專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療過(guò)敏性疾病的藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過(guò)脫敏療法治療螨性過(guò)敏性疾病的藥物及其制備方法。
背景技術(shù)：
過(guò)敏性疾病是當(dāng)今世界上最常見(jiàn)、最頑固的疾患之一，涉及臨床各科。目前有高達(dá)20％的世界人口患有不同類(lèi)型的過(guò)敏性疾病，從新生兒到中老年人各年齡段都有發(fā)生，沒(méi)有明顯的性別傾向，但有明顯的遺傳性?xún)A向。
速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)是一種常見(jiàn)的過(guò)敏反應(yīng)，主要為呼吸道過(guò)敏反應(yīng)、消化道過(guò)敏反應(yīng)、皮膚過(guò)敏反應(yīng)以及過(guò)敏性休克。表現(xiàn)的病癥主要為過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性腸胃炎以及濕疹、蕁麻疹等過(guò)敏性皮膚病。
哮喘被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為疾病中四大頑癥之一，據(jù)WHO的統(tǒng)計(jì)資料顯示，各地患病率約1％-5％不等，我國(guó)患病率接近1％，兒童可高達(dá)2-5％，成人男、女患病率大致相同，約20％的患者有家族史。過(guò)敏性鼻炎在全世界人群中發(fā)病率高達(dá)10％-20％，我國(guó)兒童更高達(dá)30％-40％。隨著全球范圍內(nèi)的空氣污染和環(huán)境惡化，這些疾病的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升態(tài)勢(shì)。
引起過(guò)敏的主要的變應(yīng)原有塵螨、花粉、屋塵、霉菌、羽毛等，其中塵螨是一種強(qiáng)烈的變應(yīng)原，廣泛存在于自然界，具有過(guò)敏素質(zhì)的病人吸入微量的塵螨變應(yīng)原即能引起過(guò)敏性疾病。約有80％的哮喘患者對(duì)塵螨過(guò)敏，兒童對(duì)螨的過(guò)敏比成人多。塵螨是八條腿的節(jié)肢動(dòng)物，大小約0.2-0.4mm，肉眼幾乎無(wú)法看到。大量孳生于床墊、被子、枕頭、沙發(fā)、地毯等織物之中。塵螨一般在春秋季大量繁殖，其生長(zhǎng)的適宜溫度為20-30℃，適宜的相對(duì)濕度為65-80％，主要食物來(lái)源是皮膚脫落的鱗屑。塵螨的分泌物、排泄物、皮屑及死亡的蟲(chóng)體，在細(xì)菌和真菌作用下分解為微小顆粒，飄浮在空氣中，通過(guò)鼻、口呼吸進(jìn)入人體內(nèi)，誘發(fā)過(guò)敏性哮喘、鼻炎、結(jié)膜炎、皮炎。Dermatophagoidesfarinae和Dermatophagoides pteronyssinus是最常見(jiàn)的兩種塵螨，它們的I組，II組變應(yīng)原被認(rèn)為是室內(nèi)灰塵變應(yīng)原的主要來(lái)源。Der f螨多見(jiàn)于北美和日本，Der p螨多見(jiàn)于西歐和澳洲。
I組變應(yīng)原(Derf I，Derp I)是不耐熱的，分子量為24,000的糖蛋白，屬結(jié)構(gòu)同系物并有非常相似的N-端氨基酸序列。這些變應(yīng)原通過(guò)螨蟲(chóng)的胃腸道以螨蟲(chóng)排泄物顆粒的形式以最高濃度排泄出來(lái)。它們可從單獨(dú)的排泄物顆粒中快速洗提(兩分鐘內(nèi))，但從螨蟲(chóng)體中則非常慢地洗提。
II組變應(yīng)原(Derf II，Derp II)是分子量為15,000，有幾乎相同的N-端氨基酸序列的蛋白，也是通過(guò)螨蟲(chóng)的胃腸道以排泄物變應(yīng)原的形式分泌，但沒(méi)有I組變應(yīng)原那么高的濃度。絕大多數(shù)螨蟲(chóng)過(guò)敏性的個(gè)體對(duì)I組、II組變應(yīng)原都能產(chǎn)生抗體。
關(guān)于過(guò)敏性疾病的治療國(guó)內(nèi)外都還不能完全解決，目前主要的預(yù)防和治療措施包括避免接觸變應(yīng)原、藥物治療、免疫治療。
