文引用以供參考)。而且，識別折疊成公知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列的方法是已知的(Bowie et al.(1991)Science253164)。因此，以上例子說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以識別能用于確定本發(fā)明的WBPI和p53UBC序列中結(jié)構(gòu)和功能域的序列區(qū)域和結(jié)構(gòu)構(gòu)象。
此外，圖1A-1D和2所示序列與現(xiàn)存的序列數(shù)據(jù)庫的計算機化的比較可以鑒別在其它蛋白質(zhì)或編碼序列(表現(xiàn)出WBPI和p53UBC蛋白質(zhì)的類似域)中發(fā)現(xiàn)的序列區(qū)域和結(jié)構(gòu)構(gòu)象。用作舉例但不用作限制的是，Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)中的程序GAP.BESTFIT，F(xiàn)ASTA和TFASTA可用于鑒別具有與WBPI或p53UBC序列同源的區(qū)域的數(shù)據(jù)庫，例如GenBank/EMBL中的序列。這些同源區(qū)是候選結(jié)構(gòu)或功能域。作為選擇，給出了鑒別序列信息這些區(qū)域的其它規(guī)則。此外，補充硬件或軟件的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法可用于(1)鑒別相關(guān)蛋白質(zhì)序列和核苷酸序列，和(2)確定WBPI和p53UBC多肽中的結(jié)構(gòu)或功能域(Brunak et al.(1991)J.Mol.Biol.22049，本文引用以供參考)。
基本上包含一個或多個功能域的片段或類似物可以融合進異源多肽序列，其中形成的融合蛋白質(zhì)表現(xiàn)出由WBPI或p53UBC片段賦予的功能性質(zhì)。作為選擇，已缺失一個或多個功能域的WBPI或p53UBC多肽會表現(xiàn)出喪失正常情況下由所喪失的片段賦予的性質(zhì)。
盡管一類優(yōu)選的實施方案是具有相應(yīng)于靠近功能域邊界的氨基酸位置的氨基和/或羧基末端的片段，但也可以制備另外的WBP1或p53UBC片段。這種片段的氨基和羧基末端的選擇可以基于操作者的判斷，并且基于實驗考慮的因素(例如構(gòu)建難易、蛋白酶解隱定性、熱穩(wěn)定性、免疫反應(yīng)性、氨基或羧基末端殘基修飾或其它需考慮的因素)進行。
除了片段外，可以制備WBP1或p53UBC類似物。這些類似物可以在氨基末端或羧基末端或內(nèi)部或者兩者上包含一個或多個氨基酸序列缺失或添加。類似物可以進一步包括序列轉(zhuǎn)座。類似物也可以包含氨基酸取代(優(yōu)選保守取代)。此外，類似物可以包括一般連接到氨基或羧基末端上的異源序列，其中所說的異源序列賦予所得類似物形成天然WBP1或p53UBC蛋白質(zhì)所不固有的功能性性質(zhì)。然而，WBP1或p53UBC類似物必須包含25個氨基酸的一個區(qū)段，該區(qū)段基本上分別類似于圖1A-1D或2所示的氨基酸序列的一部分，并且具有至少一種列舉(見上述)的必需的功能性質(zhì)。優(yōu)選的氨基酸取代是有以下作用的取代(1)降低蛋白酶解敏感性，(2)降低氧比敏感性，(3)改變類似物的轉(zhuǎn)錄后修飾，可能包括磷酸化，和(4)賦予或改善這些類似物的其它理化或功能性質(zhì)，可能包括與p53相互作用或磷酸化或其去磷酸化。WBP1或p53UBC類似物包括WBP1或p53UBC序列的各種突變蛋白質(zhì)而不是天然產(chǎn)生的肽序列。例如，可以在天然產(chǎn)生的WBP1或p53UBC序列中(優(yōu)選在功能域以外的多肽部分中)進行單個或多個氨基酸取代(優(yōu)選保守氨基酸取代)。
保守氨基酸取代是一種氨基酸被具有類似特征(如具有酸性的那些Asp和GLU)的替代的氨基酸取代。保守(或同義)氨基酸取代應(yīng)基本上不改變母序列的結(jié)構(gòu)特征(如，替換性氨基酸應(yīng)沒有斷裂母序列中出現(xiàn)的螺旋的趨勢或者破壞作為母序列特征的其它類型的二級結(jié)構(gòu)的趨勢)。Proteins，Structures and Molecular princi-ples，(1984)Creighton(ed.)，W.H.Freeman and Company，NewYork；Introduction to Protein Structure(1991)，C.Branden andJ.Tooze，Garland Publishing，New York，，NY；和Thornton etal.(1991)Nature354105(本文引用以供參考)中描述了art-識別的多肽二級和四級結(jié)構(gòu)的例子。
天然WBP1或p53UBC蛋白質(zhì)、其片段或其類似物在鑒別干擾p53功能的試劑的p53結(jié)合試驗中可用作試劑，所說的試劑作為p53調(diào)節(jié)劑被識別出來，它們是候選藥物。在測定WBP1或p53UBC多肽與p53結(jié)合的體外p53結(jié)合試驗中，典型地是在允許在具有約1×106M-1或更大的結(jié)合親和力的結(jié)合反應(yīng)中的特異性結(jié)合的含水條件(例如，10-250mM NaCl或KCl和5-100mM Tris HClPH5-9(通常PH6-8)，一般可包含納摩爾到微摩爾范圍內(nèi)(InM到999μM)的Zn2+和/或Mn2+和/或Mg2+)下將WBP1或p53UBC多肽與p53多肽接觸。典型地是經(jīng)以操作者判斷的不同濃度添加未標記的競爭劑來確立結(jié)合特異性。非標記的蛋白質(zhì)競爭劑的例子包括但不限于以下一些未標記的WBP1或p53UBC多肽、牛血清白蛋白、干奶組分和核蛋白提取物。其中添加一種或多種藥劑的結(jié)合反應(yīng)與未包含藥劑的對照結(jié)合反應(yīng)平行進行。與對照反應(yīng)比較抑制WBP1或p53UBC多肽與p53特異性結(jié)合的藥劑作為候選p53調(diào)節(jié)藥物被識別出來。
WBP1和p53UBC多肽具有許多用途，包括但不限于將它們用作腫脹增壓溶質(zhì)(典型地是將15-10,000個氨基酸或更多氨基酸的WBP1或p53UBC多肽溶解在含水溶劑(如PBS)中，以產(chǎn)生具有基本腫脹壓的溶液，或者作為非特異性封閉劑以便在免疫測定形式中替代白蛋白或奶乳清蛋白質(zhì)，例如，Western印跡預(yù)封閉溶液)、將它們用作營養(yǎng)性食品原料、將它們用作可燃性能源和本文描述的或操作者顯而易見的它們的其它用途。
p53相互作用多肽的肽模擬物除了僅由天然產(chǎn)生的氨基酸組成的p53相互作用多肽外，也提供了WBP1或p53UBC肽模擬物，肽類似物通常作為性質(zhì)類似模板肽性質(zhì)的非肽藥物用于制藥工業(yè)中。這些類型的非肽化合物稱作“肽模擬物”(Fauchere，J.(1986)Adv.Drug Res.1529；Veber andFreidinger(1985)TINSp.392；和Evans et al.(1987)J.Med.Chem.301229，本文引用以供參考)，并且通常在計算機制作分子模型的幫助下開發(fā)。結(jié)構(gòu)上類似于治療上有用的肽的肽模擬物可以用于產(chǎn)生等同的治療或預(yù)防效果。一般來說，肽模擬物結(jié)構(gòu)類似于范例多肽(即，具有生物學(xué)和藥理學(xué)活性的多肽)(例如人WBP1或p53UBC)，但有一個或多個肽鍵選擇性地被選自由以下組成的組中的鍵替代-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(順式和反式)、-COCH2-、CH(OH)CH2-和-CH2SO-，所說的替代是用本領(lǐng)域公知且進一步在下列參考文獻中描述過的方法進行的Spatola，A.F.in“Chemistry and Biochemistry of AminoAcids，Peptides，and Proteins，”B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)；Spatola，A.F.，Vega Data(March1983)，Vol.1，Issue 3，“Peptide Backbone Modifications”(generalreview)；Morley，J.S.，Trends Pharm Sci(1980)pp.463-468(general review)；Hudson，D.et al.，Int J Pept Prot Res(1979)14177-185(-CH2NH-，CH2CH2-)；Spatola，A.F.etal.，Life Sei(1986)381243-1249(-CH2-S)；Hann，M.M.，JChem Soc Perkin Trans I(1982)307-314(-CH-CH-，cisand trans)；Almquist，R.G.et al.，J Med Chem(1980)231392-1398(-COCH2-)；Jennings-White，C.et al.，TetrahedronLett(1982)232533(-COCH2-)；Szelke，M.et al.，EuropeanAppln.EP 45665(1982)CA9739405(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladay，M.W.et al.，Tetrahedron Lett(1983)244401-4404(-C(OH)CH2-)；和Hruby，V.J.，Life Sci(1982)31189-199(-CH2-S-)；本文引用以上各參考文獻以供參考。一種特別優(yōu)選的非肽連接是-CH2NH-。這些肽模擬物可以具有超過多肽實例的明顯優(yōu)點，這些優(yōu)點包括，例如生產(chǎn)更經(jīng)濟、化學(xué)穩(wěn)定性更高、提高的藥理學(xué)性質(zhì)(半衰期、吸收、效力、效能等)、改變的特異性(如，生物學(xué)活性的廣譜性)、降低的抗原性等。肽模擬物標記通常涉及將一種或多種標記直接或經(jīng)間隔物(如，酰胺基)共價連接到由構(gòu)效數(shù)據(jù)和/或分子模型制作預(yù)言的肽模擬物上的非干擾性位置上。這些非干擾性位置一般是與肽模擬物結(jié)合到其上產(chǎn)生治療作用的大分子(如p53)不產(chǎn)生直接接觸的位置。肽模擬物的衍生化作用(如，標記)應(yīng)基本上不影響肽模擬物所需的生物學(xué)或藥理學(xué)活性。WBP1或p53UBC的肽模擬物可以分別用作WBP1或p53UBC功能的競爭性或非競爭性刺激劑或拮抗劑。例如，施用到含WBP1蛋白質(zhì)的細胞上的WBP1肽模擬物可以與天然產(chǎn)生的WBP1蛋白質(zhì)競爭并降低WBP1活性。作為選擇，施用到缺乏WBP1的細胞上的WBP1肽模擬物可以提供WBP1功能(如，調(diào)節(jié)p53活性)等。
用相同類型的D氨基酸對共有序列的一種或多種氨基酸的分類取代(如，D-賴氨酸取代L-賴氨酸)可以用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。此外，含有共有序列或基本上相同的共有序列變異體的約束肽(包括環(huán)狀化肽)可以用本領(lǐng)域公知的方法(Rizo and Gierasch(1992)Ann.Rev.Biochem.61387本文引用以供參考)產(chǎn)生，例如，通過加入能夠形成分子內(nèi)環(huán)化肽的二硫鍵的內(nèi)半胱氨酸殘基。
本文鑒別的WBP1或p53UBC多肽的氨基酸序列將能使本領(lǐng)域技術(shù)人員產(chǎn)生相應(yīng)于WBP1或p53UBC肽序列和其序列變體的多肽。這些多肽通常可以作為較大多肽的一部分在原核或真核宿主細胞中經(jīng)表達編碼WBP1或p53UBC肽序列的多核苷酸產(chǎn)生。作為選擇，這種肽也可以由化學(xué)方法合成。在重組宿主中表達異源蛋白質(zhì)、化學(xué)合成多肽和體外翻譯方法是本領(lǐng)域公知的并且在以下文獻中有進一步的描述Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(1989)，2nd Ed.，Cold Spring Harbor，N.Y.；Berger andKimmel，Methods in Enzymology，Volume 152，Guide toMolecular Cloning Technigues(1987)，Academic Press，Inc.，SanDiego，CA；Merrifield，J.(1969)J.Am.Chem.Soc.91501；Chaiken I.M.(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.11255；Kaiseret al.(1989)Science243187；Merrifield，B.(1986)Science232342；Kent，S.B.H.(1988)Ann.Rev.Biochem.57957；和Offord，R.E.(1980)Semisynthetic Proteins，Wiley Publishing，本文引用這些文獻以供參考。
α-WBP1或α-p53UBC抗體的產(chǎn)生和應(yīng)用天然p53相互作用多肽、其片段或其類似物，可以用于免疫用來產(chǎn)生特異性抗體的動物。這些抗體可以包括多克隆抗血清或可以包括由雜交瘤細胞產(chǎn)生的單克隆抗體。制備抗體的一般性方法可參見AntibodiesA Laboratory Manual，(1988)E.Harlow and D.Lane，Cdd Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，本文引用該文獻作為參考。
作為例子但不用來限制的方法是，將重組產(chǎn)生的人WBP1或p53UBC片段按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的免疫方法與佐劑一起注射進大鼠，以產(chǎn)生免疫反應(yīng)。通常約至少1-50μgWBP1或p53UBC片段或類似物用于初始免疫，具體量取決于多肽的長度。
作為選擇或與重組產(chǎn)生的WBP1或p53UBC多肽結(jié)合的方法是，將具有WBP1或p53UBC序列(如表III和IV列舉的肽，見下述)的化學(xué)合成肽可以用作免疫原來產(chǎn)生分別結(jié)合WBP1或p53UBC蛋白質(zhì)(例如，具有基本上如圖1A-1D或圖2所示序列的天然人WBP1或p53UBC多肽)的抗體。以至少1×107M-1結(jié)合親和力結(jié)合重組片段的免疫球蛋白可以作為抗血清從免疫過的動物收獲，并且可以經(jīng)免疫親和層析或其它方法進一步純化。此外，從免疫過的動物(典型的是大鼠或小鼠)收獲脾細胞，將其與骨髓瘤細胞融合以產(chǎn)生抗體篩選雜交瘤細胞庫。所述雜交瘤庫可用來篩選分泌以至少1×106M-1親和力結(jié)合重組產(chǎn)生的WBP1或p53UBC多肽(或化學(xué)合成的WBP1或p53UBC多肽)的免疫球蛋白的克隆。除小鼠和大鼠之外的動物也可用于產(chǎn)生抗體，例如，山羊、兔子、綿羊和雞也可以用于產(chǎn)生與WBP1或p53UBC蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體。具有基本上產(chǎn)生人抗體能力的轉(zhuǎn)基因小鼠也可以被免疫，并用作α-WBP1或α- p53UBC抗血清源和/或用于制備單克隆分泌雜交瘤。
