專利名稱：一種高通量篩選降解秸稈高活力纖維素酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種高通量篩選降解秸稈高活力纖維素酶的方法，為一種新的纖維素酶篩選方法，屬于生物酶檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，測定纖維素酶的活性通常使用國際純化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)學(xué)會(IUPAC)的濾紙酶活測定方法，主要因為該方法重復(fù)性好。但是，這種方法也存在操作繁瑣，耗時耗力等缺點，而且這種方法只適用于測量小規(guī)模的樣品，對大規(guī)模篩選纖維素酶就不適用了，尤其在篩選可高效降解秸稈的纖維素酶時，傳統(tǒng)的測酶活方法就更無能為力了。人們一般利用霉菌生產(chǎn)纖維素酶，因為霉菌可以分泌降解纖維素的纖維素酶。能夠產(chǎn)生纖維素酶的霉菌在自然界中大量存在，人們雖然分離出一些菌株，并對這些菌株進行了誘變，但是，還可以從自然界中篩選可以用于工業(yè)生產(chǎn)的菌株，或者，對已經(jīng)分離得到的菌株進行誘變，以得到產(chǎn)高活力纖維素酶的菌株。篩選高產(chǎn)菌株是一個耗時耗力的工作， 如果沒有好的篩選方法，很難得到高產(chǎn)的菌株。利用IUPAC的方法，一個一個地測各個菌株的活力，因為工作量太大，在實踐中是不可行的。纖維素酶可以降解很多種纖維質(zhì)物質(zhì)，比如濾紙、微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、 木屑和秸稈等等，國際上通用的測纖維素酶活力的底物是濾紙，利用濾紙做底物具有重現(xiàn)性好的優(yōu)點，但是，用濾紙做底物測出的酶活高的纖維素酶對其它底物(如秸稈、微晶纖維素)的降解能力卻不一定高，這是因為自然界中的纖維質(zhì)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)各有不同，不同的纖維質(zhì)的聚合度和結(jié)晶度各有不同，另外，纖維素往往會和木質(zhì)素、半纖維素等物質(zhì)混雜糾結(jié)在一起，這就造成同一纖維素酶對不同的底物具有不同的活性。利用生物基原料生產(chǎn)燃料乙醇是各國進行可再生能源生產(chǎn)的重要措施，我國生產(chǎn)燃料乙醇的主要原料是玉米，近年來，我國提出發(fā)展燃料乙醇要不與人爭糧、不與糧爭地， 所以，利用秸稈生產(chǎn)燃料乙醇是大勢所趨。纖維素酶是用秸稈生產(chǎn)乙醇生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵用酶，它可以將纖維素水解成葡萄糖，葡萄糖再經(jīng)過發(fā)酵生成乙醇。篩選到能高效降解秸稈的纖維素酶和它的生產(chǎn)菌株是一項非常重要的工作。雖然近年來有一些關(guān)于篩選高活力纖維素酶的方法，但是，這些方法要么是針對纖維素酶的某種活力，比如內(nèi)切酶活力進行篩選，要么是針對濾紙酶活進行篩選，通過這些方法篩選出的高活力酶在水解秸稈時的酶活不一定高。為了克服上述方法的缺點，本發(fā)明提出了一種高通量的篩選方法，利用這種方法可以快速地將高活力的纖維素酶篩選出來，經(jīng)檢索未見有公開相關(guān)文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開一種高通量篩選降解秸稈高活力纖維素酶的方法，以秸稈作為底物， 利用96孔板進行高通量篩選，克服了傳統(tǒng)的濾紙酶活測定方法操作繁瑣，耗時耗力等缺點，適用大規(guī)模篩選降解秸稈的纖維素酶檢測。
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本發(fā)明的高通量篩選降解秸稈高活力纖維素酶的方法，采用如下技術(shù)解決方案
1)在磁力攪拌的情況下，向96孔板中每孔加汽爆的秸稈粉懸液，所加的汽爆過的秸稈粉懸液要適量，經(jīng)試驗優(yōu)選量為10-100 μ L ；
2)將適當(dāng)稀釋纖維素酶加入每孔中，混勻，酶液的量控制在10-40μL ；
3)密封后，恒溫浴一段時間，恒溫水浴時一定要密封，并且控制溫度在40-60°C最優(yōu)，時間控制在50-70min ；
4)向每孔再加適量DNS，混勻，所加DNS的量要適中，才能保證變色區(qū)分明顯，線性良好，一般的DNS添加量為100-140 μ L ；
5)密封，一定溫度熱水浴適當(dāng)時間，溫度控制在90-100°C最優(yōu)，5-lOmin之后，放入冷水浴；
6)反應(yīng)后靜置一段時間，靜止的時間要適中，以利于染色的穩(wěn)定，實驗證明控制在1-2 小時最優(yōu)；
7)另取一96微孔板，并將反應(yīng)液取適量加到相應(yīng)的孔道中并適當(dāng)稀釋，由于其反應(yīng)體系的容量小，使得在酶解反應(yīng)和顯色反應(yīng)時的蒸發(fā)損失對結(jié)果產(chǎn)生較大的影響；因此要采取適當(dāng)?shù)拇胧﹣肀M量減少蒸發(fā)損失，如將加完樣品的微孔板用封膜密封后再蓋上一塊塑料蓋；