脫敏療法是一種特異性免疫治療(SIT)，是針對(duì)病因的預(yù)防性治療措施。它用能使病人誘致過(guò)敏疾病發(fā)作的變應(yīng)原(如花粉、塵螨等)提取物，通過(guò)反復(fù)注射或口服，劑量由小至大，濃度由稀到濃，使病人逐漸提高對(duì)外來(lái)的變應(yīng)原的耐受性，從而達(dá)到減輕發(fā)作或控制發(fā)作的目的。由于脫敏療法對(duì)部分病人只能達(dá)到降低他們對(duì)變應(yīng)原的敏感性，減輕發(fā)作的目的，所以又稱(chēng)減敏療法。
目前脫敏療法已廣泛用于臨床，對(duì)過(guò)敏性疾病的發(fā)病機(jī)制亦作了深入的研究。一般認(rèn)為血清IgE水平增高是I型變態(tài)反應(yīng)性疾病發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。脫敏治療使患者產(chǎn)生相應(yīng)的阻斷抗體，減少特異性IgE抗體的產(chǎn)生，并與IgE抗體競(jìng)爭(zhēng)，阻斷變應(yīng)原與IgE結(jié)合，增加致敏細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而抑制介質(zhì)細(xì)胞釋放活性介質(zhì)，達(dá)到預(yù)防和治療變態(tài)反應(yīng)疾病的目的。
塵螨變應(yīng)原一般是從螨培養(yǎng)物或螨蟲(chóng)體中分離提取獲得，由于多數(shù)的變應(yīng)原都以排泄物顆粒的形式排泄出來(lái)，故從培養(yǎng)物中提取較為常用。美國(guó)專(zhuān)利6054125，5773010，5747047等專(zhuān)利中描述了以動(dòng)物飼料為粉塵螨培養(yǎng)基，從培養(yǎng)基中提取、分離到各種分子量的粉塵螨純變應(yīng)原；歐洲專(zhuān)利1236394利用黃豆、氨基酸等為粉塵螨培養(yǎng)基也提取、分離到較純的螨變應(yīng)原；美國(guó)專(zhuān)利6423837，6132734，6086897等專(zhuān)利中則描述了通過(guò)克隆、表達(dá)、提取的方式得到不同分子量螨變應(yīng)原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種治療過(guò)敏性疾病(過(guò)敏性哮喘、鼻炎、皮炎、慢性蕁麻疹等)的抗過(guò)敏藥物——螨變應(yīng)原制劑。該制劑利用脫敏治療的原理，通過(guò)服用由小至大劑量的變應(yīng)原，使病人逐步提高對(duì)外來(lái)變應(yīng)原的耐受性，從而達(dá)到減輕發(fā)作或控制發(fā)作的目的。
本發(fā)明公開(kāi)的治療過(guò)敏性疾病的藥物是由主要含有24KD的變應(yīng)原I和15KD的變應(yīng)原II的混合螨變應(yīng)原浸出液制成的各種醫(yī)學(xué)上可接受的制劑，所述的浸出液是將粉塵螨培養(yǎng)基通過(guò)丙酮脫脂、生理鹽水浸出、過(guò)濾等方法而獲得。SDS-PAGE電泳顯示，浸出液中有24KD和15KD等變應(yīng)原蛋白條帶。
本發(fā)明所述的24KD的變應(yīng)原I和15KD的變應(yīng)原II是指DerfI，DerpI或DerfII，DerpII的變應(yīng)原。
本發(fā)明所述制劑是指口服液、注射劑、舌下含服劑等多種液體劑型，或通過(guò)加以適當(dāng)?shù)馁x形劑制備成片劑、膠囊劑等多種其他劑型。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)上述螨變應(yīng)原制劑的制備方法。
