專利名稱：：一種曲霉纖維素酶菌種的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種曲霉纖維素酶菌種的制備方法及這種菌種在釀造工業(yè)中的應(yīng)用，具體地說(shuō)是提供一種被稱為EA181的曲霉纖維素酶變株的生產(chǎn)方法及利用所生產(chǎn)的曲霉纖酶EA181在釀造工業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用。近二十年世界各國(guó)對(duì)纖維素酶的研究進(jìn)展較快，日本已在食品加工、釀造、醫(yī)藥、化工等方面獲得廣泛應(yīng)用。美國(guó)、巴西、印度、蘇聯(lián)等國(guó)開(kāi)展利用纖維素酶水解工業(yè)廢纖維發(fā)酵酒精的研究已進(jìn)入中試階段，但是所用纖維素酶活力較低。我國(guó)曾在白酒生產(chǎn)、醬油釀造、食品加工與提高粗飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等方面進(jìn)行過(guò)纖維素酶的應(yīng)用研究。但由于菌種活力較低，成本較高，菌種多屬木霉，有毒性嫌疑，在食品發(fā)酵工業(yè)中未獲得實(shí)際應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種制備高活力纖維素酶菌種的方法，并將所制備的高活力菌種應(yīng)用于食品釀造工業(yè)的生產(chǎn)中。本發(fā)明的曲霉纖維素酶菌種從具有纖維素酶活性的野生菌株分離、篩選出菌株，稱原菌株，對(duì)其進(jìn)行紫外線、秋水仙堿、硫酸二甲脂，亞硝酸及亞硝基胍中二種或多種過(guò)程。連續(xù)誘變處理而獲得的一種高活性纖維素酶變株。這種原菌株菌落特征為在查氏瓊脂25℃7天菌落直徑4.0～4.6cm，中間灰白色、邊緣褐色、絨毛狀，從中心到邊緣均有溝紋，背面中央淺褐色，邊緣白色，10天菌落5.5～6.0cm，邊緣淡紫色與形成黑色分生孢子，中央白色帶淺黃，14天部分中心區(qū)孢子也呈黑色，背面中央淺褐色，邊緣白褐色。分生孢子頭成束，頂端散開(kāi)，部分分叉，分生孢子梗光滑無(wú)色，小梗單層，淺褐色，頂囊淺褐色16-24×18-28μ，分生孢子圓形，黑色有明顯小刺，根據(jù)曲霉鑒定手冊(cè)(Raper.K.B.etal.thegenusAspergillus.Williamasandwilkinsco.Baltimore.293～3441965)此菌株鑒定為黑曲霉群(AsPergillusniger)，日本曲霉(Aspergillusjaponicus)。由這種原菌株經(jīng)誘變育種而得到的本發(fā)明制備的新的高活力曲霉纖維素酶EA181變株現(xiàn)，寄存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，登記入冊(cè)的編號(hào)為160。EA181變株培養(yǎng)特征為生成較原菌株慢，在查氏瓊脂25℃7天菌落直徑3.5～4.0cm，背面淡黃色，10天，菌落5.5～6.0cm，中間白色轉(zhuǎn)灰黃，帶淡紫色，有放射狀溝紋，14天中間淡紫色，邊緣孢子呈器色。此菌株最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分為以花生秸、苞米秸、谷草、稗草粉為碳源，用麩皮作氮源，再加以不同無(wú)機(jī)氮作補(bǔ)充氮源配成的營(yíng)養(yǎng)鹽溶液PH5.9～6.2進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)EA181變株均能良好生長(zhǎng)。但酶活性以谷草粉為碳源，硝酸銨、硝酸鈉或硫酸銨的一種或二種混合無(wú)機(jī)鹽溶液為補(bǔ)充氮源配成的培養(yǎng)基為最佳成份，且麩皮占固體粉料10～40%(重)，營(yíng)養(yǎng)鹽溶液中無(wú)機(jī)氮含量占總N量0.1～1%(重)，其較佳用量為0.2～0.4%(重)。