8)在適當(dāng)波長下處測吸光度。測吸光度測定要在還原糖變色后的最大紫外吸收峰處， 約為MOnm。本發(fā)明的積極效果在于采取96微孔板法測定降解秸稈粉酶活，在標(biāo)準FPA方法的基礎(chǔ)上，改用秸稈粉為反應(yīng)底物，建立一種高通量篩選方法，可以簡便快速的從大量菌株中選出用于降解秸稈的纖維素酶高產(chǎn)菌株，有利于發(fā)現(xiàn)和改造用于工業(yè)化生產(chǎn)所需的菌種。


圖1為本發(fā)明測定霉菌SYZ)(6所產(chǎn)纖維素酶降解秸稈酶活圖； 圖2本發(fā)明測定霉菌里氏木霉ATCC56765和里氏木霉ATCC56764所產(chǎn)纖維素酶降解秸稈酶活圖。
具體實施例方式實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述實施例。下述實施例及試驗中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1
96微孔板法測定土壤樣品中分離出的霉菌iSiTm所產(chǎn)纖維素酶降解秸稈粉酶活 (60 μ L反應(yīng)體系，所有溶液的配制和稀釋都用檸檬酸緩沖液)
(1)在96孔板中每孔加乳40μ L的秸稈粉懸液(在用磁力攪拌的情況下進行)；
(2)然后將20μL的適當(dāng)稀釋纖維素酶液加入每孔中，混勻；
(3)密封后，50°C溫浴60min；
(4)向每孔再加120μ L DNS，混勻；
(5)密封，100°C溫浴5min后放入冷水??；(6)反應(yīng)后靜置1-2小時；
(7)另取一96微孔板，并將反應(yīng)液取100 μ L加到相應(yīng)的孔道中；
(8)在MOnm處測吸光度；
(9)計算得到酶活為0.2977U/ml,誤差范圍在5%以內(nèi)(見圖1)。一個活力單位(U)被定義為在測定纖維素酶水解秸稈反應(yīng)時，每分鐘釋放1 μ moL 葡萄糖所用酶量。從結(jié)果上看，利用96孔板高通量測纖維素酶降解秸稈的活力時，結(jié)果平行，誤差范圍在5%以內(nèi)，重現(xiàn)性好。實施例2，
96微孔板法測定里氏木霉ATCC56765和里氏木霉ATCC56764所產(chǎn)纖維素酶降解秸稈粉酶活(60 μ L反應(yīng)體系，所有溶液的配制和稀釋都用檸檬酸緩沖液)
(1)在96孔板中每孔加乳40μ L的秸稈粉懸液(在用磁力攪拌的情況下加入)；
(2)選取48個孔，將ATCC56764所產(chǎn)纖維素酶酶液各20μ L的加入每孔中，混勻；將 ATCC56765所產(chǎn)纖維素酶酶液各20 μ L的加入其它的48孔內(nèi)
(3)密封后，50°C溫浴60min；
(4)向每孔再加120μ L DNS，混勻；
(5)密封，100°C溫浴5min后放入冷水??；
(6)反應(yīng)后靜置1小時；
(7)另取一96微孔板，并將反應(yīng)液取100 μ L加到相應(yīng)的孔道中并適當(dāng)稀釋；
(8)在MOnm處測吸光度；
(9)計算得到ATCC56765所產(chǎn)纖維素酶平均酶活為0.5357U/ml，誤差范圍在5%以內(nèi)。 ATCC56764酶活為0. 2658U/ml,誤差范圍在5%以內(nèi)(見圖2)。從結(jié)果上看，利用96孔板高通量比較兩種纖維素酶降解秸稈的活力時，同種酶結(jié)果平行，誤差范圍在5%以內(nèi)。對兩種酶的酶活進行比較，差異顯著，重現(xiàn)性好。
權(quán)利要求
1. 一種高通量篩選降解秸稈高活力纖維素酶的方法，包括以下步驟1)在磁力攪拌的情況下，向96孔板中每孔加10-100μ L汽爆的秸稈粉懸液；2)將10-40μ L纖維素酶加入每孔中，混勻；3)密封后，40-60°C恒溫水浴50-70min；4)向每孔再加100-140μ L的DNS，混勻；5)密封，90-100°C熱水浴5-10min之后，放入冷水??；6)反應(yīng)后靜置1-2小時；7)另取一塊96微孔板，并將反應(yīng)液加到相應(yīng)的孔道中；8)在適當(dāng)波長下處測吸光度，測吸光度測定要在還原糖變色后的最大紫外吸收峰處， 約為MOnm。
全文摘要
本發(fā)明提供一種高通量篩選降解秸稈高活力纖維素酶的方法，為一種新的纖維素酶篩選方法，采取96微孔板法測定降解秸稈粉酶活，在標(biāo)準FPA方法的基礎(chǔ)上，改用秸稈粉為反應(yīng)底物，建立一種高通量篩選方法，可以簡便快速的從大量菌株中選出用于降解秸稈的纖維素酶高產(chǎn)菌株，有利于發(fā)現(xiàn)和改造用于工業(yè)化生產(chǎn)所需的菌種。
文檔編號G01N21/33GK102212608SQ201110093108
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月14日
發(fā)明者任曉冬, 劉艷, 姚棟, 孟慶繁, 李碩, 藤利榮, 逯家輝 申請人:吉林大學(xué)