本發(fā)明公開(kāi)的螨變應(yīng)原制劑通過(guò)下述技術(shù)方案獲得A螨變應(yīng)原浸出液的制備1)粉塵螨標(biāo)準(zhǔn)種，實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)，95％純種，雜螨不超過(guò)5％，符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)；2)在約300克粉塵螨代謝培養(yǎng)基中，加入適量體積的丙酮，清洗脫脂2-5小時(shí)；傾倒出丙酮，加入新的丙酮，重復(fù)清洗脫脂2次；3)三次脫脂后，傾倒出上層丙酮，保留下層固體，于室溫自然吹干，待殘留粉末中毫無(wú)丙酮刺激性氣味即為丙酮揮干標(biāo)準(zhǔn)；4)取晾干后的粉塵螨代謝培養(yǎng)基按照1∶2-6(W/V)浸于1/萬(wàn)硫柳汞氯化鈉注射液中(即每5毫升生理鹽水中有1克脫脂后的代謝培養(yǎng)基)，4℃磁力攪拌5-9小時(shí)；間隔冷浸過(guò)夜，再磁力攪拌，至少60小時(shí)后取上層清液；5)濾紙去渣；6)0.45μm超濾膜正壓過(guò)濾，得到原液；BCA法(Pierce公司試劑盒)測(cè)原液的蛋白含量；B制劑的制備1)將上述原液用生理鹽水和等體積甘油稀釋?zhuān)凑罩委熕铦舛?，稀釋?∶100(w/v)至1∶1,000,000(w/v)范圍內(nèi)的多個(gè)濃度的制劑；分裝、灌封；56℃滅活1小時(shí)左右除菌，即得舌下含服劑；2)取上述原液按常規(guī)制劑方法制得注射劑、片劑、膠囊劑等。
本發(fā)明公開(kāi)的上述螨變應(yīng)原制劑的制備中所用的粉塵螨培養(yǎng)基是指面粉、動(dòng)物飼料等。
本發(fā)明所要解決的再一技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)上述螨變應(yīng)原制劑在治療過(guò)敏性疾病中的應(yīng)用。
本發(fā)明可用于過(guò)敏性哮喘、鼻炎、慢性蕁麻疹等癥的治療。治療時(shí)，將多個(gè)濃度制劑配合使用。對(duì)患者先使用較低的濃度進(jìn)行治療，然后逐步增加制劑濃度，最后用較高濃度的制劑維持治療。由于不同劑型的藥物被人體吸收的途徑不一樣，所以治療時(shí)使用的初始濃度和維持濃度也不同。如對(duì)于注射劑型，初始制劑的濃度一般為1∶1,000,000(w/v)，維持制劑的濃度一般為1∶5,000(w/v)；而對(duì)于舌下含服劑型，初始制劑的濃度一般為1∶100,000(w/v)，維持制劑的濃度一般為1∶100(w/v)。
用本發(fā)明螨變應(yīng)原制劑對(duì)60例變態(tài)反應(yīng)性鼻炎和/或哮喘患者進(jìn)行口服脫敏治療1～1年半，其癥狀明顯改善，總有效率為88.6％。
提取純抗原來(lái)制備過(guò)敏性疾病藥物(簡(jiǎn)稱(chēng)純抗原藥物)，都利用了昂貴的分離介質(zhì)，經(jīng)過(guò)多步分離、純化，才能得到少量較純的螨變應(yīng)原。其周期長(zhǎng)，費(fèi)用高，工藝復(fù)雜，不適合大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用。與純抗原藥物的制備的方法相比，本發(fā)明制劑制備方法工序簡(jiǎn)單，原料價(jià)廉易得，具有大規(guī)模制備的可行性。
由于在日常生活中接觸多種螨變應(yīng)原，過(guò)敏性疾病患者的病因與多種變應(yīng)原有關(guān)，若僅用單一分子量的抗原組分進(jìn)行治療，則不適用于所有因?yàn)轵^(guò)敏引起疾病的患者。而本發(fā)明包含多種螨變應(yīng)原，治療時(shí)的適用范圍更廣。因此本發(fā)明藥物在過(guò)敏性疾病治療領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景和臨床價(jià)值。


圖1為BCA法測(cè)螨變應(yīng)原浸出液中蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 注射用螨變應(yīng)原制劑的制備1.粉塵螨Dermatophagoides pteronyssinus，標(biāo)準(zhǔn)種，以面粉作為培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)，95％純種，雜螨不超過(guò)5％，符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)；2.在310克粉塵螨的培養(yǎng)基中加入500毫升的丙酮，清洗脫脂2小時(shí)，傾倒出丙酮；再加入400毫升丙酮，清洗脫脂2小時(shí)，傾倒出丙酮；再加入400毫升丙酮，清洗脫脂3小時(shí)；3.三次脫脂后，傾倒出上層丙酮，保留下層固體，于室溫自然吹干，待殘留粉末中毫無(wú)丙酮刺激性氣味即為丙酮揮干標(biāo)準(zhǔn)；4.取晾干后的粉塵螨代謝培養(yǎng)基按照1∶2(W/V)浸于1/萬(wàn)硫柳汞氯化鈉注射液中(即每5毫升生理鹽水中有1克脫脂后的代謝培養(yǎng)基)，4℃磁力攪拌6小時(shí)。間隔冷浸過(guò)夜，再磁力攪拌，65小時(shí)后取上層清液；5.濾紙去渣；6. 0.45μm超濾膜正壓過(guò)濾，得到原液；7.BCA法測(cè)原液的蛋白含量(具體步驟見(jiàn)實(shí)施例2)。
