專利名稱：一種墨旱蓮有效組分的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥提取物，具體地說涉及從墨旱蓮中提取有效組分的制備方法，以及 該有效組分在制備治療、預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是一種常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾 病。目前業(yè)內(nèi)對(duì)惡性腫瘤的治療主要還是以手術(shù)、放療、化療為主，但許多化學(xué)抗癌藥物在 作用于靶細(xì)胞時(shí)往往累及正常細(xì)胞，造成嚴(yán)重的副反應(yīng)。植物藥的遺傳毒性不明顯，中草藥 在抗癌抗突變方面有獨(dú)特的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景，而且中藥在對(duì)腫瘤的輔助治療中也起 到不容忽視的作用。紫杉醇即是典型的從植物中獲得的具有良好抗癌活性的天然化合物， 現(xiàn)已開發(fā)為抗腫瘤藥物。目前我國危害性最為嚴(yán)重的腫瘤為肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大 腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病及淋巴瘤等。特別是肝癌的發(fā)生率近年來有所增加。值 得重視，這些腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病學(xué)及其防治，均為我國腫瘤研究的重點(diǎn)。尋找高效低毒的 抗癌藥物以及抗癌輔助藥物是當(dāng)前腫瘤研究的重要內(nèi)容。我國藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質(zhì)是研究和發(fā)現(xiàn)新藥先導(dǎo)化學(xué)物，開 發(fā)新藥的天然寶庫。目前，我國從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，用于開發(fā)成治療腫瘤疾病、 安全性好、毒性低的新藥還很少，從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，開發(fā)成具有抗腫瘤療效的新 藥，具有重要應(yīng)用價(jià)值和廣闊發(fā)展前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種墨旱蓮有效組分的制備方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)將墨 旱蓮藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液，將提取液濃縮成浸膏，用反相硅 膠柱(0DS)對(duì)其進(jìn)行分離，首先用低濃度乙醇作為流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，然后改換高濃 度乙醇作為流動(dòng)相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分 離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動(dòng)相為水和乙腈，梯度洗脫，收 集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。優(yōu)選的墨旱蓮有效組分制備方法，包括下列步驟將墨旱蓮藥材粉碎后加入 1 0.8 1.2(體積比)的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.8 1.2小時(shí)，提取1 3次， 合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，用反相硅膠柱(0DS)對(duì)其進(jìn)行分離，首先用 20% -40% (體積比)的乙醇溶液作為流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，再用90%-100% (體 積比)的乙醇溶液作為流動(dòng)相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相 色譜繼續(xù)分離得到的目的物；制備色譜的分離條件為色譜柱為制備柱(Zorbax SB-C18 ； 21. 2mmX 250mm)，流動(dòng)相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9 llml/min，柱溫為室溫，收集溶 液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。最佳的墨旱蓮有效組分制備方法，包括下列步驟將墨旱蓮藥材粉碎后加入 1 1(體積比)的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流1小時(shí)，提取2次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，用反相硅膠柱(ODS)對(duì)其進(jìn)行分離，首先用30% (體積比)的乙醇溶液 作為流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，再用95% (體積比)的乙醇溶液作為流動(dòng)相，得洗脫液II， 將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的目的物；制備色譜的分 離條件為色譜柱為制備柱(Zorbax SB-C18 ；21. 2mmX 250mm)，流動(dòng)相為水和乙腈，梯度洗 脫，流速為lOml/min，柱溫為室溫。梯度洗脫程序如下0分鐘時(shí)，流動(dòng)相為80%的水溶液 和20%的乙腈溶液；4分鐘時(shí)，流動(dòng)相為80%的水溶液和20%的乙腈溶液；19分鐘時(shí)，流動(dòng) 相為50%的水溶液和50%的乙腈溶液；54分鐘時(shí)，流動(dòng)相為5%的水溶液和95%的乙腈溶 液；64分鐘時(shí)，流動(dòng)相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液。在時(shí)間段40. O 44. Omin收集 溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供該墨旱蓮有效組分在制備治療、預(yù)防肝臟腫瘤藥物中 的應(yīng)用。本發(fā)明的墨旱蓮有效組分可以作為活性成分，加入藥劑學(xué)上接受的藥物賦形劑或 載體，按照藥劑學(xué)上記載的方法制成制劑。