也可以篩選結(jié)合WBP1或p53UBC多肽的噬菌體抗體顯示文庫，所述的多肽例如，全長人蛋白質(zhì)、片段(如具有表III或IV所示序列的肽，見下述)、或含有圖1A-1D或圖2所示的至少14個毗連氨基酸的WBP1或p53UBC多肽序列或表III或IV(見下述)多肽序列的融合蛋白質(zhì)。已在可作為噬菌斑或溶源菌克隆被篩選的λ噬菌體表達系統(tǒng)中產(chǎn)生組合的抗體文庫(Huse et al.(1989)Science2461275；Caton and Koprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci(U.S.A.)876450；Mullinax et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Scil(U.S.A.)878095；Persson et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Scil(U.S.A.)882432。已描述了噬菌體抗體顯示文庫和λ噬菌體表達文庫的各種實例(Kang et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)884363；Clack-son et al.(1991)Nature352624；McCafferty et al.(1990)Nature348552；Burton et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)8810134；Hoogenboom et al.(1991)Nucleic Acids Res.194133；Changet al.(1991)J.Immunol.1473610；Breitling et al.(1991)Gene 104；Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.222581；Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Scil(U.S.A.)894457；Hawkins and Winter(1992)J.Immunol.22867；Marks et al.(1992)Biotechnology10779；Markset al.(1992)J.Biol.Chem.26716007；Lowman et al(1991)Biochem-istry3010832；Lerner et al.(1992)Science2581313，本文引用以供參考)。典型的是用固定化的(如，經(jīng)共價連接到色譜樹脂上以便由親和層析富集反應(yīng)性噬菌體)和/或標記的(如，為篩選噬斑或菌落轉(zhuǎn)移物)WBP1或p53UBC多肽篩選噬菌體抗體顯示文庫。
在診斷性檢測樣品中α-WBP1或α-p53UBC抗體、診斷性檢測和定量分析樣品中WBP1或p53UBC蛋白質(zhì)(如經(jīng)標準的競爭性ELISA)或篩選噬菌體抗體顯示文庫中作為免疫原有用的WBP1或p53UBC多肽適合以基本上純的形式獲得，即，典型地是約50％(W/W)或純度更高，基本上不含干擾性蛋白質(zhì)和污染物。優(yōu)選地以至少80％(W/W)的純度，更優(yōu)選地以至少約95％(W/W)的純度，基本上不含有人和小鼠的其它蛋白質(zhì)或其它污染物的形式分離或合成這些多肽。優(yōu)選的免疫原包含至少表III或IV所示的至少一種WBP1或p53UBC多肽序列，作為一種分泌肽或作為融合多肽的一部分(如，具有β-半乳糖苷酶或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶序列)。WBP1或p53UBC免疫原包含至少一種，典型地是幾種這樣的致免疫表位。
就這些抗體的某些用途(如鑒別免疫交叉反應(yīng)性蛋白質(zhì))來說，所需的抗血清或單克隆抗體是非單特異性的。在這些情況下，優(yōu)選地是用WBP1或p53UBC的合成或重組片段而不是用完整的天然蛋白質(zhì)作為抗原。更具體地說，當(dāng)目標是鑒別包含特定結(jié)構(gòu)部分(如p53結(jié)合域)的免疫交叉反應(yīng)性多肽時，用相應(yīng)于p53相互作用多肽中相稱結(jié)構(gòu)域的部分或全部的片段作為抗原是優(yōu)選的。分別由圖1A-1D和圖2所示的WBP1或p53UBC序列產(chǎn)生具有這樣限定的氨基和羧基末端的重組或合成片段。
如果抗血清是一種WBP1或p53UBC融合多肽(如包含融合進β-半乳糖苷酶或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的WBP1或p53UBC致免疫表位的融合蛋白質(zhì))時，抗血清優(yōu)選用非p53相互作用多肽融合配偶體(如，β-半乳糖苷酶或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)預(yù)吸收，以除盡抗血清中反應(yīng)(即特異性結(jié)合到)用作免疫原的融合蛋白質(zhì)的非p53相互作用多肽部分的抗體。結(jié)合人和/或鼠WBP1或p53UBC蛋白質(zhì)的單克隆或多克隆抗體可用于檢測樣品中人或小鼠WBP1或p53UBC多肽的存在，例如從病人細胞樣品獲得的變性蛋白質(zhì)的Western印跡(如SDS-PAGE硝基纖維素印跡)法。優(yōu)選進行定量檢測，例如經(jīng)Western印跡的密度計掃描和信號整合。單克隆或多克隆抗體將結(jié)合到變性的WBP1或p53UBC表位上，并且可以經(jīng)肉眼鑒別或按本領(lǐng)域公知的方法用標記的第二抗體或標記的金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A經(jīng)其它光學(xué)法鑒別。通常，變性WBP1或p53UBC將被用作靶抗原，以便可以獲得更多的用于結(jié)合的表位。
表IIIWBP1多肽序列和表位-HYNTSLLAAAAAAVSDDQDL- -LHSSRFFPYTSSQMFLDQLSA--LPPTKNGVEPKRPSRPINI- -SLVRLSTTVPNTIVVSWTA--KELYRRRFPQKIMTPADLSIPN- -KLQKLPFYDLLDELIK--EKLTADPDSEIATTSLRVS- -LLCPLGKMRLTIPCRALTCS--IGRNYSMAVYLVKQLSSTV- -LLQRLRAKGIRNPDHSRALI--DFTVQVQLRFCLSETSCPQE- -HFPPNLCVKVNTKPCSLPG--TSLASDNSQRFRETCFAF- -PQQVQQISSSMDISGTKC--LQCFDATLYIQMNEKKPTW- -VCPVCDKKAPYEHLIIDGL--EILKYCTDCDEIQFKEDGT- -WAPMRSKKEVQEVSASYNGV--DGCLSSTLEHQVASHHQSSN- -KNKKVEVIDLTIDSSSDEEEEE--EEPSAKRTCPSLSPTSPLNN- -KGILSLPHQASPVSRTPSLP--AVDTSYINTSLIQDYRHPFH- -TPMPYDLQGLDFFPFLSGD--SLVSSNSLRESHSHTVTNR- -SSTDTASIFGIIPDIISLD--HSSPMPATLSPSTIPQLTYDG--HPASSPLLPVSLLGPKHELELPH--ELPHLTSALHPVHPDIKLQ- -FAFALTPQQVQQISSSMDISGTKC-表III中所示的這些WBP1序列可以直接用作致免疫肽(如，用于篩選噬菌體抗體顯示文庫或免疫兔子)，或可以與載體大分子(如BSA)或可以構(gòu)成融合蛋白質(zhì)的一部分用作免疫原。優(yōu)選的WBP1多肽包含下列氨基酸序列-PASSPLLPVSLLGPKHELEH-；-PQQVQQISSSMDISGTKC-；-LLQRLRAKGIRNPDHSRALI-；-WAPMRSKKEVQEVSASYNGV-；-EEPSAKRTCPSLSPTSPLNN-；-TPMPYDLQGLDFFPFLSGD-；-SLVSSNSLRESHSHTVTNR-；-SSTDTASIFGIIPDIISLD-；并且可以包含其它間插和/或末端序列；這些多肽一般長度少于1000個氨基酸，更常見的是長度少于約500個氨基酸；通常，間隔肽序列或末端肽序列(如果存在的話)相當(dāng)于天然產(chǎn)生的多肽序列(一般是哺乳動物多肽序列)。優(yōu)選地，這些氨基酸序列從氨基末端到羧基末端方向的順序是(1)-PASSPLLPVSLLGPKHELEH-；(2)-PQQVQQISSSMDISGTKC-；(3)-LLQRLRAKGIRNPDHSRALI-；(4)-WAPMRSKKEVQEVSASYNGV-；(5)-EEPSAKRTCPSLSPTSPLNN-；(6)-TPMPYDLQGLDFFPFLSGD-；(7)-SLVSSNSLRESHSHTVTNR-； (8)-SSTDTASIFGIIPDIISLD-剛剛提及的優(yōu)選的WBP1多肽的一種用途是作為在合適的動物中產(chǎn)生α-WBP1抗體的市售免疫原和/或連同本發(fā)明提供的抗-WBP1抗體一起用作定量ELISA(如競爭性ELISA)或競爭性RIA的市售免疫診斷劑，例如，作為在人或細胞分型或細胞識別中WBP1表達腫瘤分期或診斷免疫測定的標準校正物。這些免疫學(xué)檢測可以用于檢測其中許多表位暴露于變性WBP1蛋白質(zhì)或肽片段中(如，蛋白裂解消化后)的變性WBP1多肽(如SDS-聚丙烯酰胺凝膠West-ern印跡法)。除了用作免疫原或免疫試劑外，剛剛提到的優(yōu)選的WBP1多肽還將發(fā)現(xiàn)許多其它用途。一種或多種以上所列序列可以與融合配偶體(如人血清白蛋白、GST等)一起摻入到融合蛋白質(zhì)中。對超過1000個氨基酸的這種融合蛋白質(zhì)來說，如果需要，可以缺失掉融合配偶體(白蛋白)部分以產(chǎn)生約1000個氨基酸或更小的分子大小的序列。
在某些實施方案中，需要采用多價WBP1抗原，它在共價連接物(通常是肽連接物)中包含至少兩個WBP1至免疫表位。這種多價WBP1抗原典型地包含多種源于相同種類(如人或小鼠)的WBP1抗原肽，但可以包含不同物種WBP1蛋白質(zhì)的抗原肽的混合物(即，種間WBP1多價抗原)。通常，多價抗原的一級氨基酸序列中的抗原肽序列的空間順序以與天然產(chǎn)生的WBP1蛋白質(zhì)相同的方向出現(xiàn)，即，天然產(chǎn)生的WBP1蛋白質(zhì)中第二抗原肽序列氨基末端的第一抗原肽序列將是多價抗原中所說第二抗原肽序列的氨基末端。通常，間隔肽序列用于連接多價抗原中的抗原肽序列。這些間隔肽序列可以是預(yù)定的、隨機的或假隨機的序列。間隔肽序列可以相應(yīng)于已知對將用多價抗原免疫的動物為非致免疫性的序列，例如，動物已對其有耐受性的序列。盡管可以給出這類多價抗原的許多例子，但下列實例用來說明但不用來限制-PQQVQQISSSMDISGTKC-(aal)-EEPSAKRTCPSLSPTSPLNN-(aa2)-SLVSSNSLRESHSHTVTNR-其中(aa1)和(aa2)是至少一個氨基酸和少于1000個氨基酸的肽間隔；aa1是不依賴于aa2肽序列選擇的肽序列；aa1(它可以由多個不同的氨基酸組成)的長度與aa2(它可以由多個不同的氨基酸組成)的長度無關(guān)。
優(yōu)選的WBP1多肽免疫原類型包含597個氨基酸長的多肽序列1MKIKELYRRR FPQKIMTPAD LSIPNVHSSP MPATLSPSTI PQLTYDGHPA51 SSPLLPVSLL GPKHELELPH LTSALHPVHP DIKLQKLPFY DLLDELIKPT101 SLASDNSQRF RETCFAFALT PQQVQQISSS MDISGTKCDF TVQVQLRFCL151 SETSCPQEDH FPPNLCVKVN TKPCSLPGYL PPTKNGVEPK RPSRPINITS201 LVRLSTTVPN TIVVSWTAEI GRNYSMAVYL VKQLSSTVLL QRLRAKGIRN251 PDHSRALIKE KLTADPDSEI ATTSLRVSLL CPLGKMRLTI PCRALTCSHL301 QCFDATLYIQ MNEKKPTWVC PVCDKKAPYE HLIIDGLFME ILKYCTDCDE351 IQFKEDGTWA PMRSKKEVQE VSASYNGVDG CLSSTLEHQV ASHHQSSNKN401 KKVEVIDLTI DSSSDEEEEE PSAKRTCPSL SPTSPLNNKG ILSLPHQASP451 VSRTPSLPAV DTSYINTSLI QDYRHPFHMT PMPYDLQGLD FFPFLSGDNQ501 HYNTSLLAAA AAAVSDDQDL LHSSRFFPYT SSQMFLDQLS AGGSTSLPTT551 NGSSSGSNSS LVSSNSLRES HSHTVTNRSS TDTASIFGII PDIISLD 597優(yōu)選的序列種類由以上所示的597個氨基酸序列組成，無氨基末端或羧基末端延伸。
在一個變異體中，WBP1多肽包含含有以下序列的一個p53結(jié)合區(qū)段-SSTLEHQVASHHQSSNKNKKVEVIDLTIDSSSDEEEEEPSAKRTCPSLSPTSPLNNKGILSLPHQASPVSRTPSLPAVDTSYINTSLIQDVRHPFHMTPMP-.
作為舉例但不作為限制的例子是，這樣的一種多肽可以由以下序列組成SSTLEHQVASHHQSSNKNKKVEVIDLTIDSSSDEEEEEPSAKRTCPSLSPTSPLNNKGILSLPHQASPVSRTPSLPAVDTSYINTSLIQDYRHPFHMTPMP.
常常采用編碼基本相同于這些優(yōu)選表位的表位的多核苷酸。這些多核苷酸具有多種用途，包括用作WBP1探針、用作產(chǎn)生包含WBP1表位的多肽(這些蛋白質(zhì)因而是WBP1免疫原或規(guī)范化WBP1免疫測定的市售診斷試劑)的模板、用作多核苷酸疫苗(免疫原)(當(dāng)融合進分泌序列用來施用于動物和制備α-WBP1抗血清和雜交瘤時)。這些多核苷酸也可以用作食品，可燃性能源和增加粘度的溶質(zhì)。
表IVp53UBC多肽序列和表位-GTLNMSGIALSRLAQERKA-； -DHPFGFVAVPTKNPDGTMNLMNW-；-TPWEGGLFKLRMLFKDDYPSSPPK-； -VYFGTVCLSILEEDKDWRPA-；-QELLNEPNIQDPAQAEAYTIYCQNR-；-AQAKNLRPHKQRPCGIV-；-RVCGLDSLNCPFPYRVSSSVFCIFD-；-LFKLRMLFKDDYPSSPPKCKFEPP-表IV中所示的這些p53UBC序列可以直接用作致免疫肽(如，用于篩選噬菌體抗體顯示文庫或免疫兔子)，或可以與載體大分子(如BSA)連接或可以構(gòu)成融合蛋白質(zhì)的一部分用作免疫原。優(yōu)選的p53UBC多肽包含下列氨基酸序列-RKAWRKDHPFGFVAVPTKNP-；-NIQDPAQAEAYTIYCQNRVEYE-；-GLVWQELVYNIFANLKLLHT-；-GLDSLNCPFPYRVSSSVFCI-；-KLAFILILMSVFQL-；并且可以包含其它間插和/或末端序列；這些多肽一般長度少于1000個氨基酸，更常見的是長度少于約500個氨基酸；通常，間隔肽序列或末端肽序列(如果存在的話)相當(dāng)于天然產(chǎn)生的多肽序列(一般是哺乳動物多肽序列)。優(yōu)選地，這些氨基酸序列從氨基末端到羧基末端方向的順序是(1)-RKAWRKDHPFGFVAVPTKNP-；(2)-NIQDPAQAEAYTIYCQNRVEYE-；(3)-GLVWQELVYNIFANLKLLHT-；(4)-GLDSLNCPFPYRVSSSVFCI-；(5)-KLAFILIIMSVFQL-.