8.將上述原液用生理鹽水，從低濃度到高濃度依次稀釋成1∶1000000、1∶100000、1∶10000、1∶5000(w/v)四個(gè)濃度的注射液；9.分裝、灌封；10. 56℃滅活1小時(shí)，除菌。
實(shí)施例2 原液中蛋白含量的測(cè)定選用Pierce公司的BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定塵螨浸出液原液中蛋白含量，按下列步驟進(jìn)行1.將實(shí)施例1中提取到的變應(yīng)原浸出液原液稀釋10倍，作為待測(cè)樣品；2.分別量取50ml的BCA試劑A和1ml的BCA試劑B至燒杯內(nèi)，充分混合，配制成工作液；3.將BSA(白蛋白)濃度為2mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為以下一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使其中BSA終濃度分別為2000μg/ml、1500μg/ml、1000μg/ml、750μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml；4.分別吸取待測(cè)樣品10μl、上述系列標(biāo)準(zhǔn)品10μl至試管中，空白管中則加入10μl的蒸餾水；5.在每一試管中加入200μl的工作液，混勻；6.室溫反應(yīng)2小時(shí)；7.以蒸餾水作對(duì)照，在562nm波長(zhǎng)下測(cè)各管的吸收值；8.各吸收值減去空白管的吸收值，作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1；9.樣品的平均吸收值為0.925，由標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀得所測(cè)溶液中蛋白含量為610μg/ml，再乘以稀釋倍數(shù)10，計(jì)算得提取的螨浸出液原液中蛋白含量為6.1mg/ml。
實(shí)施例3 舌下含服螨變應(yīng)原制劑的制備1.粉塵螨Dermatophagoides farinae Hughes，標(biāo)準(zhǔn)種，以動(dòng)物飼料為培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)，95％純種，雜螨不超過(guò)5％，符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)；2.按實(shí)施例1中2-7的步驟提取得螨變應(yīng)原浸出液原液；3.將上述原液用生理鹽水和等體積甘油，從低濃度到高濃度依次稀釋成1號(hào)-1∶100,000(w/v)；2號(hào)-1∶10,000(w/v)；3號(hào)-1∶1,000(w/v)；4號(hào)-1∶500(w/v)；5號(hào)-1∶100(w/v)五個(gè)濃度的舌下含服滴劑；4.分裝、灌封；5. 56℃滅活1小時(shí)，除菌。
實(shí)施例4 舌下含服螨變應(yīng)原制劑用于治療過(guò)敏性疾病1.患者60例，男，26例，女，34例，年齡4～46歲，病程1～5年，平均2.6年。確診為變應(yīng)性鼻炎34例，哮喘6例，變應(yīng)性鼻炎合并哮喘20例。在醫(yī)院作變應(yīng)原皮試60例均為螨陽(yáng)性(皮丘直徑8毫米以上)?？诜儜?yīng)原制劑1年。
2.治療藥物如實(shí)施例3所制得的舌下含服螨變應(yīng)原滴劑。
3.治療方法滴在舌下，含1～2分鐘，任口腔自然吸收。第一月從1號(hào)液到3號(hào)液，每一號(hào)逐日遞增滴數(shù)，各服用一周；第四周起改為4號(hào)維持劑量，服用2周，自第6周起服用5號(hào)維持劑量1年。