此外，最適產(chǎn)酶PH值為5.9～6.2，溫度為28～30℃，培養(yǎng)時(shí)間為120～150小時(shí)。為測(cè)酶活性，對(duì)固態(tài)曲酶活性測(cè)定是先將2克生成好的三角瓶固態(tài)曲，加水40ml，于30℃保溫1小時(shí)，過(guò)濾得1∶20酶提取液，用DNS定糖的方法測(cè)定此酶液分解CMC(羧甲基纖維素鈉)、濾紙、棉花與β-葡萄糖苷(水楊苷)酶活性，液體曲是直接用濾紙過(guò)濾同上法測(cè)定酶活性。下面通過(guò)實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明提供的新EA181變株的制備過(guò)程和在釀造工業(yè)上的應(yīng)用。實(shí)例1曲霉原菌株誘變、育種對(duì)曲霉原菌株進(jìn)行紫外線、秋水仙堿、硫酸二甲酯等連續(xù)誘變處理可獲得高活性曲霉纖維素酶EA181，其誘變處理過(guò)程對(duì)變株酶活性的影響如表1。表1不同誘變處理對(duì)變株酶活性的影響由表1所示結(jié)果，原菌株經(jīng)連續(xù)誘變處理累計(jì)提高分解CMC與濾紙酶活性3倍，棉花酶活性3.7-3.9倍，本發(fā)明選定最后處理得到的變株為EA181。實(shí)例2，EA181變株制備用實(shí)例1得到EA181變株菌株，以谷草粉7克，麩皮3克，營(yíng)養(yǎng)鹽溶液(NaNO3和(NH4)2SO4分別取溶液重量的1.5%，0.8%)25ml配成培養(yǎng)基，PH5.9～6.2，菌株培養(yǎng)120～140小時(shí)。得到產(chǎn)品EA181變株酶活性測(cè)定為，該酶分解CMC，濾紙，棉花及水楊苷酶活性分別為7600～8100;270～310;380～410及2300～2600mg葡萄糖/gh。實(shí)例3，EA181變株毒性試驗(yàn)利用實(shí)例2制備出的EA181曲霉纖維素酶進(jìn)行毒性試驗(yàn)，試驗(yàn)小白鼠10只，試驗(yàn)前停食24小時(shí)，按各小白鼠重發(fā)給以80g/kg的劑量制成飼料分籠飼養(yǎng)4小時(shí)后含藥料塊全部食完，觀察7天，被試驗(yàn)小白鼠無(wú)任何毒性反應(yīng)，飲食正常，毛色有光澤，體重增加，證明此菌酶制劑無(wú)毒性。實(shí)例4，EA181曲霉用于果汁提取試驗(yàn)條件先把果品用組織搗碎器打漿，桔子與葡萄為原汁漿，蘋(píng)果加20%水打漿，然后取果漿200～250g，加酶液4～10ml(固態(tài)曲加4倍水提取)，對(duì)照加等體積水，28～50℃保溫4～5小時(shí)，用多層紗布手?jǐn)D壓汁。試驗(yàn)結(jié)果列于表2，在5%酶液用量(對(duì)果漿比)條件下提高桔子汁產(chǎn)率15.2%，蘋(píng)果汁10%，葡萄汁7.5%，果汁糖度也有所增加。表2EA181曲酶對(duì)提取果汁產(chǎn)率的影響</tables>實(shí)例5EA181曲霉用于酒精發(fā)酵試驗(yàn)條件苞米面60g，加220ml水，在水溶中糊化成漿狀，冷卻至70℃，加淀粉酶液化半小時(shí)，1kg/cm2滅菌30分鐘，加糖化酶0.2g纖維素酶曲0.6g，對(duì)照只加糖化酶，50℃保溫1小時(shí)，冷卻后接種液體酵母菌種13.5ml，不同培養(yǎng)時(shí)間取樣測(cè)定發(fā)酵液酒精含量，殘?zhí)羌癙H。其結(jié)果如表3。表3EA181曲酶對(duì)酒精發(fā)酵產(chǎn)率的作用</tables>由表3所示結(jié)果，加EA181曲酶的酒精發(fā)酵比對(duì)照旺盛，發(fā)酵周期明顯縮短，30小時(shí)發(fā)酵已趨終止，酒精含量達(dá)到高峰，此時(shí)發(fā)酵液的酒精含量為9.17/，對(duì)照為7.44%，提高產(chǎn)率23.3%。