所制備的藥物的制劑形式為液體制劑、固體制 劑、膠囊劑或膠丸劑，給藥方式為口服給藥或注射給藥。本發(fā)明的墨旱蓮有效組分還可以作為活性成分之一，加入其他抗腫瘤藥物，加入 藥劑學(xué)上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學(xué)上記載的方法制成制劑。本發(fā)明的有益之處是通過本方法制得墨旱蓮有效組分方法簡便，質(zhì)量穩(wěn)定。且現(xiàn) 有技術(shù)中尚未有墨旱蓮抗肝臟腫瘤活性的報(bào)道，本發(fā)明為研發(fā)墨旱蓮抗腫瘤新藥提供一定 ■石出。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合下面實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，該實(shí)施例僅用于說明 本發(fā)明而并非對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例一墨旱蓮有效組分的制備將200g墨旱蓮藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1 0.8)(體積比)1500ml，加熱 提取1次得提取液，將提取液濃縮成浸膏，用反相硅膠柱(ODS)對(duì)其進(jìn)行分離，首先用20% (體積比)乙醇溶液作為流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，然后改換90% (體積比)乙醇溶液作為 流動(dòng)相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣 品，制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動(dòng)相為水和乙腈，梯度洗脫。梯度洗脫程序如 下0分鐘時(shí)，流動(dòng)相為80%的水溶液和20%的乙腈溶液；4分鐘時(shí)，流動(dòng)相為80%的水溶 液和20%的乙腈溶液；19分鐘時(shí)，流動(dòng)相為50%的水溶液和50%的乙腈溶液；54分鐘時(shí)， 流動(dòng)相為5 %的水溶液和95 %的乙腈溶液；64分鐘時(shí)，流動(dòng)相為5 %的水溶液和95%的乙 腈溶液。在時(shí)間段40. O 44. Omin收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分。實(shí)施例二墨旱蓮有效組分的制備將500g墨旱蓮藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1 1.2)(體積比)5000ml，加熱 提取3次得提取液，將提取液濃縮成浸膏，用反相硅膠柱(ODS)對(duì)其進(jìn)行分離，首先用40% (體積比)乙醇溶液作為流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，然后改換100% (體積比)乙醇溶液作 為流動(dòng)相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的 樣品，制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動(dòng)相為水和乙腈，梯度洗脫。梯度洗脫程 序如下0分鐘時(shí)，流動(dòng)相為80%的水溶液和20%的乙腈溶液；4分鐘時(shí)，流動(dòng)相為80%的水溶液和20%的乙腈溶液；19分鐘時(shí)，流動(dòng)相為50%的水溶液和50%的乙腈溶液；54分鐘 時(shí)，流動(dòng)相為5 %的水溶液和95 %的乙腈溶液；64分鐘時(shí)，流動(dòng)相為5 %的水溶液和95 %的 乙腈溶液。在時(shí)間段40. 0 44. Omin收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分。實(shí)施例三墨旱蓮有效組分的制備將250g墨旱蓮藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1 1)(體積比)2000ml，加熱 提取2次得提取液，將提取液濃縮成浸膏，用反相硅膠柱(ODS)對(duì)其進(jìn)行分離，首先用30% (體積比)乙醇溶液作為 流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，然后改換95% (體積比)乙醇溶液作為 流動(dòng)相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣 品，制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動(dòng)相為水和乙腈，梯度洗脫。梯度洗脫程序如 下0分鐘時(shí)，流動(dòng)相為80%的水溶液和20%的乙腈溶液；4分鐘時(shí)，流動(dòng)相為80%的水溶 液和20%的乙腈溶液；19分鐘時(shí)，流動(dòng)相為50%的水溶液和50%的乙腈溶液；54分鐘時(shí)， 流動(dòng)相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；64分鐘時(shí)，流動(dòng)相為5%的水溶液和95%的乙 腈溶液。在時(shí)間段40. 0 44. Omin收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分。實(shí)施例四墨旱蓮有效組分制劑取實(shí)施例三的墨旱蓮有效組分0. 5g與10. 5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔 融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6 8°C液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。實(shí)施例五墨旱蓮有效組分制劑取實(shí)施例三的墨旱蓮有效組分0. 5g、葡萄糖4. 5g、硫代硫酸鈉0. 9g和蒸餾水1ml， 上述組分混合均勻后，冷凍干燥，分裝500支，即得。 實(shí)施例六墨旱蓮有效組分制劑取降香油1.5g，加入到13ml飽和的羥丙基β -環(huán)糊精中，攪拌溶解，濾過，濾液低 溫干燥，得降香油和羥丙基環(huán)糊精的包合物粉末。除上述降香油合羥丙基環(huán)糊精 的包合物粉末外，再取實(shí)施例三的墨旱蓮提取物0. 5g、甘露醇5. 5g、依地酸鈣鈉0. 9g和蒸 餾水2ml，上述組分混勻后，冷凍干燥，分裝300支，即得。