剛剛提及的優(yōu)選的p53UBC多肽的一種用途是作為在合適的動物中產(chǎn)生α-p53UBC抗體的市售免疫原和/或連同本發(fā)明提供的抗-p53UBC抗體一起用作定量ELISA(如競爭性ELISA)或競爭性RIA的市售免疫診斷劑，例如，作為在人或細胞分型或細胞識別中p53UBC表達腫瘤分期或診斷免疫測定的標準校正物。這些免疫學(xué)檢測可以用于檢測其中許多表位暴露于變性p53UBC蛋白質(zhì)或肽片段中(如，蛋白裂解消化后)的變性p53UBC多肽(如SDS-聚丙烯酰胺凝膠Western印跡法)。除了用作免疫原或免疫試劑外，剛剛提到的優(yōu)選的p53UBC多肽還將發(fā)現(xiàn)許多其它用途。一種或多種以上所列序列可以與融合配偶體(如人血清白蛋白、GST等)一起摻入到融合蛋白質(zhì)中。對超過1000個氨基酸的這種融合蛋白質(zhì)來說，如果需要，可以缺失掉融合配偶體(白蛋白)部分以產(chǎn)生約1000個氨基酸或更小的分子大小的序列。
在某些實施方案中，需要采用多價p53UBC抗原，它在共價連接物(通常是肽連接物)中包含至少兩個p53UBC致免疫表位。這種多價p53UBC抗原典型地包含多種源于相同物種(如人或小鼠)的p53UBC抗原肽，但可以包含不同物種p53UBC蛋白質(zhì)的抗原肽的混合物(即，種間p53UBC多價抗原)。通常，多價抗原的一級氨基酸序列中的抗原肽序列的空間順序以與天然產(chǎn)生的p53UBC蛋白質(zhì)相同的方向出現(xiàn)，即，為天然產(chǎn)生的p53UBC蛋白質(zhì)中第二抗原肽序列氨基末端的第一抗原肽序列將是多價抗原中所說第二抗原肽序列的氨基末端。通常，間隔肽序列用于連接多價抗原中的抗原肽序列。這些間隔肽序列可以是預(yù)定的、隨機的或假隨機的序列。間融肽序列可以相應(yīng)于已知對將用多價抗原免疫的動物為非致免疫性的序列，例如，動物已對其有耐受性的序列。盡管可以給出這類多價抗原的許多例子，但下列實例用來說明但不用來限制-TLNMSGIALSRLAQER-(aa1)-GIQELLNEPNIQDPAQAEAYTI-(aa2)-AGMLLTVQSCTWPQLAVWKCT-其中(aa1)和(aa2)是至少一個氨基酸和少于1000個氨基酸的肽間隔；aa1是不依賴于aa2肽序列選擇的肽序列；aa1(它可以由多個不同的氨基酸組成)的長度與aa2(它可以由多個不同的氨基酸組成)的長度無關(guān)。
優(yōu)選的p53UBC多肽免疫原類型是下面所示的253個氨基酸長的多肽序列RGTLNMSGIA LSRLAQERKA WRKDHPFGFV AVPTKNPDGT MNLMNWESAI51 PGKKGTPWEG GLFKLRMLFK DDYPSSPPKC KFEPPLFHPN VYFGTVCLSI101 LEEDKDWRPA ITIKQILLGI QELLNEPNIQ DPAQAEAYTI YCQNRVEYEK151 RVRAQAKNLR PHKQRPCGIV RRKGLVWQEL VYNIFANLKL LHTMTSHLGG201 LGGRHLPLPP RVCGLDSLNC PFPYRVSSSV FCIFDCYVKL AFILILMSVF251 QLL致免疫WBP1或p53UBC多肽可以用于免疫動物以產(chǎn)生抗-WBP1和抗p53UBC抗體和/或用作制備雜交瘤文庫的脾細胞源，所述的雜交瘤文庫用于選擇分泌以1×107M-1或更大(優(yōu)選地是至少1×108M-1到1×109M-1)的親和力結(jié)合到WBP1或p53UBC蛋白質(zhì)上的單克隆抗體的雜交瘤克隆。這些致免疫WBP1或p53UBC肽也可以直接用于篩選噬菌體抗體顯示文庫。
這些抗體的一種用途是篩選用于鑒別包含編碼結(jié)構(gòu)相關(guān)的免疫交叉反應(yīng)性蛋白質(zhì)(為候選新p53相互作用多肽)的cDNA插入物的克隆的cDNA表達文庫(優(yōu)選地是含有各種組織的人或鼠mRNA的cDNA的文庫)。這種篩選cDNA表達文庫的方法是本領(lǐng)域公知的，并且在young et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci(U.S.A.)801194和其它出版物中有進一步的描述。這些抗體的另一種用途是鑒別和/或純化免疫交叉反應(yīng)性蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上或進化上與用于產(chǎn)生抗體的天然WBP1或p53UBC蛋白質(zhì)或相應(yīng)的WBP1或p53UBC片段(如，功能域；p53結(jié)合域)相關(guān)。相信這些抗體會找到作為研究上使用的試劑的商業(yè)用途，正如商業(yè)上出售的其它抗體(如生物學(xué)試劑——如限制性酶和聚合酶)。
這些抗體的各種其它用途是腫瘤或其它細胞增殖病態(tài)的診斷和/或分期，以及治療瘤形成、炎癥、傷口愈合、移植排斥反應(yīng)的治療應(yīng)用(如作為陽離子化的抗體或經(jīng)導(dǎo)向脂質(zhì)體傳遞)和類似用途。所述抗體也可以用于定量分析樣品中WBP1和/或p53UBC蛋白質(zhì)(如經(jīng)ELISA或Western印跡法)以提供與相同樣品中檢測的其它多肽比較的標準值(如，證實轉(zhuǎn)移到Western印跡膜上的聚丙烯酰胺凝膠的各泳道包含WBP1和/或p53UBC的可比較的水平和試驗多太水平的特定的差別)。經(jīng)常使用編碼具有基本上相同于這些優(yōu)選的表位的表位的多核苷酸。這些多核苷酸具有多種用途，包括用作p53UBC探針、用作產(chǎn)生包含p53UBC表位的多肽(這些蛋白質(zhì)因而是p53UBC免疫原或規(guī)范化p53UBC免疫測定的市售診斷試劑)的模板、用作多核苷酸疫苗(免疫原)(當(dāng)融合進分泌序列用于施用于動物和制備α-p53UBC抗血清和雜交瘤時)。這些多核苷酸也可以用作食品、可燃性能源和增加粘度的溶質(zhì)。
WBP1多核苷酸圖1A-1D所示的人WBP1編碼序列和597個氨基酸長的WBP1多肽(見上述)的公開使構(gòu)建直接表達WBP1、其片段或其類似物的分離的多核苷酸成為可能。這些多肽可以包含編碼圖1A-1D的WBP1多肽序列的任何簡并核苷酸序列。此外，圖1A-1D中的序列使構(gòu)建可用于檢測編碼WBP1的RNA和DNA序列的核酸雜交探針和PCR引物成為可能。
編碼全長WBP1或其片段或類似物的多核苷酸可以包括促進編碼序列轉(zhuǎn)錄(表達序列)和翻譯的序列，以便產(chǎn)生編碼的多肽產(chǎn)物。構(gòu)建這些多核苷酸的方法是本領(lǐng)域公知的并且在Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual2nd Ed(1989)，Cold SpringHarbor，N.Y.中有進一步的描述。例如但不限于，這些多核苷酸可以包含啟動子、轉(zhuǎn)錄終止位點(真核生物表達宿主中的多聚腺苷酸化位點)、核糖體結(jié)合位點、可任選的增強子(用于真核生物表達宿主)和可任選的復(fù)制載體所需的序列。典型的真核生物表達盒表括編碼連接在啟動子(如HSVtk啟動子或pgk(磷酸甘油酸激酶)啟動子)下游(即，翻譯閱讀框方向；多核苷酸連接)的WBP1多肽的多核苷酸序列，該序列可任選地連接到增強子上和多腺苷酸化位點(如，SV40大型T Ag poly A添加位點)。
優(yōu)選的WBP1多核苷酸編碼包含表III所示的至少一種氨基酸序列的WBP1多肽。遺傳密碼的簡并性給出編碼這些氨基酸序列的多核苷酸序列的一個有限的組。這組簡并序列可以容易地經(jīng)手工或經(jīng)計算機采用市售軟件(Wisconsin Genetice Software Package Release7.0)產(chǎn)生。因此，提供了典型地長度小于約10,000個核苷酸并且包含編碼以下各氨基酸序列的序列的分離的多核苷酸-ELPHLTSALHPVHPD-； -PQQVQQISSSMDISGTKC--LLDRLRAKGIRNPDHSRALI-；-WAPMRSKKEVQEVSASYNGV-；-EEPSAKRTCPSLSPTSPLNN-；-TPMPYDLQGLDFFPFLSGD--SLVSSNSLRESHSHTVTNR-； -SSTDTASIFGIIPDIISLD-；它們可以用于(除別的用途外)表達能夠用作免疫原、免疫學(xué)試劑等的WBP1多肽。這些多肽典型地包含促進在合適的原核生物或真核生物宿主細胞中表達的可操作連接的啟動子。這種多肽的一個例證是可操作連接到哺乳動物表達載體pSRα上的克隆的圖1A-1D的人WBP1cDNA序列，許多可替換的實施方案對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，這些方案包括使用替換的表達載體(如，pBC12BI和p91023(B)；Hanahan J(1983)J.Mol.Biol.166577；Cullen et al.(1985)J.Virol.53515；Lomedico PT(1982)Proc.Natl.Acad.Sci(U.S.A.)795798；Morinaga et al.(1984)Bio/Technology2636).
此外，當(dāng)多肽的表達不是所需的時，本發(fā)明的多核苷酸不需編碼功能性蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多核苷酸可以用作檢測WBP1RNA或DNA序列的雜交探針和/或PCR引物(擴增引物)和/或LCR寡聚體。
作為選擇，本發(fā)明的多核苷酸可以用作檢測相關(guān)基因的RNA或DNA序列的雜交探針或引物，這些基因可以編碼結(jié)構(gòu)或進化上相關(guān)的蛋白質(zhì)。就這樣的雜交和PCR用途來說，本發(fā)明的多核苷酸不需編碼功能性多肽。因此，只要保持對WBP1序列的特異性雜交或特異性擴增，本發(fā)明的多核苷酸可以含有實質(zhì)性的缺失、添加、核苷酸取代和/或轉(zhuǎn)座。
上文已定義了特異性雜交，特異性雜交可粗略地總結(jié)為在本發(fā)明的多核苷酸(可以包含取代、缺失和/或添加)和特異性靶多核苷酸(如，人WBP1 mRNA)之間形成雜交，以便在從WBP1-表達細胞制備的RNA Northem印跡(即可以建立雜交和洗滌條件，使得可以檢測分散的WBP1mRNA帶)上鑒別相應(yīng)于各WBP1同型的單一帶。因此，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以制備本發(fā)明的多核苷酸(可以包括與圖1A-D所示的序列比較基本上添加、缺失、取代或轉(zhuǎn)座的核苷酸序列)，并且通過采用從表達WBP1mRNA的細胞系制備的RNA進行Northern印跡分析和/或通過雜交到WBP1DNA克隆(cDNA或基因組克隆)上確定特異性雜交是否是所述多核苷酸的性質(zhì)。
特異性擴增被定義為一組PCR擴增引物在與WBP1多核苷酸的PCR反應(yīng)中一起使用時產(chǎn)生基本上單一的相應(yīng)于WBP1基因序列或mRNA序列的主要擴增產(chǎn)物的能力。一般以表達WBP1的人細胞的人基因組DNA或mRNA作為PCR反應(yīng)的模板DNA樣品。表現(xiàn)出特異性擴增的PCR擴增引物適于經(jīng)定量PCR擴增定量測定WBP1mRNA。盡管具有序列和/或長度多態(tài)性，WBP1等位特異性擴增產(chǎn)物為符合這一定義的目的被認為構(gòu)成單一的擴增產(chǎn)物。
一般的雜交探針包含圖1A-1D所示序列的約至少25個毗鄰連續(xù)核苷酸(分別用于人WBP1檢測)，優(yōu)選的雜交探針包含圖1A-1D所示序列的至少50個連續(xù)的核苷酸，更優(yōu)選的包含圖1A-1D所示序列的至少100個連續(xù)的核苷酸。PCR擴增引物典型地包含圖1A-1D所示序列的約25到50個連續(xù)的核苷酸，通?；旧嫌蓤D1A-1D所示序列的約25到50個連續(xù)的核苷酸以及另外的核苷酸(如果存在的話，一般在5′末端，以便不影響聚合酶介導(dǎo)的鏈延伸)組成。PCR擴增引物設(shè)計和雜交探針選擇完全在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員操作者可以斟酌決定的范圍內(nèi)。
p53UBC多核苷酸圖2所示的人p53UBC編碼序列和253個氨基酸長的p53UBC多肽(見上述)的公開使構(gòu)建指導(dǎo)表達p53UBC、其片段或其類似物的分離的多核苷酸成為可能。此外，圖1A-1D中的序列使構(gòu)建可用于檢測編碼p53UBC的RNA和DNA序列的核酸雜交探針和PCR引物成為可能。
編碼全長p53UBC或其片段或類似物的多核苷酸可以包括促進編碼序列轉(zhuǎn)錄(表達序列)和翻譯的序列，以便產(chǎn)生編碼的多肽產(chǎn)物。構(gòu)建這些多核苷酸的方法是本領(lǐng)域公知的并且在Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd Ed(1989)，Cold SpringHarbor，N.Y.中有描述。例如但不限于，這些多核苷酸可以包含啟動子、轉(zhuǎn)錄終止位點(真核生物表達宿主中的多聚腺苷酸化位點)、核糖體結(jié)合位點、可任選的增強子(用于真核生物表達宿主)和可任選的復(fù)制載體所需的序列。典型的真核生物表達盒表括編碼連接在啟動子(如HSVtky啟動子pgk(磷酸甘油酸激酶)啟動子)下游即、翻譯閱讀框方向，多核苷酸連接物)的p53UBC多肽的多核苷酸序列，該序列可任選連接到增強子上和多腺苷酸化位點下游(如，SV40大型T Ag poly A添加位點)。
優(yōu)選的p53UBC多核苷酸編碼包含表IV所示的至少一種氨基酸序列的p53UBC多肽。遺傳密碼的簡并性給出編碼這些氨基酸序列的多核苷酸序列的一個有限的組。這組簡并序列可以容易地經(jīng)手工或經(jīng)計算機采用市售軟件(Wisconsin Genetics Software Package Re-lease 7.0)產(chǎn)生。因此，提供了典型地長度小于約10,000個核苷酸并且包含編碼以下各氨基酸序列的序列的分離的多核苷酸被-RKAWRKDHPFGFVAVPTKNP-；-NIQDPAQAEAYTIYCQNRVEYE-；-GLVWQELVYNIFANLKLLHT-；-GLDSLNCPFPYRVSSSVFCI-；-KLAFILILMSVFQL-；它們可以用于(除別的用途外)表達能夠用作免疫原、免疫學(xué)試劑等的p53UBC多肽。這些多肽典型地包含促進在合適的原核生物或真核生物宿主細胞中表達的可操作連接的啟動子。這種多肽的一個例證是可操作連接到哺乳動物表達載體pSRα上的克隆的圖2的人p53UBCcDNA序列，許多可替換的實施方案對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，這些方案包括使用替換的表達載體(如.，pBC12BI和.p91023(B)；Hanahan J(1983)J.Mol.Biol.166577；Cullen et al.(1985)J.Virol.53515；Lomedico PT(1982)Proc.Natl.Acad.Sci(U.S.A.)795798；Morinaga et al.(1984)Bio/Technology2636).