此外，EA181曲酶不僅提高了發(fā)酵原料的利用率，而且還提高了發(fā)酵糖的利用速度。由上述實(shí)例，本發(fā)明方法制備出的曲酶EA181變株，具有較高的活性，其制備過(guò)程簡(jiǎn)單、且成本低。此外，這種新曲酶變株無(wú)毒，在提取果汁與酒精發(fā)酵等食品業(yè)使用可顯著提高產(chǎn)率，例如可提高桔子汁產(chǎn)率15.2%，蘋(píng)果汁10%，葡萄汁7.5%，酒精發(fā)酵產(chǎn)率7.2%，白酒產(chǎn)率7～8%具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益。權(quán)利要求1.一種曲霉纖維素酶菌種的制備方法，其特征在于該菌株是從具有纖維素酶活性的野生菌株分離，篩選出菌株，對(duì)其進(jìn)行紫外線，秋水仙堿、硫酸二甲脂、亞硝酸及亞硝基胍中二種或多種過(guò)程連續(xù)誘變處理而獲得的一種高活性纖維素酶變株，此菌株鑒定為黑曲霉群，日本曲霉，該菌株寄存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，登記人冊(cè)的編號(hào)為160；該菌株可在以花生秸、苞米秸、谷草、稗草粉為碳源，用麩皮作氮源再加以不同無(wú)機(jī)氮作補(bǔ)充氮源配成的營(yíng)養(yǎng)鹽溶液配成的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)產(chǎn)酶。2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基成分中碳源最好采用谷草粉，且麩皮與固體粉料10～40%(重)。3.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)基成分中營(yíng)養(yǎng)鹽溶液中無(wú)機(jī)氮含量占氮量0.1～1%(重)，其較佳用量為0.2～0.4%(重)。4.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于菌株生產(chǎn)過(guò)程中最適產(chǎn)酶PH值為5.9～6.2，溫度為28～30℃，培養(yǎng)時(shí)間為120～150小時(shí)。5.一種利用權(quán)利要求1所述方法制備出的曲霉纖維素酶的應(yīng)用，其特征在于該菌株可用食品釀造工業(yè)，例如可用于提高果汁提取率，酒精發(fā)酵率和白酒產(chǎn)率。全文摘要一種被稱之為EA181的曲霉纖維素酶變株的生產(chǎn)方法是從野生菌株分離，篩選出菌株，進(jìn)行紫外線，秋水仙堿，硫酸二甲酯等連續(xù)誘變處理而獲得的一種高活性曲霉變株。該曲霉被鑒定為黑曲霉群，日本曲霉(Aspergillusjapohicus)。適合EA181變株的最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分為，谷草粉、麥皮及營(yíng)養(yǎng)鹽溶液(硝酸銨、硝酸鈉、硫酸銨等)。EA181曲酶不僅活性高，制備過(guò)程簡(jiǎn)單，且無(wú)毒。在提取果汁與酒精發(fā)酵等食品業(yè)使用可顯著提高產(chǎn)率，可提高桔子汁產(chǎn)率15.2％，蘋(píng)果汁10％，葡萄汁7.5％，酒精發(fā)酵產(chǎn)率7.2％，白酒產(chǎn)率7～8％，具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益。文檔編號(hào)C12N1/14GK1062167SQ9010645公開(kāi)日1992年6月24日申請(qǐng)日期1990年12月5日優(yōu)先權(quán)日1990年12月5日發(fā)明者王義甫,唐桂馥,陳源,張道海申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所