實(shí)施例七墨旱蓮有效組分制劑取實(shí)施例三的墨旱蓮有效組分適量用40°C注射用水溶解，加入適量藥用載體等滲 齊U，調(diào)節(jié)溶液的pH值為7. 0-8.0，加注射用水至全量，用超濾器超濾除熱源，測定PH值后，用 膜過濾，分裝后，高壓滅菌，檢驗(yàn)、包裝，即得。實(shí)施例八墨旱蓮有效組分制劑取實(shí)施例三的墨旱蓮有效組分與花生油按2 18的比例水溶式不銹鋼攪拌灌中， 同時(shí)加入適量明膠和甘油混合，放出再用膠體磨磨漿，磨出的混合液攪拌，制成藥液；將甘 油與蒸餾水在40-50°C溫度下攪拌混溶，再將甘油液溫至80-90°C，取明膠加入其中混合攪 拌，直至全部溶化成膠液，然后在60°C溫度下使膠液靜置4小時(shí)，用制板機(jī)制成膠板供制丸 工序使用；將上述制成的藥液和膠板送入壓丸機(jī)制丸，然后在22-25°C溫度下吹風(fēng)4小時(shí)作 滾筒定型，又在25-30°C溫度下吹風(fēng)干燥16-20小時(shí)，檢選合格膠丸，用95%乙醇清洗，在 25-30°C下吹風(fēng)干燥4小時(shí)，即得。實(shí)施例九墨旱蓮有效組分制劑取實(shí)施例三的墨旱蓮有效組分適量與微晶纖維素混合均勻，加3%聚維酮乙醇溶 液制軟材，過18目篩制顆粒，60°C干燥1小時(shí)，整粒，加入滑石粉適量，混勻，壓片，即得。
實(shí)施例十墨旱蓮有效組分的藥理實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照組正常培養(yǎng)條件的等量細(xì)胞
陽性對(duì)照組D0X (阿霉素4 ii M)細(xì)胞株IfepG-2(人肝癌細(xì)胞株)，貼壁細(xì)胞；培養(yǎng)液90% DMEM(高糖)+10% CS+1 %非必須氨基酸+100U/ml青霉素及鏈霉素樣品配制取實(shí)施例三墨旱蓮有效組分用二甲基亞砜(DMS0)配置成50iig/ ml, -20°C保存測試步驟96孔板，藥物作用(48h)結(jié)束后，吸去上清培養(yǎng)液，MTT儲(chǔ)備液和完全 培養(yǎng)液以1 10稀釋，每孔加入100 iiL。37°C培養(yǎng)箱里孵育4h。去上清培養(yǎng)液，每孔加入 150 uL DMS0溶解結(jié)晶，500rpm振蕩lOmin，使結(jié)晶充分溶解。550nm測定吸光度，結(jié)果參見 表1。表 1 計(jì)算方法抑制率(％ ) = 100_(篩選組吸光度-空白對(duì)照組吸光度)/(陰性對(duì)照組吸光 度-空白對(duì)照組吸光度)X100結(jié)果表明該墨旱蓮有效組分的抑制率為96. 13%。
權(quán)利要求
一種墨旱蓮有效組分的制備方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)將墨旱蓮藥材粉碎后加入體積比為1∶0.8～1.2的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.8～1.2小時(shí)，提取1～3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，用反相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行分離，首先用體積比為20％-40％的乙醇溶液作為流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，再用體積比為90％-100％的乙醇溶液作為流動(dòng)相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的目的物；制備色譜的分離條件為色譜柱為制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)，流動(dòng)相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9～11ml/min，柱溫為室溫，收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種墨旱蓮有效組分的制備方法，其特征在于，色譜分離后， 在時(shí)間段40. 0 44. Omin收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1方法制備獲得的墨旱蓮有效組分在制備治療、預(yù)防肝臟腫瘤藥物中 的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種墨旱蓮有效組分的應(yīng)用，其特征在于，所制備的藥物還 含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種墨旱蓮有效組分的應(yīng)用，其特征在于所制備的藥物還 含有其他抗腫瘤藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種墨旱蓮有效組分的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的制劑 形式為液體制劑、固體制劑、膠囊劑或膠丸劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種墨旱蓮有效組分的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的給藥 方式為口服給藥或注射給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供一種墨旱蓮有效組分的制備方法，將藥材通過加熱提取，濃縮，硅膠柱分離，洗脫，洗脫液濃縮干燥，再用制備液相色譜繼續(xù)分離，收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明的墨旱蓮有效組分可以作為活性成分，加入藥劑學(xué)上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學(xué)上記載的方法制成制劑。所制備的藥物的制劑形式為液體制劑、固體制劑、膠囊劑或膠丸劑，給藥方式為口服給藥或注射給藥。本發(fā)明提供的墨旱蓮有效組分可在制備治療、預(yù)防腫瘤藥物中應(yīng)用。本發(fā)明的制備方法操作簡便，質(zhì)量穩(wěn)定，且現(xiàn)有技術(shù)中尚未有墨旱蓮抗肝臟腫瘤活性的報(bào)道，為研發(fā)墨旱蓮抗腫瘤新藥提供研究基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101856380SQ201010214799
公開日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者吳斌, 瞿海斌, 程翼宇 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)