此外，當(dāng)多肽的表達不是所需的時，本發(fā)明的多核苷酸不需編碼功能性蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多核苷酸可以用作檢測p53UBCRNA或DNA序列的雜交探針和/或PCR引物(擴增引物)和/或LCR寡聚體。
作為選擇，本發(fā)明的多核苷酸可以用作檢測相關(guān)基因的RNA或DNA序列的雜交探針或引物，這些基因可以編碼結(jié)構(gòu)或進化上相關(guān)的蛋白質(zhì)。就這樣的雜交和PCR用途來說，本發(fā)明的多核苷酸不需編碼功能性多肽。因此，只要保持對p53UBC序列的特異性雜交或特異性擴增，本發(fā)明的多核苷酸可以含有實質(zhì)性的缺失、添加、核苷酸取代和/或轉(zhuǎn)座。
上文已定義了特異性雜交，特異性雜交可粗略地總結(jié)為在本發(fā)明的多核苷酸(可以包含取代、缺失和/或添加)和特異性靶多核苷酸(如，人p53UBCmRNA)之間形成雜交，以便在從p53UBC-表達細胞制備的RNA Nrothem印跡(即可以建立雜交和洗滌條件，使得可以檢測分散的p53UBCmRNA帶)上鑒別相應(yīng)于各p53UBC同型的單一帶。因此，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以制備本發(fā)明的多核苷酸(可以包括與圖1A-1D所示的序列比較基本上添加、缺失、取代或轉(zhuǎn)座的多核苷酸)，并且通過采用從表達p53UBCmRNA的細胞系制備的RNA進行Northern印跡分析和/或通過雜交到p53UBCDNA克隆(cDNA或基因組克隆)上確定特異性雜交是否是所述多核苷酸的性質(zhì)。
特異性擴增被定義為一組PCR擴增引物在與p53UBC多核苷酸的PCR反應(yīng)中一起使用時產(chǎn)生基本上單一的相應(yīng)于p53UBC基因序列或mRNA序列的主要擴增產(chǎn)物的能力。一般以表達p53UBC的人細胞的人基因組DNA或mRNA作為PCR反應(yīng)的模板DNA樣品。表現(xiàn)出特異性擴增的PCR擴增引物適于經(jīng)定量PCR擴增定量測定p53UBCmRNA。盡管具有序列和/或長度多態(tài)性，p53UBC等位特異性擴增產(chǎn)物為符合這一定義的目的被認為構(gòu)成單一的擴增產(chǎn)物。
一般的雜交探針包含圖2所示序列的約至少25個連續(xù)核苷酸(分別用于人p53相互作用多肽檢測)，優(yōu)選的雜交探針包含圖2所示序列的至少50個連續(xù)的核苷酸，更優(yōu)選的包含圖2所示序列的至少100個連續(xù)的核苷酸。PCR擴增引物典型地包含圖2所示序列的約25到50個連續(xù)的核苷酸，通常基本上由圖2所示序列的約25到50個連續(xù)的核苷酸以及另外的核苷酸(如果存在的話，一般在5′末端，以便不影響聚合酶介導(dǎo)的鏈延伸)組成。PCR擴增引物設(shè)計和雜交探針選擇完全在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員操作者可以斟酌決定的范圍內(nèi)。
WBP1和p53UBC多核苷酸具有許多用途，包括但不限于將它們用作粘度增強溶質(zhì)(典型地是將25-100,000個核苷酸或更多核苷酸的WBP1和p53UBC多核苷酸溶解在含水溶劑(如PBS)中，以產(chǎn)生具有基本粘度的溶液，或者作為載體多核苷酸以共沉淀溶液中以低半度存在的其它多核苷酸種類)、將它們用作營養(yǎng)性食品、將它們用作可燃性能源和本文描述的或操作者顯而易見的它們的其它用途。
涉及遺傳病的方法在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，特異性鑒別WBP1或p53UBC基因的雜交探針可用于診斷遺傳病的方法中。例如但不限于，如此診斷的遺傳病可以涉及與WBP1或p53UBC結(jié)構(gòu)或調(diào)節(jié)序列相關(guān)的損害，或者可以涉及與WBP1或p53UBC基因座緊密連接的遺傳基因座中的損害，所述的遺傳基因座可以由在連接的WBP1或p53UBC基因座上的限制片段長度多態(tài)性或DNA序列多態(tài)性識別，在進一步優(yōu)選的實施方案中，WBP1或p53UBC基因探針可用于診斷或鑒別涉及易感染免疫學(xué)疾病的遺傳病，其中，內(nèi)源WBP1或p53UBC的數(shù)量或功能足以使個體表現(xiàn)出增加發(fā)生疾病(特別是細胞增殖疾病(如，瘤形成、衰老、傷口愈合)、關(guān)節(jié)炎或自身免疫疾病)的可能性。
反義多核苷酸另外的涉及調(diào)節(jié)p53功能活性的實施方案包括使用與圖1A-1D或圖2所示序列的全部或部分互補的特異性反義多核苷酸。只要特異性雜交到相應(yīng)于圖1A-1D或圖2的相關(guān)靶序列作為多核苷酸的一種功能性質(zhì)被保持，這些互補反義多核苷酸就可以包括核苷酸取代、添加、缺失或轉(zhuǎn)座。互補反義多核苷酸包括可溶性反義RNA或DNA寡核苷酸，該寡核苷酸可以特異性地雜交到WBP1或p53UBCmRNA物種上，并且阻止mRNA物種的轉(zhuǎn)錄和/或編碼的多肽的翻譯(Ching et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86…………………………………10006；Broder et al.(1990)Ann.Int.Med.113604；Loreau et al.(1990)FEBS Letters27453；Holcenberg et al.，WO91/11535；U.S.S.N.07/530，165；WO91/09865；WO91/04753；WO90/13641；andEp 386563，本文引用以上各文獻以供參考。因此，反義多核苷酸抑制WBP1或p53UBC多肽的產(chǎn)生。因為WBP1或p53UBC蛋白質(zhì)的表達與p53結(jié)合和功能有關(guān)，所以阻止相應(yīng)于WBP1或p53UBC多肽的mRNA的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的反義多核苷酸可以調(diào)節(jié)p53功能和/或逆轉(zhuǎn)P53細胞表型/含有治療有效劑量的WBP1或p53UBC反義多核苷酸的組合物(如果需要)可以使用來冶療疾病(包括瘤形成、增生、傷口愈合、炎癥)和使用來抑制移植排斥反應(yīng)和類似用途，盡管這些反義多核苷酸典型地包含基本上相同于天然產(chǎn)生的WBP1或p53UBC多核苷酸序列并且典型地相同于圖1A-1D或2所示序列的約至少25個連續(xù)核苷酸序列，但可以產(chǎn)生各種長度的反義多核苷酸。
反義多核苷酸可以從轉(zhuǎn)染細胞或轉(zhuǎn)基因細胞(如，用于重構(gòu)個體造血細胞群全部或部分的轉(zhuǎn)基因多潛能造血干細胞)中的異源表達盒產(chǎn)生。作為選擇，反義多核苷酸可以包含用于體外培養(yǎng)基中或者體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)或組織液外環(huán)境的可溶性寡核苷酸。存在于外環(huán)境中的可溶性反義多核苷酸已顯示出接近胞質(zhì)并抑制特異性mRNA種類的翻譯。在某些實施方案中，所述反義多核苷酸包含用基磷酸酯部分。有關(guān)反義多核苷酸的一般方法可參見Antisense RNA andDNA，(1988)，D.A.Melton，Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。所述反義多核苷酸可以包含磷酸二硫醇酯DNA(Marshall WS and Caruthers MH(1993)Science2591564)，peptide nucleic acids(Egholm et al.(1992)J.Am.Chem.Soc.1141895；Hanvey et al.(1992)Science2581481)和其它本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知或顯而易見的模擬多核苷酸的化學(xué)構(gòu)建體。
關(guān)聯(lián)人WBPI和p53UBC基因的分離用分別包含圖1A-1D或圖2所示cDNA序列的約至少24個連續(xù)核苷酸(或它們的互補序列)的序列的多核苷酸探針，經(jīng)篩選人基因組克隆文庫(如酵母人工染色體、粘?；蛉胧删w(如，λCharon 35)中的人基因組文庫)來鑒別和分離WBPI和p53UBCcD-NA序列的人類同源物。通常按照常規(guī)雜交方法在高度嚴格的條件下進行雜交和洗滌步驟。分離陽性克隆并測序。用于說明但不用于限制的例子是，可以標記相應(yīng)于圖1A-1D或圖2的序列的全長多核苷酸，并用作從在入EMBL4或入GEM11(Promega Corporation，Madison，Wisconsin)中的人或鼠基因組克隆文庫分離基因組克隆的雜交探針。篩選噬斑轉(zhuǎn)移物(Benton and Davis(1978)Science196180)的典型雜交條件可以是50％甲酰胺、5×SSC或SSPE、1-5×Derhardt’s溶液、0.1-1％SDS、100-200μg剪切異源DNA或tR-NA、0-10％葡聚糖硫酸酯、1×105到1×107cpm/ml具有約1×108cpm/μg比活的變性探針，在42℃下培養(yǎng)大約6-36小時。除了不包括探針和培養(yǎng)時間典型地降低外，預(yù)雜交條件基本相同。洗滌條件典型地是1-3×SSC、0.1-1％SDS，50-70℃下約5-30分鐘改變洗滌溶液。
非人WBP1或p53UBCcDNA和基因組克隆(即，相關(guān)非人WBPI或p53UBC基因)可以用基于圖1所示序列的探針類似地從本領(lǐng)域可獲得的(如，Clortech，Palo Alto，CA)各種非人cDNA和基因組克隆文庫分離。其雜交條件和洗滌條件一般不如分離人WBP1或p53UBC嚴格。
包含約至少30-50個核苷酸，優(yōu)選至少100個核苷酸的多核苷酸(相應(yīng)于或互補于圖1A-1D或圖2所示核苷酸序列)可以分別用作鑒別和分離相應(yīng)于WBP1或p53UBC的種系基因的PCR引物和/或雜交探針。這些種系基因可以是人的或者可以來源于/相關(guān)哺乳動物種類(優(yōu)選地是嚙齒動物或靈長類)。這些種系基因可以由本領(lǐng)域各種常規(guī)方法分離，所述方法包括但不限于雜交篩選λ噬菌體中基因組文庫或粘粒文庫，或采用得自圖1A-1D或圖2所示序列的引物的基因組序列PCR擴增。人基因組文庫是公眾可獲得的或者可以從人DNA重新構(gòu)建。
WBP1或p53UBC基因組克隆(特別是鼠相關(guān)WBP1或p53UBC基因)可以用于構(gòu)建產(chǎn)生細胞和轉(zhuǎn)基因非人動物(具有至少一種功能損害的WBP1或p53UBC等位基因，優(yōu)選純合的失去效能的WBP1或p53UBC等位基因)的同源靶構(gòu)建體。構(gòu)建同源靶構(gòu)建體的指導(dǎo)性文獻可在本領(lǐng)域找到，這些文獻包括Rahemtulla et al.(1991)Na-ture353180；Jasin et al.(1990)Genes Devel.4157；Koh et al.(1992)Science2561210；Molina et al.(1992)Nature357161；Grus-by et al.(1991)Science2531417；Bradley et al.(1992)Bio/Tech-nology10534，本文引用這些文獻作為參考。同源靶可用于產(chǎn)生所謂的“失去效能”小鼠，它是失活的WBP1或p53UBC等位基因雜合的或純合的。這類小鼠可以作為研究細胞程序死亡、瘤形成、細胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物篩選和其它用途的試驗動物在市場上出售。
嵌合靶小鼠可以按Hogan，et al.，Manipulating the Mouse EmbryoA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)和Teratocarcinomasand Embryonic Stem CellsA Practical Approach，E.J.Robertson，ed.，IRL Press，Washington，D.C.，(1987)(本文引用以供參考)中的方法得到。按照公開的方法(Teratocarcinomas and EmbryonicStem CellsA Practical Approach，E.J.Robertson，ed.，IRL Press，)Washington，D.C.(1987)；Zjilstra et al.(1989)Nature 342435；和Schwartzberg et al.(1989)Science 246799，本文引用各文獻以供參考)操作胚胎干細胞。
此外，WBP1或p53UBC或基因組基因拷貝可以用于構(gòu)建以高水平和/或在鄰近WBP1或p53UBC基因的非天然產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄控制序列的轉(zhuǎn)錄控制下表達WBP1或p53UBC多肽的轉(zhuǎn)基因。不用來限制的例子是，組成型啟動子(如，HSV-tk或pgk啟動子)或細胞譜系特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(如CD4或CD8基因啟動子/增強子)可有效連接到WBP1或p53UBC一編碼多核苷酸序列上，以形成轉(zhuǎn)其因(典型地是與可選擇的標記(如neo基因表達盒)結(jié)合)。可將這些轉(zhuǎn)基因引入到細胞(如，ES細胞，造血干細胞、培養(yǎng)的原代肝細胞)中，并且可以按常規(guī)方法獲得轉(zhuǎn)基因細胞和轉(zhuǎn)基因非人動物。轉(zhuǎn)基因細胞和/或轉(zhuǎn)基因非人動物可以用于篩選抗瘤形成劑和/或篩選有潛力的細胞增殖調(diào)節(jié)劑，因為WBP1或p53UBC的過度表達或WBP1或p53UBC的不適當(dāng)表達可以引起超增殖狀態(tài)或低增殖狀態(tài)。
結(jié)合WBP1或p53UBC的蛋白質(zhì)的鑒別結(jié)合WBP1或p53UBC的蛋白質(zhì)是潛在的重要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可以是新治療劑的靶向物。這些蛋白質(zhì)本文稱作輔助蛋白質(zhì)。為本發(fā)明的目的，盡管在酵母二雜交系統(tǒng)中p53多肽序列結(jié)合WBP1或p53UBC多肽，但p53不被認為是WBP1或p53UBC的輔助蛋白質(zhì)。輔助蛋白質(zhì)可以用本領(lǐng)域各種公知的方法分離。
分離輔助蛋白質(zhì)的一種優(yōu)選的方法是使WBP1或p53UBC多肽與結(jié)合WBP1或p53UBC多肽的抗體接觸，分離形成的免疫復(fù)合物。這些免疫復(fù)合物可以含有結(jié)合到WBP1或p53UBC多肽上的輔助蛋白質(zhì)?？梢杂米冃詣?優(yōu)選地是還原劑)使免疫復(fù)合物變形來鑒別和分離所述的輔助蛋白質(zhì)?？蓪⒆冃缘?優(yōu)選地是還原的)蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠上電泳?？梢杂酶鞣N已知方法(如，Coomassie染色法、Western印跡法、銀染法等)中的一種或多種在聚丙烯酰胺凝膠上鑒別推斷的輔助蛋白質(zhì)，經(jīng)切割含有相關(guān)的鑒別出的多肽的聚丙烯酰胺的部分，并且從凝膠部分上洗脫所述的多肽來分離。