4.結(jié)果隨訪12～18個(gè)月，60例患者中顯效23例，有效30例，無(wú)效7例，有效率為88.6％。80％患者在一月之內(nèi)起效。
權(quán)利要求
1.一種治療過(guò)敏性疾病的藥物，其特征在于該藥物是由主要含有24KD的變應(yīng)原I和15KD的變應(yīng)原II的混合螨變應(yīng)原浸出液制成的各種醫(yī)學(xué)上可接受的制劑。
2.一種如權(quán)利要求1所述的治療過(guò)敏性疾病的藥物，其特征在于其中所述的螨浸出液是將標(biāo)準(zhǔn)種粉塵螨的代謝培養(yǎng)基通過(guò)丙酮脫脂、生理鹽水浸出、超濾、稀釋等方法而獲得。
3.一種如權(quán)利要求1所述的治療過(guò)敏性疾病的藥物，其特征在于其中所述的制劑包括口服液、注射劑、舌下含服劑、片劑、膠囊劑等多種劑型。
4.一種如權(quán)利要求1所述的治療過(guò)敏性疾病的藥物，其特征在于其中所述的24KD的變應(yīng)原I和15KD的變應(yīng)原II是指DerfI或DerpI和DerfII或DerpII的變應(yīng)原。
5.一種如權(quán)利要求2所述的治療過(guò)敏性疾病的藥物，其特征在于其中所述的粉塵螨培養(yǎng)基選自面粉、動(dòng)物飼料等。
6.一種如權(quán)利要求1所述的治療過(guò)敏性疾病的藥物的制備方法，其特征在于該制劑的制備包括下列步驟A螨變應(yīng)原浸出液的制備1)粉塵螨標(biāo)準(zhǔn)種，實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)，95％純種，雜螨不超過(guò)5％，符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)；2)在約300克粉塵螨代謝培養(yǎng)基中，加入適量體積的丙酮，清洗脫脂2-5小時(shí)；傾倒出丙酮，加入新的丙酮，重復(fù)清洗脫脂2次；3)三次脫脂后，傾倒出上層丙酮，保留下層固體，于室溫自然吹干，待殘留粉末中毫無(wú)丙酮刺激性氣味即為丙酮揮干標(biāo)準(zhǔn)；4)取晾干后的粉塵螨代謝培養(yǎng)基按照1∶2-6W/V浸于1/萬(wàn)硫柳汞氯化鈉注射液中，即每5毫升生理鹽水中有1克脫脂后的代謝培養(yǎng)基，4℃磁力攪拌5-9小時(shí)；間隔冷浸過(guò)夜，再磁力攪拌，至少60小時(shí)后取上層清液；5)濾紙去渣；6)0.45μm超濾膜正壓過(guò)濾，得到原液；BCA法測(cè)原液的蛋白含量；B制劑的制備1)將上述原液用生理鹽水和等體積甘油稀釋?zhuān)凑罩委熕铦舛龋♂尦?∶100w/v至1∶1,000,000w/v范圍內(nèi)的多個(gè)濃度的制劑；分裝、灌封；56℃滅活1小時(shí)左右除菌，即得舌下含服劑；2)取上述原液按常規(guī)制劑方法制得注射劑、片劑、膠囊劑等。
7一種如權(quán)利要求1所述的藥物在制備治療過(guò)敏性疾病藥物中的應(yīng)用。
8.一種如權(quán)利要求6所述的藥物的應(yīng)用，其特征在于該藥物可用于制備治療過(guò)敏性哮喘、鼻炎、慢性蕁麻疹等癥的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)脫敏療法治療過(guò)敏性疾病的藥物。該藥物是由主要含有24KD的變應(yīng)原I和15KD的變應(yīng)原II的混合螨變應(yīng)原浸出液制成的各種醫(yī)學(xué)上可接受的制劑，所述的浸出液是將粉塵螨培養(yǎng)基通過(guò)丙酮脫脂、生理鹽水浸出、過(guò)濾等方法而獲得。本發(fā)明利用脫敏治療的原理，通過(guò)依次吸收由小至大劑量的藥物，使病人逐步提高對(duì)外來(lái)變應(yīng)原的耐受性，從而達(dá)到減輕發(fā)作或控制發(fā)作的目的，可用于過(guò)敏性哮喘、鼻炎、慢性蕁麻疹等癥的治療。
文檔編號(hào)A61K39/002GK1491723SQ0213762
公開(kāi)日2004年4月28日 申請(qǐng)日期2002年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月24日
發(fā)明者胡賡熙 申請(qǐng)人:胡賡熙