通過證明蛋白質(zhì)結(jié)合到WBP1或p53UBC蛋白質(zhì)上可以將推斷的輔助蛋白質(zhì)作為輔助蛋白質(zhì)鑒別出來。這些結(jié)合可以經(jīng)各種方法在體外證明，所述方法包括但不限于，采用推定的輔助蛋白質(zhì)(已變性接著經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳方法分離)的結(jié)合試驗。作為選擇，也可以使用采用重組或化學(xué)合成的推定的輔助蛋白質(zhì)的結(jié)合試驗。例如，可以分離推定的輔助蛋白質(zhì)，并用化學(xué)測序法(如Edman降解法)確定其全部或部分氨基酸序列。所述氨基酸序列信息可以用于化學(xué)合成推定的輔助蛋白質(zhì)。所述的氨基酸序列也可以用于按以下方法產(chǎn)生重組推定的輔助蛋白質(zhì)(1)按氨基酸序列信息用簡并寡核酸探針篩選cDNA文庫來分離偏碼推定的輔助蛋白質(zhì)的cDNA克隆，(2)在宿主細胞中表達cDNA，和(3)分離推定的輔助蛋白質(zhì)。作為選擇，可以用寡核苷酸合成、置入表達載體中和在宿主細胞中表達來構(gòu)建編碼WBP1或p53UBC多肽的多核苷酸。
體外結(jié)合WBP1和/或p53UBC的推定的輔助蛋白質(zhì)作為輔助蛋白質(zhì)被識別。輔助蛋白質(zhì)也可以用雙功能交聯(lián)劑(如dimethyl-suberimidate，戊二醛等)經(jīng)體外交聯(lián)識別，并且接著分離色含WBP1或p53UBC多肽的交聯(lián)產(chǎn)物。有關(guān)交聯(lián)的一般性討論可參見kunkelet al.(1981)Mol.Cell.Biochem.343(本文引用該文獻作為參考)。優(yōu)選地是，雙功能交聯(lián)劑在分離交聯(lián)復(fù)合物后在特定的條件下產(chǎn)生可以逆轉(zhuǎn)的交聯(lián)，以利于從WBP1或p53UBC多肽分離輔助蛋白質(zhì)。包含WBP1或p53UBC多肽的交聯(lián)復(fù)合物的分離優(yōu)選用將以至少1×107M-1的親和力結(jié)合到WBP1或p53UBC多肽上的抗體結(jié)合到交聯(lián)復(fù)合物群上的方法進行，并僅回收以至少1×107M-1的親和力結(jié)合到抗體上的那些復(fù)合物。交聯(lián)到WBP1或p53UBC多肽上的多肽作為輔助蛋白質(zhì)被識別。
可以進行篩選試驗以識別候選免疫調(diào)節(jié)劑(作為在合適的結(jié)合條件下抑制WBP1或p53UBC結(jié)合到輔助蛋白質(zhì)上的試劑)WBP1或p53UBC多肽的表達可以從各種不同的多核苷酸(基因組或cDNA、RNA、合成寡核苷酸等)及各種不同的技術(shù)形成能夠最終表達所需WBP1或p53UBC多肽的本發(fā)明的核酸序列。
如前所述，在DNA序列已經(jīng)有效連接到(即，置入以保證其起作用)表達控制序列后可以在宿主中表達所述序列。這些表達載體在宿主生物體中作為游離基因或作為宿主染色體的整合部分是典型地可復(fù)制的。通常，表達載體含有選擇標記(如，四環(huán)素抗性或潮霉素抗性)，以便檢測和/或選擇那些用所需DNA序列轉(zhuǎn)化的細胞(參見，例如U5專利4,704,362，本文引用以供參考)。
大腸桿菌是克隆本發(fā)明的DNA序列特別有用的一種原核生物宿主。適用的其它微生物宿主包括芽孢桿菌屬(如枯草芽孢桿菌)和其它腸桿菌科(如沙門氏菌、沙雷氏菌和各種假單胞菌的種)。在這些原核生物宿主中，人們也可以制備表達載體，它典型地含有與宿主細胞相容的表達控制序列(如復(fù)制源)。此外，可以存在任何數(shù)量的各種公知的啟動子，如乳糖啟動子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、β-內(nèi)酰胺酶啟動子系統(tǒng)或得自入噬菌體的啟動子系統(tǒng)。所述啟動子典型地任選與一種操縱子序列控制表達，并具有啟動和完成轉(zhuǎn)錄和翻譯的核糖體結(jié)合位點序列和類似序列。
其它微生物(例如酵母)也可以用于表達。糖酵母是一種包含3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的優(yōu)選的宿主，帶有具有表達控制序列(例如啟動子)的合適載體、復(fù)制起點、所需的終止序列和類似序列。
除了微生物以外，哺乳動物組織細胞培養(yǎng)物也可用于表達和產(chǎn)生本發(fā)明的多肽(參見，Winnacker，“From Genes to Clones，”VCHPublishers，N.Y.，N.Y.(1987)，本文引用作為參考)。真核細胞是實際上優(yōu)選的，因為本領(lǐng)域已培育了大量能分泌完整的人蛋白質(zhì)的合適的宿主細胞系，包括CHO細胞系、各種COS細胞系、Hela細胞、骨髓瘤細胞系、Jurkat細胞等。這些細胞的表達載體可以包括表達控制序列(例如復(fù)制起點、啟動子、增強子(Queen et al，(1986)Immunol，Rev.8949，本文引用以供參考)，和必需的加工信息位點(如，核糖體結(jié)合位點、RNA剪接位點、多聚腺甘酸化位點和轉(zhuǎn)錄終止子序列)。優(yōu)選的表達控制序列是來源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒等的啟動子。含有目標物DNA片段(如，編碼WBP1或p53UBC多肽的多核苷酸)的載體可以用公知的方法(依細胞宿主的類型變化)轉(zhuǎn)移到宿主細胞中。例如，Cacl2轉(zhuǎn)染通常用于原核細胞、而CA3(PO4)2處理或電穿孔也可以用于其它細胞宿主(一般可參見Mariatis，et sl.，Molecular CloningA Laboratory Manu-al，Cold Spring Harbor Press，(1982)，本文引用作為參考)。通常，載體是游離基因且保留在染色體外。
重組WBP1或p53UBC蛋白質(zhì)在細胞中的表達可以用于鑒別和分離基因，所述基因波WBP1或p53UBC蛋白質(zhì)的存在直接或經(jīng)過與p53的相互作用正向或反向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。這些基因作為從減小的cDNA文庫分離的cDNA克隆典型地被起始識別，其中從表達重組WBP1或p53UBC的細胞分離的RNA和從對照細胞(即，不表達重組WBP1或p53UBC的細胞)分離的RNA用于產(chǎn)生減小的文庫和篩選探針。以這種方式可分離WBP1或p53UBC依賴性基因。WBP1或p53UBC依賴性基因(或它們的有效連接到報導(dǎo)基因上和調(diào)節(jié)序列)可以用作體外轉(zhuǎn)錄試驗的組成部分。
法醫(yī)鑒別方法本發(fā)明的WBP1或p53UBC多核苷酸序列可以用于單個人的法醫(yī)鑒別，如用于鑒別decedents、確定親權(quán)、獨罪鑒別等。非限制性的例子是，可以從人或從細胞樣品(如，從犯罪現(xiàn)場證據(jù)如血、唾液、精液等)獲得DNA樣品，并進行RFLP分析、等位基因特異性PCR或擴增產(chǎn)物的PCR克隆和測序，以確定WBP1或p53UBC基因區(qū)的結(jié)構(gòu)?；赪BP1或p53UBC基因結(jié)構(gòu)，參照他的/她的WBP1或p53UBC基因型，將鑒別出取得樣品的個體。WBP1或p53UBC基因型可單獨或與其它遺傳標記結(jié)合使用，以結(jié)論性地鑒別個體或得出個體是可純的罪犯的結(jié)論。
在一個實施方案中，將從人群(典型地不同種族來源的至少50人)獲得的人基因組DNA樣品分別等分到反應(yīng)容器(如微滴板上的孔)中。各個等分樣在合適的反應(yīng)條件(如，參見New England Bio-labs of ProMega 1993 catalogs)下用一種或多種限制酶(如，EcokI、HindIII、SmaI、BamhI、SalI、NotI、AccI、ApaI、BglII、XbaI、PstI)消化。各個體相應(yīng)的消化產(chǎn)物分別裝到電脈凝膠(典型地是瓊脂糖)上，經(jīng)電泳，用Southern印跡法印跡到膜上，并用標記的WBP1或p53UBC探針(如圖1A-1D或圖2的序列)雜交。在群體成員中具有多態(tài)性的限制片段(帶)用作區(qū)別WBP1或p53UBC基因型的基礎(chǔ)，并且依據(jù)其WBP1或p53UBC基因型從而對個體分類。
可以通過測序人群PCR擴增產(chǎn)物并用序列多態(tài)性鑒別等位基因(基因型)來進行WBP1或p53UBC基因型的類似分類，從而鑒別或分類個體。
酵母二雜交篩選試驗酵母二雜交系統(tǒng)可以用于篩選哺乳動物(典型地是人)cDNA表達文庫，其中cDNA融合進GAL4 DNA結(jié)合域或激活域，WBP1或p53UBC多肽序列分別融合進GAL4激化域或DNA結(jié)合域。這種酵母二雜交系統(tǒng)可以篩選編碼結(jié)合WBP1或p53UBC序列的蛋白質(zhì)的cDNA。例如，可以從人細胞系或其它合適的細胞類型的mRNA產(chǎn)生cDNA文庫。在酵母二雜交表達系統(tǒng)中克隆的這種cDNA文庫(Chien et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)889578；Zer-vos et al.(1993)Cell72233)可用于識別編碼與WBP1或p53UBC相互作用的蛋白質(zhì)且從而引起GAL4-依賴性報導(dǎo)基因表達的cD-NA。也可以通過WBP1或p53UBC與抗體的免疫沉淀和共沉淀種類的鑒別來鑒別與WBP1或p53UBC相互作用的多肽。此外，可以用WBP1或p53UBC多肽篩選肽文庫(如，噬菌體肽顯示文庫、空間限定的VLSIPS肽排列等)來鑒別結(jié)合WBP1或p53UBC的多肽。
合理的藥物設(shè)計的方法WBP1或p53UBC多肽(特別是在p53復(fù)合物中形成直接接觸的那些部分)可以用于候選p53-調(diào)節(jié)劑(如，抗瘤形成和p53調(diào)節(jié)劑)的合理的藥物設(shè)計?；旧霞兓腤BP1或p53UBC蛋白質(zhì)和作為本文提供的WBP1和p53UBC的對接配偶體的p53的鑒別允許產(chǎn)生基本上純的WBP1p53和p53UBCp53多肽復(fù)合物和計算機模型，該模型可用于蛋白質(zhì)X-光晶體學(xué)或其它結(jié)構(gòu)分析方法，例如DOCK程序(Kuntz et al(1982)J.Mol.Biol.161269；Kuntz ID(1992)Science 2571078)和其改變的程序?；谟纱颂峁┑慕Y(jié)構(gòu)信息，可以合理地設(shè)計潛在的治療藥物。在一個實施方案中，這種藥物被設(shè)計來阻止形成WBP1p53或p53UBCp53多肽復(fù)合物。因此，本發(fā)明可以用來設(shè)計藥物，包括具有抑制WBP1或p53UBC結(jié)合到p53上的能力的藥物。
鑒別新p53-調(diào)節(jié)劑的方法本發(fā)明的基礎(chǔ)之一是以實驗發(fā)現(xiàn)了WBP1和p53UBC多肽特異性地結(jié)合到p53上，p53是一種已知在細胞中調(diào)節(jié)細胞增殖的蛋白質(zhì)，并且已知它被病毒編碼的致癌基因蛋白質(zhì)結(jié)合(螯合)。例如，阻斷p53功能和或阻斷WBP1或p53UBC功能的試劑可能開發(fā)成潛在的人治療藥物。
然后在試驗(通常用于預(yù)測用作人抗瘤形成藥劑適合性)中進一步試驗候選藥劑的抗瘤形成活性或細胞增殖增強活性。這些試驗的例子包括但不限于(1)候選藥劑抑制非貼壁的轉(zhuǎn)化細胞在軟瓊脂上生長能力的能力，(2)降低移植進nu/nu小鼠的轉(zhuǎn)化細胞的致瘤性的能力，(3)逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化細胞形態(tài)轉(zhuǎn)化的能力，(4)減慢nu/nu鼠中移植腫瘤生長的能力，(5)在自發(fā)或化學(xué)誘導(dǎo)癌形成動物模型中抑制腫瘤或前瘤形成細胞形成的能力。和(6)在使用藥劑的轉(zhuǎn)化細胞中誘導(dǎo)更多的分化表型的能力。
WBP1p53和p53UBCp53分子內(nèi)結(jié)合本發(fā)明的基礎(chǔ)之一是驚奇地發(fā)現(xiàn)，在生理條件下，WBP1和p53UBC蛋白質(zhì)序列與p53蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。這一發(fā)現(xiàn)表明，WBP1和p53UBC蛋白質(zhì)用作p53功能調(diào)節(jié)劑，反之亦然。這種功能調(diào)節(jié)可仍用于偶聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道(經(jīng)WBP1或p53UBC)到細胞增殖調(diào)節(jié)蛋白(即p53)上。
檢測試劑抑制WBP1或p53UBC結(jié)合到p53上的能力的試驗使得容易全面地篩選試劑庫(如，化合物文庫、肽文庫等)，以鑒別WBP1或p53UBC(或p53)拮抗劑或刺激物。這些WBP1或p53UBC(或p53)拮抗劑和刺激物可以調(diào)節(jié)WBP1或p53UBC(或p53)活性，從而調(diào)節(jié)細胞增殖和瘤形成。
給病人施用有效劑量的能夠特異性抑制WBP1p53或p53UBCp53復(fù)合物形成或p53p53復(fù)合物形成的試劑可以用作處理病理狀態(tài)(如，癌、炎癥、增殖性疾病、自體免疫病等)的治療或預(yù)防方法，所述病態(tài)經(jīng)調(diào)節(jié)WBP1和/或p53UBC和/或p53活性和細胞增殖可有效地得到治療。
結(jié)合試驗一般采用兩種形式之一固定化的p53相互作用多肽可用于結(jié)合標記的p53多肽，或相反，固定化的p53多肽可以用于結(jié)合標記的WBP1或p53UBC多肽。作為選擇可以進行結(jié)合試驗檢測WBP1或p53UBC多肽形成同源二聚體的結(jié)合。典型地，使標記的WBP1或p53UBC多肽在含水結(jié)合條件下與固定化的p53多肽結(jié)觸，通過測定固定化的標記的p53的量確定結(jié)合的程度。在每一種情況下，在允許多肽在不加試劑的情況下特異性結(jié)合形成p53p53相互作用多肽復(fù)合物的含水條件下使標記多肽與固定化多肽接觸。特定的含水條件可以由操作者按照常規(guī)方法選擇。作為一般性的指導(dǎo)，下列緩沖含水條件可以使用10-250mM Nacl、5-50mM TrisHCL、PH5-8，可任選二價陽離子和/或金屬螯合劑和/或非離子去垢劑和/或膜組分。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，可以對這些基本條件進行增加、減少、修改(如PH)和替代(如KCL替代Nacl或緩沖液替代)。只要在對照反應(yīng)中發(fā)生WBP1或p53UBC多肽與p53多肽的特異性結(jié)合，就可以對基本的結(jié)合反應(yīng)條件進行修改。在某些檢測同源二聚體形成的試驗的實施方案中，可以對基本結(jié)合反應(yīng)條件進行修改，只要在對照反應(yīng)中發(fā)生WBP1、p53UBC或p53多肽形成同源二聚體的特異性結(jié)合。在對照反應(yīng)(不包含試劑)中不允許特異性結(jié)合的條件不適用于結(jié)合試驗。
優(yōu)選地，至少一種多肽種類是用可檢測的標記物標記的。合適的標記方法包括組不限于，經(jīng)摻入放射性標記的氨基酸(如14C-標記的亮氨酸、3H-標記的甘氨酸、35S標記的甲硫氨酸)的放射性標記法經(jīng)用125I或181I的翻譯后放射性碘化(如，Bolton-Hunter反應(yīng)和氯胺T)的放射性標記法、經(jīng)用32P(如，磷酸化酶和無機放射性標記的磷酸鹽)的翻譯后磷酸化的標記法、經(jīng)摻入熒光標記(如，熒光素或羅丹明)的熒光標記法、或經(jīng)本領(lǐng)域公知的其它常規(guī)方法的標記法。在實施方案中，多肽物質(zhì)之一經(jīng)連接到底物上被固定，其它多肽一般用可檢測的標記來標記。
此外，在某些實施方案中，WBP1、p53UBC或p53多肽可以與輔助蛋白質(zhì)(如，一種與多肽在體內(nèi)形成復(fù)合物的蛋白質(zhì))結(jié)合使用，優(yōu)選地是不同的標記用于各種肽種類，以便可以辨別單個和/或異源二聚體和/或多聚體復(fù)合物的結(jié)合。作為舉例但不作為限制的例子是，WBP1或p53UBC多肽可以用熒光素標記，輔助多肽可以用熒光標記(具有不同的激發(fā)波長或發(fā)射波長或兩者都不同的熒光)標記。作為選擇，可以使用雙標記閃爍計數(shù)，其中WBP1和p53UBC多肽用一種同位素(如3H)標記，第二種肽物質(zhì)用不同的同位素(如14C)標記，所述同位素可以用判別技術(shù)經(jīng)閃爍計數(shù)辨別。
使標記的多肽在本文所述的含水條件下與固定化的多肽結(jié)觸?？梢愿淖兘Y(jié)合反應(yīng)溫育的時間和溫度，只要所選擇的條件使得特異性結(jié)合在不存在試劑的對照反應(yīng)中發(fā)生。優(yōu)選的實施方案采用了約至少15℃(更優(yōu)選地是35-42℃)的反應(yīng)溫度和約至少15秒鐘的溫育時間(盡管較長的溫育期限是優(yōu)選的，以便在某些實施方案中達到結(jié)合平衡)。結(jié)合的p53p53相互作用多肽復(fù)合物的動力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定性決定時間、溫度、鹽、PH和其它反應(yīng)條件可變化的范圍。然而，對任何特定的實施方案而言，所需的結(jié)合反應(yīng)條件可以由操作者用本領(lǐng)域常規(guī)的方法容易地判斷，所說方法可以包括使用Scatchard分析、Hill分析和其它方法(Proteins，Structures andMolecular Principles，(1984)Creighton(ed.)，W.H.Freeman andCompany，New York)的結(jié)合分析。
標記WBP1或p53UBC多肽與固定化p53多肽的特異性結(jié)合分別由包含的非標記競爭蛋白質(zhì)(如白蛋白)測定。在結(jié)合反應(yīng)完成后，檢測特異性結(jié)合到固定化多肽上的標記多肽。非限制性的例子是，在用于結(jié)合的合適的溫育期限后，除去含有非固定化蛋白質(zhì)的水相，用合適的緩沖液(任選含非標記封閉劑)洗滌含有固定化多肽物質(zhì)和結(jié)合到其上的任何標記蛋白質(zhì)，除去洗滌緩沖液。洗滌后，測定(用光學(xué)、酶學(xué)、放射自顯影或其它放射化學(xué)方法)保持特異性結(jié)合到固定化多肽上的可檢測標記的量。
在某些實施方案中包括添加抑制非特異性結(jié)合的非標記封閉劑。這些封閉劑的例子包括但不限于以下物質(zhì)小牛胸腺DNA、魚精DNA、酵母RNA、不同長度寡核苷酸混合序列(隨機的或偽隨機的序列)、牛血清白蛋白、非離子去垢劑(NP-40.Tween，TritonX100，等)脫脂干奶蛋白質(zhì)、Denhardt′s反應(yīng)劑、聚乙烯吡咯烷酮、Fi-coll和其它封閉劑。操作者可以用其判斷選擇以合適濃度在結(jié)合試驗中包含的封閉劑；然而，選擇反應(yīng)條件以允許在對照結(jié)合反應(yīng)中WBP1或p53UBC多肽與p53多肽之間的特異性結(jié)合。包含封閉劑是為了抑制標記蛋白質(zhì)對固定化蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合和/或抑制標記多肽對固定化底物的非特異性結(jié)合。
在多肽是固定化的實施方案中，可以使用對底物的共價或非共價連接。共價連接的化學(xué)方法包括但不限于本領(lǐng)域公知的特征完全清楚的方法(kadonaga and Tijan(1986)Proc.Nat/.Acad.Sci.(U.S.A.)835889，本文引用以供參考)。一個不用來限制的例子是對用溴化氫衍生的底物(如CNBr-衍生的Sepharose 4B)的共價連接。采用間隔降低底物的潛在位阻可能是合乎需要的。蛋白質(zhì)對底物的非共價結(jié)合包括但不限于蛋白質(zhì)對帶電表面的結(jié)合和用特異性抗體的結(jié)合。
在一類實施方案中，進行平行結(jié)合反應(yīng)，其中一組反應(yīng)用作對照，至少另一組反應(yīng)包含各種量的試劑，試劑混合物或生物提取物，它們被用來試驗抑制p53-相互作用多肽對p53多肽的結(jié)合能力和/或抑制WBP1、p53UBC或p53多肽形成同源多聚體(同源二聚體)的結(jié)合的能力。
以舉例的方式但不以限制的方式給出下列實施例。變化和改變的實施方案對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
實驗性實施例實施例1 編碼p53結(jié)合蛋白質(zhì)的人cDNA的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列的確定本實施例描述編碼在酵母二雜交篩選系統(tǒng)中有活性的p53結(jié)合蛋白質(zhì)的人cDNA的鑒別。
從酵母二雜交篩選系統(tǒng)分離克隆的多核苷酸，所說的酵母二雜交篩選系統(tǒng)包含編碼融合進GAL4〔發(fā)明者注激活域或DNA結(jié)合域？？？〕的人p53多肽序列的多核苷酸和編碼融合進a〔發(fā)明者注激活域或DNA結(jié)合域？？？〕的人cDNA文庫序列的多核苷酸。酵母二雜交系統(tǒng)含有(1)得自己克隆進GAL4質(zhì)粒pGAD的Hela細胞的cDNA文庫(在Chien et a1.(1991)op.cit中描述)，和(2)編碼人p53多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有克隆進GAL4質(zhì)粒pGBT8的野生型人p53多肽序列之氨基酸72到氨基酸393的區(qū)段(在Freed etal.(1994)Science 2651713中描述)。
經(jīng)在含有腺嘌吟但缺少色氨酸、亮氨酸和組氨酸的基本培養(yǎng)基上生長，鑒別出阻性集落。選擇阻性集落并分離cDNA插入物的多核苷酸序列。對WBP1，通過用EcoRI和XhoI消化分離cDNA插入物，EcoRI/XbaI片段克隆進pBluescript，用Sanger二脫氧測序法測序。對p53UBC，通過用BamHI和SmaI消化分離cDNA插入物，BamHI/SmaI片段克隆進pBluescript，用Sanger雙脫氧測序法測序。
兩個陽性克隆被分離并測序。
命名為克隆85(WBP1)的一個克隆特異性地結(jié)合構(gòu)造上為野生型的人p53，且基本上不結(jié)合具有pAb240表位的突變型p53蛋白質(zhì)。pAB240單克隆抗體特異性識別在許多突變體p53多肽中發(fā)現(xiàn)的普通構(gòu)造變化。野生型人p53包含人p53的氨基酸72-393，突變型人p53包含在氨基酸#141(Cys→Arg)或在氨基酸#175(Arg→His)上具有點突變的序列。
圖1A-1D示出了WBP1的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列。發(fā)現(xiàn)被克隆WBP1編碼的152個氨基酸的區(qū)域是以體外結(jié)合野生型人p53。全長WBP1和各種缺失體在35S-甲硫氨酸存在下被體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，并與野生型p53(從桿狀病毒表達系統(tǒng)純化)混合。混合物在4℃下培養(yǎng)3小時，在結(jié)合p53的單克隆抗體(pAB421)和蛋白質(zhì)A-Sepharose玻珠加入后，繼續(xù)在4℃下再培養(yǎng)1小時?；厥盏鞍踪|(zhì)A-Sepharose免疫復(fù)合物，用20mM Tris(PH8.0)、150mMNa-cl，0.1％NP-40洗滌三次，溶解在用于SDS-PAGE的SDS-凝膠樣品緩沖液中。樣品在含有SDS的11％聚丙烯酰胺凝膠上分離。由p53特異性單克隆抗體pAB421免疫沉淀被試WBP1多肽的能力評價與p53的相互作用。這些實驗說明，WBP1蛋白質(zhì)的152個氨基酸區(qū)段(被約450核苷酸PstI片段編碼)足夠給出體外結(jié)合p53的性質(zhì)。這一片段具有以下序列ELPHLTSALHPVHPDIKLQKLPFYDLLDELIKPTSLASDNSQRFRETCFAFALTPQQVQQISSSMDISGTKCDFTVQVQLRFCLSETSCPQEDHFPPNLCVKVNTKPCSLPGYLPPTKNGVEPKRPSPINITSLVRLSTTVPNTIVVSWTA.
WBP1的序列分析揭示出與HFBDQ46(Nature Genetics(1993)4256)部分相同，所述HFBDQ46是隨機分離的用作遺傳標志(即，表達序列標志)獲得的未知功能和351bp cDNA。將從核苷酸201到核苷酸599的WBP1的區(qū)段與完整的HFBDQ46序列(命名為To6215)進行了序列對比，并示于以下(上面的序列是WBP1，下面的序列是HFBDQ46)201 CACAGAAAATCATGACGCCTGCAGACTTGTCCATCCCCAACGTACATTCA 2501 29 ............... CTGACTTGTCCATCCCCAACGTACATTCA251 AGTCCTATGCCAGCAACTTTGTCTCCATCTACCATTCCACAACTCACTTA 30030 AGTCCTATGCCAGCAACTTTGTCTCCATCTACCATTCCACAACTCACTTA 79301 CGATGGTCACCCTGCATCATCGCCATTACTCCCTGTTTCTCTTCTGGGAC 35080 CGATGGTCACCCTGCATCATCGCCATTACTCCCTGTTTCTCTTCTGGGAC 129351 CTAAACATGAACTGGAACTCCCACATCTTACATCAGCTCTTCACCCAGTC 400130 CTAAACATGAACTGGAACTCCCACATCTTACATCAGCTCTTCACCCAGTC 179401 CATCCGGATATAAAACTTCAAAAATTACCATTTTATGATTTACTGGATGA 450180 CATCCGGATATAAAACTTCAAAAATTACCATTTTATGATTTACTGGATGA 229451 ACTGATAAAACCCACCAGTCTAGCATCAGACAACAGTCAGCGCTTTCGAG 500230 ACTGATAAAACCCACCAGTCTAGCATCAGACAACAGTCAGCGCTTTCGAG 279501 AAACCTGTTTTGCATTTGCCTTGACACCACAACAAG.TGCAGCAAATCAG 549280 AAACCTGTTTTGCATTTGCCTTGACACCACAACAAGTNGCAGCAAATCAG 329550 TAGTTCCATGGATATTTCTGGGACCAAATGTGACTTCACAGTACAGGTCC 599330 TAGTTCCATGGGTATTTCTGGG..................... 351推導(dǎo)的WBP1的氨基酸序列用于研究編碼同源(即，相關(guān)序列)多肽的其它多核苷酸的GenBank數(shù)據(jù)庫。未發(fā)現(xiàn)明顯的同源性。
p53UBC分離了一種命名為克隆75A(p53UBC)的陽性克隆。p53UBC結(jié)合人p53的羧基末端部分(aa72到aa393)。當(dāng)在酵母二雜交系統(tǒng)中測定時，p53UBC多肽結(jié)合野生型和突變型p53多肽，稍微優(yōu)先結(jié)合野生型p53(描述出處同上)。
測序了p53UBC克隆，圖2顯示了其核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列，p53UBC的序列分析揭示出，編碼的多肽序列明顯同源于某些泛素偶聯(lián)酶。已報道泛素偶聯(lián)酶涉及到介導(dǎo)某些胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解(Chen et al.(1993)Cell74357)。
盡管為了清楚闡明的目的以說明的方式詳細描述了本發(fā)明，但很明顯，在權(quán)利要求的范圍內(nèi)可以進行某些變化和修改。
權(quán)利要求
1.一種分離的WBP1多肽，該多肽包含基本上相同于圖1A-1D所示多肽序列的至少25個連續(xù)的氨基酸的多肽序列。
2.一種權(quán)利要求1的分離的WBP1多肽，該多肽基本上相同于以下多肽序列1LLGPKHELEL PHLTSALHPV HPDIKLQKLP FYDLLDELIK PTSLASDNSQ51 RFRETCFAFA LTPQQVQQIS SSMDISGTKC DFTVQVQLRF CLSETSCPQE101 DHFPPNLCVK VNTKPCSLPG YLPPTKNGVE PKRPSRPINI TSLVRLSTTV151 PNTIVVSWTA EIGRNYSMAV YLVKQLSSTV LIQRLRAKGI RNPDHSRALI201 KEKLTADPDS EIATTSLRVS LLCPLGKMRL TIPCRALTCS HLQCFDATLY251 IQMNEKKPTW VCPVCDKKAP YEHLIIDGLF MEILKYCTDC DEIQFKEDGT301 WAPMRSKKEV QEVSASYNGV DGCLSSTLEH QVASHHQSSN KNKKVEVIDL351 TIDSSSDEEE EEPSAKRTCP SLSPTSPLNN KGILSLPHQA SPVSRTPSLP401 AVDTSYINTS LIQDYRHPFH MTPMPYDLQG LDFFPFLSGD NQHYNTSLLA451 AAAAAVSDDQ DLLHSSRFFP YTSSQMFLDQ LSAGGSTSLP TTNGSSSGSN501 SSLVSSNSLR ESHSHTVTNR SSTDTASIFG IIPDIISLD
3.一種權(quán)利要求1分離的WBP1多肽，該多肽包含以下p53-結(jié)合多肽序列-ELPHLTSALHPVHPDIKLQKLPFYDLLDELIKPTSLASDNSQRFRETCFAFALTPQQVQQISSMDISGTKCDFTVQVQLRFCLSETSCPQEDHFPPNLCVKVNTKPCSLPGYLPPTKNGVEPKRPSRPINITSLVRLSTTVPNTIVVSWTA-.
4.一種權(quán)利要求3的分離的WBP1多肽，該多肽包含以下597個氨基酸的多肽序列1MKIKELYRRR FPQKIMTPAD LSIPNVHSSP MPATLSPSTI PQLTYDGHPA51 SSPLLPVSLL GPKHELELPH LTSALHPVHP DIKLQKLPFY DLLDELIKPT101 SLASDNSQRF RETCFAFALT PQQVQQISSS MDISGTKCDF TVQVQLRFCL151 SETSCPQEDH FPPNLCVKVN TKPCSLPGYL PPTKNGVEPK RPSRPINITS201 LVRLSTTVPN TIVVSWTAEI GRNYSMAVYL VKQLSSTVLL QRLRAKGIRN251 PDHSRALIKE KLTADPDSEI ATTSLRVSLL CPLGKMRLTI PCRALTCSHL301 QCFDATLYIQ MNEKKPTWVC PVCDKKAPYE HLIIDGLFME ILKYCTDCDE351 IQFKEDGTWA PMRSKKEVQE VSASYNGVDG CLSSTLEHQV ASHHQSSNKN401 KKVEVIDLTI DSSSDEEEEE PSAKRTCPSL SPTSPLNNKG ILSLPHQASP451 VSRTPSLPAV DTSYINTSLI QDYRHPFHMT PMPYDLQGLD FFPFLSGDNQ501 HYNTSLLAAA AAAVSDDQDL LHSSRFFPYT SSQMFLDQLS AGGSTSLPTT551 NGSSSGSNSS LVSSNSLRES HSHTVTNRSS TDTASIFGII PDIISLD.
5.一種權(quán)利要求4的分離的WBP1多肽，該多肽基本上由以下597個氨基酸的多肽序列組成1MKIKELYRRR FPQKIMTPAD LSIPNVHSSP MPATISPSTI PQLTYDGHPA51 SSPLIPVSLL GPKHELELPH LTSALHPVHP DIKLQKLPFY DLLDELIKPT101 SLASDNSQRF RETCFAFALT PQQVQQISSS MDISGTKCDF TVQVQLRFCL151 SETSCPQEDH FPPNLCVKVN TKPCSLPGYL PPTKNGVEPK RPSRPINITS201 LVRLSTTVPN TIVVSWTAEI GRNYSMAVYL VKQLSSTVLL QRLRAKGIRN251 PDHSRALIKE KLTADPDSEI ATTSLRVSLL CPLGKMRLTI PCRALTCSHL301 QCFDATLYIQ MNEKKPTWVC PVCDKKAPYE HLIIDGLFME ILKYCTDCDE351 IQFKEDGTWA PMRSKKEVQE VSASYNGVDG CLSSTLEHQV ASHHQSSNKN401 KKVEVIDLTI DSSSDEEEEE PSAKRTCPSL SPTSPLNNKG ILSLPHQASP451 VSRTPSLPAV DTSYINTSLI QDYRHPFHMT PMPYDLQGLD FFPFLSGDNQ501 HYNTSLLAAA AAAVSDDQDL LHSSRFFPYT SSQMFLDQLS AGGSTSLPTT551 NGSSSGSNSS LVSSNSLRES HSHTVTNRSS TDTASIFGII PDIISLD.
6.一種權(quán)利要求1的分離的WBP1多肽，該多肽是哺乳動物中天然產(chǎn)生的多肽序列。
7.一種權(quán)利要求6的分離的WBP1多肽，該多肽是人WBP1多肽。
8.一種權(quán)利要求7的分離的WBP1多肽，該多肽包含至少兩種表III中所示的氨基酸序列。
9.一種非人細胞中的或基本上從其它人蛋白質(zhì)純化的人WBP1多肽，所說的人WBP1多肽包含下列氨基酸序列，以從氨基末端到羧基末端方向的順序，用間隔氨基酸序列分開下列各氨基酸序列(1) -ELPHLTSALHP-； (2) -PQQVQQISSSMDISGTKC-；(3) -LLQRLRAKGIRNPDHSRALI-； (4) -WAPMRSKKEVQEVSASYNGV-；(5) -EEPSAKRTCPSLSPTSPLNN-； (6) -TPMPYDLQGLDFFPFLSGD-；(7) -SLVSSNSLRESHSHTVTNR-； (8) -SSTDTASIFGIIPDIISLD-；其中各間隔氨基酸序列獨立地選擇，并為0-100個氨基酸組成。
10.一種非人細胞中的或基本上從其它人蛋白質(zhì)純化的人WBP1多肽，所說的WBP1多肽包含下列多肽序列1LLGPKHELEL PHLTSALHPV HPDIKLQKLP FYDLLDELIK PTSLASDNSQ51 RFRETCFAFA LTPQQVQQIS SSMDISGTKC DFTVQVQLRF CLSETSCPQE101 DHFPPNLCVK VNTKPCSLPG YLPPTKNGVE PKRPSRPINI TSLVRLSTTV151 PNTIVVSWTA EIGRNYSMAV YLVKQLSSTV LIQRLRAKGI RNPDHSRALI201 KEKLTADPDS EIATTSLRVS LLCPLGKMRL TIPCRALTCS HLQCFDATLY251 IQMNEKKPTW VCPVCDKKAP YEHLIIDGLF MEILKYCTDC DEIQFKEDGT301 WAPMRSKKEV QEVSASYNGV DGCLSSTLEH QVASHHQSSN KNKKVEVIDL351 TIDSSSDEEE EEPSAKRTCP SLSPTSPLNN KGILSLPHQA SPVSRTPSLP401 AVDTSYINTS LIQDYRHPFH MTPMPYDLQG LDFFPFLSGD NQHYNTSLLA451 AAAAAVSDDQ DLLHSSRFFP YTSSQMFLDQ LSAGGSTSLP TTNGSSSGSN501 SSLVSSNSLR ESHSHTVTNR SSTDTASIFG IIPDIISLD
11.一種權(quán)利要求10的非人細胞中的或基本上從其它人蛋白質(zhì)純化的人WBP1多肽，所說的WBP1多肽基本上由下列多肽序列構(gòu)成1MKIKELYRRR FPQKIMTPAD LSIPNVHSSP MPATLSPSTI PQLTYDGHPA51 SSPLLPVSLL GPKHELELPH LTSALHPVHP DIKLQKLPFY DLLDELIKPT101 SLASDNSQRF RETCFAFALT PQQVQQISSS MDISGTKCDF TVQVQLRFCL151 SETSCPQEDH FPPNLCVKVN TKPCSLPGYL PPTKNGVEPK RPSRPINITS201 LVRLSTTVPN TIVVSWTAEI GRNYSMAVYL VKQLSSTVLL QRLRAKGIRN251 PDHSRALIKE KLTADPDSEI ATTSLRVSLL CPLGKMRLTI PCRALTCSHL301 QCFDATLYIQ MNEKKPTWVC PVCDKKAPYE HLIIDGLFME ILKYCTDCDE351 IQFKEDGTWA PMRSKKEVQE VSASYNGVDG CLSSTLEHQV ASHHQSSNKN401 KKVEVIDLTI DSSSDEEEEE PSAKRTCPSL SPTSPLNNKG ILSLPHQASP451 VSRTPSLPAV DTSYINTSLI QDYRHPFHMT PMPYDLQGLD FFPFLSGDNQ501 HYNTSLLAAA AAAVSDDQDL LHSSRFFPYT SSQMFLDQLS AGGSTSLPTT551 NGSSSGSNSS LVSSNSLRES HSHTVTNRSS TDTASIFGII PDIISLD
12.一種權(quán)利要求10的以多肽鍵融合進異源多肽序列的人WBP1多肽。
13.一種權(quán)利要求10的人WBP1多肽，其中所說的異源多肽序列是GAL4激活域序列或GAL4 DNA-結(jié)合域。
14.一種編碼權(quán)利要求1的WBP1多肽的分離的多核苷酸。
15.一種權(quán)利要求14的分離的多核苷酸，該核苷酸包含至少兩種表I所示的多核苷酸序列。
16.一種權(quán)利要求15的分離的多核苷酸，其中所說的多核苷酸包含獨立地選自由以下序列組成的組中的五種序列5′-GACTTGTCCATCCCCAACGTACATTCAAGTCCTATGC 3′；5′-CTTCAAAAATTACCATTTTATGATTTACTGGATGAACT 3′；5′-CATCAGACAACAGTCAGCGCTTTCGAGAAACCTGTTTTGC 3′；5′-CACAACAAGTGCAGCAAATCAGTAGTTCCATGGATA 3′；5′-GTACAGGTCCAGTTAAGGTTTTGTTTATCAGAAACCAGTTG 3′；5′-TGAAAGTGAATACAAAACCTTGCAGCCTTCCAGG 3′；5′-CCACCTACAAAAAATGGCGTGGAACCAAAGCCGACCCAGCCGAC 3′；5′-GACTGTCCACAACAGTACCAAACACGATTTGTTG 3′；5′-GGAAGAAACTATTCCATGGCAGTATATCTTGTAAAACAGT 3′；5′-CAGAGGTTACGAGCAAAGGGAATAAGGAATCCGGATCATTCTAGAG 3′；5′-GGATCCAGACAGTGAAATAGCTACAACCAGCCTAAG 3′；5′-CTTGGTAAAATGCGGCTGACAATTCCGTGTCGGGCCCTTAC 3′；5′-CATCTACAATGTTTTGACGCAACTCTTTACATTCAGATG 3′；5′-GTCCTGTCTGTGATAAGAAGGCTCCATATGAACACC 3′；5′-TCCTAAAGTACTGTACAGACTGTGATGAAATACAATTTAAGGAGGATG 3′；5′-GGAAGTACAGGAAGTTTCTGCCTCTTACAATGGAGTC 3′；5′-CTTGAGCTCCACATTGGAGCATCAGGTAGCGTCTCACCAC 3′；5′-AGTGATTGACCTAACCATAGACAGTTCATCTGATGAAGAGGA 3′；5′-CCAAGAGGACCTGTCCTTCCCTATCTCCCACATCACCACT 3′；5′CTTCCACATCAAGCATCTCCAGTATCCCGCACCCCAAGCCTTC 3′；5′-TAATACCTCCCTCATCCAAGACTATAGGCATCCTTTTCC 3′；5′-CCATGCCTTACGACTTACAAGGATTAGATTTCTTTCCTTTCTTATCA 3′；5′-ACAACACCTCCTTGCTTGCCGCTGCAGCAGCAGCAGTTTCAGAT 3′；5′-CTACACTCGTCTCGGTTTTTCCCGTATACCTCCTCACAG 3′；5′-GGAGGCAGTACTTCTCTGCCAACCACCAATGGAAGC 3′；5′-GGTTTCTTCCAACAGCCTAAGGGAAAGCCATAGCCACAC 3′；5′-CGGACACGGCATCCATCTTTGGCATCATACCAGACATTAT 3′；5′-GCTGCTCCCATCCCCACCCCAGATCGAATGAACTTGGCAGA 3′；5′-GTGCTCTGTTTTACCTTACTCTGTTTAGAAAAGTATACAAGCGTG 3′；5′-GAAATGTACAGAGAACAAAACTATATTTTCAGTT 3′；and5′-CTTTTGTATATAAATCTAAGACTGCCTGTGTGATAAAACACTTG 3′.
17.一種權(quán)利要求15的分離的多核苷酸，其中所說的多核苷酸包含下列序列GGCACGAGGCGGACAGTGCGGAACTAAAGCAAATGGTTATGAGCCTTAGAGTTTCTGAACTCCAAGTACTGTTGGGCTACGCGGGAGAAACAAGCACGGACGCAAACACGAACTTCTCACAAAAGCCCTGCATTTGCTAAAGGCTGGCTGTAGTCCTGCTGTGCAAATGAAAATTAAGGAACTCTATAGGCGGCGGTTCCCACAGAAAATCATGACGCCTGCAGACTTGTCCATCCCCAACGTACATTCAAGTCCTATGCCAGCAACTTTGTCTCCATCTACCATTCCACAACTCACTTACGATGGTCACCCTGCATCATCGCCATTACTCCCTGTTTCTCTTCTGGGACCTAAACATGAACTGGAACTCCCACATCTTACATCAGCTCTTCACCCAGTCCATCCGGATATAAAACTTCAAAAATTACCATTTTATGATTTACTGGATGAACTGATAAAACCCACCAGTCTAGCATCAGACAACAGTCAGCGCTTTCGAGAAACCTGTTTTGCATTTGCCTTGACACCACAACAAGTGCAGCAAATCAGTAGTTCCATGGATATTTCTGGGACCAAATGTGACTTCACAGTACAGGTCCAGTTAAGGTTTTGTTTATCAGAAACCAGTTGTCCACAAGAAGATCACTTCCCACCCAATCTTTGTGTGAAAGTGAATACAAAACCTTGCAGCCTTCCAGGTTACCTTCCACCTACAAAAAATGGCGTGGAACCAAAGCGACCCAGCCGACCAATTAATATCACCTCACTTGTCCGACTGTCCACAACAGTACCAAACACGATTGTTGTTTCTTGGACTGCAGAAATTGGAAGAAACTATTCCATGGCAGTATATCTTGTAAAACAGTTGTCCTCAACAGTTCTTCTTCAGAGGTTACGAGCAAAGGGAATAAGGAATCCGGATCATTCTAGAGCTTTAATTAAAGAGAAGTTGACTGCGGATCCAGACAGTGAAATAGCTACAACCAGCCTAAGGGTTTCTCTACTATGTCCACTTGGTAAAATGCGGCTGACAATTCCGTGTCGGGCCCTTACATGTTCTCATCTACAATGTTTTGACGCAACTCTTTACATTCAGATGAATGAGAAAAAACCAACCTGGGTTTGTCCTGTCTGTGATAAGAAGGCTCCATATGAACACCTTATTATTGATGGCTTGGTTTATGGAAATCCTAAAGTACTGTACAGACTGTGATGAAATACAATTTAAGGAGGATGGCACTTGGGCACCGATGAGATCAAAAAAGGAAGTACAGGAAGTTTCTGCCTCTTACAATGGAGTCGATGGATGCTTGAGCTCCACATTGGAGCATCAGGTAGCGTCTCACCACCAGTCCTCAAATAAAAACAAGAAAGTAGAAGTGATTGACCTAACCATAGACAGTTCATCTGATGAAGAGGAAGAAGAGCCATCTGCCAAGAGGACCTGTCCTTCCCTATCTCCCACATCACCACTAAATAATAAAGGCATTTTAAGTCTTCCACATCAAGCATCTCCAGTATCCCGCACCCCAAGCCTTCCTGCTGTAGACACAAGCTACATTAATACCTCCCTCATCCAAGACTATAGGCATCCTTTCCACATGACACCCATGCCTTACGACTTACAAGGATTAGATTTCTTTCCTTTCTTATCAGGAGACAATCAGCATTACAACACCTCCTTGCTTGCCGCTGCAGCAGCAGCAGTTTCAGATGATCAAGACCTCCTACACTCGTCTCGGTTTTTCCCGTATACCTCCTCACAGATGTTTCTTGATCAGTTAAGTGCAGGAGGCAGTACTTCTCTGCCAACCACCAATGGAAGCAGTAGTGGCAGTAACAGCAGCCTGGTTTCTTCCAACAGCCTAAGGGAAAGCCATAGCCACATTGGACTGATTCCCAGGCCCTGCTGCTCCCATCCCCACCCCAGATCGAATGAACTTGGCAGAAAGAAGAGAACTTTGTGCTCTGTTTTACCTTACTCTGTTTAGAAAAGTATACAAGCGTGTTTTTTTTCCTTTTTTTAGGGAAAAAATTAAAAGAAATGTACAGAGAACAAAACTATATTTTCAGTTTTACTTTTGTATATAAATCTAAGACTGCCTGTGTGATAAAACACTTGTTTAAA
18.一種分離的p53UBC多肽，該多肽包含基本上相同于圖2所示多肽序列的至少25個連續(xù)的氨基酸的多肽序列。
19.一種權(quán)利要求18的分離的p53UBC多肽，該多肽基本上相同于以下多肽序列1GTLNMSGIA LSRLAQERKA WRKDHPFGFV AVPTKNPDGT MNLMNWESAI51 PGKKGTPWEG GLFKLRMLFK DDYPSSPPKC KFEPPLFHPN VYFGTVCLSI101 LEEDKDWRPA ITIKQILLGI QELLNEPNIQ DPAQAEAYTI YCQNRVEYEK151 RVRAQAKNLR PHKQRPCGIV RRKGLVWQEL VYNIFANLKL LHTMTSHLGG201 LGRHLPLPP RVCGLDSLNC PFPYRVSSSV FCIFDCYVKL AFILILMSVF251 QLL.
20.一種權(quán)利要求18的分離的p53UBC多肽，該多肽是哺乳動物中天然產(chǎn)生的多肽序列。
21.一種權(quán)利要求20的分離的p53UBC多肽，該多肽是人p53UBC多肽。
22.一種權(quán)利要求20的分離的p53UBC多肽，該多肽包含至少兩種表IV中所示的氨基酸序列。
23.一種非人細胞中的或基本上從其它人蛋白質(zhì)純化的人p53UBC多肽，所以的人p53UBC多肽包含以從氨基末端到羧基末端方向的順序，用間隔氨基酸序列分開各氨基酸序列的下列氨基酸序列-RKAWRKDHPFGFVAVPTKNP-；-NIQDPAQAEAYTIYCQNRVEYE-；-GLVWQELVYNIFANLKLLHT-；-GLDSLNCPFPYRVSSSVFCI-；和-KLAFILILMSVFQL-.
24.一種編碼權(quán)利要求18、19或23的p53UBC多肽的分離的多核苷酸。
25.一種權(quán)利要求24的分離的多核苷酸，該多核苷酸包含至少兩種表II所示的多核苷酸序列。
26.一種權(quán)利要求25的分離的多核苷酸，其中所說的多核苷酸編碼下列多肽序列1RGTLNMSGIA LSRLAQERKA WRKDHPFGFV AVPTKNPDGT MNLMNWESAI51 PGKKGTPWEG GLFKLRMLFK DDYPSSPPKC KFEPPLFHPN VYFGTVCLSI101 LEEDKDWRPA ITIKQILLGI QELLNEPNIQ DPAQAEAYTI YCQNRVEYEK151 RVRAQAKNLR PHKQRPCGIV RRKGLVWQEL VYNIFANLKL LHTMTSHLGG201 LGGRHLPLPP RVCGLDSLNC PFPYRVSSSV FCIFDCYVKL AFILILMSVF251 QLL.
27.權(quán)利要求26的分離的多核苷酸，其中所說的多核苷酸存在于酵母細胞中。
28.一種包含至少二種表II所示序列的分離的多核苷酸。
29.一種包含下列序列的分離的多核苷酸CGAGGGACTTTGAACATGTCGGGGATCGCCCTCAGCAGACTCGCCCAGGAGAGGAAAGCATGGAGGAAAGACCACCCATTTGGTTTCGTGGCTGTCCCAACAAAAAATCCCGATGGCACGATGAACCTCATGAACTGGGAGAGCGCCATTCCAGGAAAGAAAGGGACTCCGTGGGAAGGAGGCTTGTTTAAACTACGGATGCTTTTCAAAGATGATTATCCATCTTCGCCACCAAAATGTAAATTCGAACCACCATTATTTCACCCGAATGTGTACTTCGGGACAGTGTGCCTGTCCATCTTAGAGGAGGACAAGGACTGGAGGCCAGCCATCACAATCAAACAGATCCTATTAGGAATACAGGAACTTCTAAATGAACCAAATATCCAAGACCCAGCTCAAGCAGAGGCCTACACGATTTACTGCCAAAACAGAGTGGAGTACGAGAAAAGGGTCCGAGCTCAAGCCAAGAATTTGCGCCCTCATAAGCAGCGACCTTGTGGCATCGTCAGAAGGAAGGGATTGGTTTGGCAAGAACTTGTTTACAACATTTTTGCAAATCTAAAGTTGCTCCATACAATGACTAGTCACCTGGGGGGGTTGGGCGGGCGCCATCTTCCATTGCCGCCGCGGGTGTGCGGTCTCGATTCGCTGAATTGCCCGTTTCCATACAGGGTCTCTTCTTCGGTCTTTTGTATTTTTGATTGTTATGTAAAACTCGCTTTTATTTTAATATTGATGTCAGTATTTCAACTGCTGTAAAATTATAAACTTTTATACTTGGGTAAGTCCCCCAGGGCGAGTTCCTCGCTCTGGGATGCAGGCATGCTTCTCACCGTGCAGAGCTGCACTTGGCCTCAGCTGGCTGTATGGAAATGCACCCTCCCTCCTGCGCTCCTCTCTAGAACCTTCTAGAACCTGGGCTGTGCTGCTTTTGAGCCTCAGACCCCAGGGCAGCATCTCGGTTCTGCGCCACTTCCTTTGTGTTTATATGGCGTTTTGTCTGTGTTGCTGTTTAGAGTAAATAAACTGTTTATATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTCCGAATTGCGCACGAGGCGCTATCACCACCTCAGTTATACTCTTATTCCTAGATATTTGGGACATAAGAACCAAAATCTAAAAATTAAGAGGTTTCCTCCTCAAATACAGAATAAAAGCTGCTATGCCTGAGGCATACAGGGCTTTGTTGGTCCGGCACATCATATTTTACTATTTGTTTGAGGTATTTGCCGAATCTTGTTAATAACAGTGAATTGGCTAAACCCATATTCTTAGATTTGGACATAGATAGATGCTTAGTAAATACTAAATTGAAATGAATTAGGCCAGAGGAGATCAGACATAGGAATTTAAAGTTAGTCTTGAGAGAAACTTAGGTAAAAAGAAAAACAAAATTAAAGGAGGACTGTGTGTGAGAGTTGAAAGATATAAGTTCCAGAATGTTGTGGCAGGACAGTGAAATCTTCTGGTTCCTAAAGACGGAGGAGACTCTCTCCCAGCACCTGACTTCCACCCTCCCACTACTGCCAGACCTTTGCCTGGGCTGTTCCTAGCCTGGAGCACTGTCCCCCGTCTCGATCCTGCCTTCCCCTGAAACCCCTGCAGGGGCTGCCCTCTTTTGGCCTCCCACTGTGTCCCTTCTCTCATGTGCATTAGATCTCAGCCTGGCCTTGAATGTCTCTTTCTCACCAGTACCTTGCACAGTAAACATTCAAACTTACTGTGAATTCATCTGAAAAAAAAA
30.一種基本上由以下序列組成的分離和多核苷酸CGAGGGACTTTGAACATGTCGGGGATCGCCCTCAGCAGACTCGCCCAGGAGAGGAAAGCATGGAGGAAAGACCACCCATTTGGTTTCGTGGCTGTCCCAACAAAAAATCCCGATGGCACGATGAACCTCATGAACTGGGAGAGCGCCATTCCAGGAAAGAAAGGGACTCCGTGGGAAGGAGGCTTGTTTAAACTACGGATGCTTTTCAAAGATGATTATCCATCTTCGCCACCAAAATGTAAATTCGAACCACCATTATTTCACCCGAATGTGTACTTCGGGACAGTGTGCCTGTCCATCTTAGAGGAGGACAAGGACTGGAGGCCAGCCATCACAATCAAACAGATCCTATTAGGAATACAGGAACTTCTAAATGAACCAAATATCCAAGACCCAGCTCAAGCAGAGGCCTACACGATTTACTGCCAAAACAGAGTGGAGTACGAGAAAAGGGTCCGAGCTCAAGCCAAGAATTTGCGCCCTCATAAGCAGCGACCTTGTGGCATCGTCAGAAGGAAGGGATTGGTTTGGCAAGAACTTGTTTACAACATTTTTGCAAATCTAAAGTTGCTCCATACAATGACTAGTCACCTGGGGGGGTTGGGCGGGCGCCATCTTCCATTGCCGCCGCGGGTGTGCGGTCTCGATTCGCTGAATTGCCCGTTTCCATACAGGGTCTCTTCTTCGGTCTTTTGTATTTTTGATTGTTATGTAAAACTCGCTTTTATTTTAATATTGATGTCAGTATTTCAACTGCTGTAAAATTATAAACTTTTATACTTGGGTAAGTCCCCCAGGGCGAGTTCCTCGCTCTGGGATGCAGGCATGCTTCTCACCGTGCAGAGCTGCACTTGGCCTCAGCTGGCTGTATGGAAATGCACCCTCCCTCCTGCGCTCCTCTCTAGAACCTTCTAGAACCTGGGCTGTGCTGCTTTTGAGCCTCAGACCCCAGGGCAGCATCTCGGTTCTGCGCCACTTCCTTTGTGTTTATATGGCGTTTTGTCTGTGTTGCTGTTTAGAGTAAATAAACTGTTTATATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTCCGAATTGCGCACGAGGCGCTATCACCACCTCAGTTATACTCTTATTCCTAGATATTTGGGACATAAGAACCAAAATCTAAAAATTAAGAGGTTTCCTCCTCAAATACAGAATAAAAGCTGCTATGCCTGAGGCATACAGGGCTTTGTTGGTCCGGCACATCATATTTTACTATTTGTTTGAGGTATTTGCCGAATCTTGTTAATAACAGTGAATTGGCTAAACCCATATTCTTAGATTTGGACATAGATAGATGCTTAGTAAATACTAAATTGAAATGAATTAGGCCAGAGGAGATCAGACATAGGAATTTAAAGTTAGTCTTGAGAGAAACTTAGGTAAAAAGAAAAACAAAATTAAAGGAGGACTGTGTGTGAGAGTTGAAAGATATAAGTTCCAGAATGTTGTGGCAGGACAGTGAAATCTTCTGGTTCCTAAAGACGGAGGAGACTCTCTCCCAGCACCTGACTTCCACCCTCCCACTACTGCCAGACCTTTGCCTGGGCTGTTCCTAGCCTGGAGCACTGTCCCCCGTCTCGATCCTGCCTTCCCCTGAAACCCCTGCAGGGGCTGCCCTCTTTTGGCCTCCCACTGTGTCCCTTCTCTCATGTGCATTAGATCTCAGCCTGGCCTTGAATGTCTCTTTCTCACCAGTACCTTGCACAGTAAACATTCAAACTTACTGTGAATTCATCTGAAAAAAAAA
31.一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，該復(fù)合物包含權(quán)利要求5或19的多肽和人p53多肽，其中所說的復(fù)合物存在于非人細胞中。
32.一種分離的宿主細胞，該細胞包含一種編碼權(quán)利要求14的多肽的重組多核苷酸。
33.一種非哺乳動物宿主細胞，該細胞包含哺乳動物p53多肽和哺乳動物p53UBC或WBP1多肽。
34.一種包含多核苷酸序列的組合物，所說的多核苷酸編碼(1)第一雜交多肽，該多肽包含P53多肽和轉(zhuǎn)錄激活蛋白質(zhì)的激活域，(2)第二雜交多肽，該多肽包含p53UBC或WBP1多肽和所說轉(zhuǎn)錄激活蛋白質(zhì)的DNA-結(jié)合域，和(3)報道多核苷酸，該核苷酸連接到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件上，所述調(diào)節(jié)元件的轉(zhuǎn)錄活性取決于由第一和第二雜交多肽組成的異源二聚體的存在或缺少。
35.一種鑒別試劑的方法，所述試劑抑制p53多肽與p53UBC或WBP1多肽結(jié)合形成異源多聚體，所述的方法包括進行異源二聚體化試驗，該試驗包括在合適的結(jié)合條件下使包含結(jié)合域的p53多肽物質(zhì)與包含結(jié)合域的p53UBC或WBP1多肽物質(zhì)和一種試劑接觸；測定所述試劑是否抑制p53多肽與p53UBC或WBP1多肽的異源二聚體化。鑒別出抑制所說異源二聚體化的試劑，作為候選p53調(diào)節(jié)劑和候選藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供結(jié)合野生型和/或突變型哺乳動物p
文檔編號A61P1/16GK1141059SQ94194781
公開日1997年1月22日 申請日期1994年11月21日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月22日
發(fā)明者J·R·比肖夫, L·吳 申請人:昂尼克斯藥物公司