一株耐高溫Spathaspora passalidarum突變株及其在發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公布了一株耐高溫Spathaspora passalidarum突變株及其在發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用，屬于微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。為了解決一般的工業(yè)發(fā)酵微生物如釀酒酵母不能利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的問題，本發(fā)明提供了一株新的酵母菌株-Spathaspora passalidarum U-30，該菌株已于2014年10月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No:9863。所述菌株通過原始菌株紫外誘變得來，在37℃下?lián)u瓶發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量比原始菌株提高了36.5％，其溫度耐受性提高到41℃，乙醇耐受性提高到12％。CGMCC No.986320141028
【專利說明】_株耐高溫Spathaspora passa I i darum突變株及其在發(fā) 酵木糖產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株經(jīng)過紫外誘變篩選獲得的耐高溫 的酵母菌Spathaspora passalidarumU-30及其利用木糖生產(chǎn)乙醇的方法。

【背景技術(shù)】：
[0002] 隨著石油能源的瀕臨耗盡，以及以玉米等農(nóng)作物為原料的第一代生物乙醇威脅到 糧食安全，利用來自農(nóng)業(yè)，工業(yè)，林業(yè)和城市廢棄物中的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)為原料生產(chǎn)的第 二代生物乙醇越來越受到各大國的關(guān)注。木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源。利用 木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇是解決能源危機、資源危機以及環(huán)境污染的一種有效方法。 木質(zhì)纖維素原料中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素所占比例約為4 :3 :3,其中半纖維素的主要水 解產(chǎn)物為木糖，是木質(zhì)纖維素原料中第二大糖類。由木糖轉(zhuǎn)化得到的乙醇的產(chǎn)率決定了木 質(zhì)纖維素原料轉(zhuǎn)化為乙醇的轉(zhuǎn)化效率。
[0003] 對于一般的工業(yè)發(fā)酵微生物如釀酒酵母并不能利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇。天然的木糖 發(fā)酵酵母如樹干畢赤酵母，雖然可以有效的發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇，但在利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙 醇時，菌株會被預(yù)處理木質(zhì)纖維素原料所產(chǎn)生的化合物所抑制。更重要的是，樹干畢赤酵母 在混糖發(fā)酵時，葡萄糖的存在會抑制木糖的利用。Spathaspora passalidarum是一株最近 發(fā)現(xiàn)可以天然利用木糖發(fā)酵的新型酵母。研宄發(fā)現(xiàn)，在氧氣限制條件下利用木糖的速度高 于利用葡萄糖的速度，可以利用木質(zhì)纖維素水解液中的葡萄糖、木糖、纖維二糖混合發(fā)酵， 且葡萄糖的存在對木糖發(fā)酵沒有抑制作用。
[0004] 高溫發(fā)酵對于乙醇生產(chǎn)具有重要意義，提高發(fā)酵溫度可以降低設(shè)備冷卻能耗，減 少冷卻水用量，從而有效降低乙醇生產(chǎn)成本。同時，對于糖化和發(fā)酵同步進行的工藝而言， 要求盡量提高發(fā)酵溫度，使之與糖化溫度匹配，具有高溫發(fā)酵能力的菌株更具工業(yè)應(yīng)用潛 力。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一株耐高溫的Spathaspora passalidarum突變株及其利 用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法。
[0006] 以Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907為出發(fā)菌株進行紫外誘變，誘變后 利用試管進行初篩，搖瓶發(fā)酵進行復(fù)篩，得到一株酒精耐受性及溫度耐受性均優(yōu)于原始菌 株的突變株U-30。
[0007] 所述 Spathaspora passalidarum 突變株是由 Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907為出發(fā)菌株經(jīng)紫外誘變篩選后獲得，具體為Spathaspora passalidarum U-30,該 菌株已于2014年10月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡 稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），保藏編號為CGMCC No:9863。
[0008] 所述菌株在37°C下?lián)u瓶發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量比原始菌株提高了 36. 5%，其溫度耐受 性提高到41 °C，乙醇耐受性提高到12%。
[0009] 所述菌株最適生長溫度為28 °C，pH為5. 5。
[0010] 所述菌株發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的方法如下：
[0011] ⑴種子液的獲得：從斜面挑一環(huán)菌到至YPD液體培養(yǎng)基，30°C，180rpm培養(yǎng)12h， 從一級培養(yǎng)基中按照1%的接種量相同條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期為備用種子液。
[0012] (2)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)或發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：
[0013] 發(fā)酵培養(yǎng)基：木糖60?100g/L，玉米漿15?25g/L，磷酸二氫鉀2. 5g/L，七水硫 酸鎂 0· lg/L，ρΗ4· 5 ?5. 5.
[0014] 搖瓶發(fā)酵條件：接種量5?10%，溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速120?150rpm，裝液量80? 120/250mL。
[0015] 發(fā)酵罐發(fā)酵條件：接種量5?10 %，溫度30°C，轉(zhuǎn)速120?300rpm，裝液量50? 80%，通氣量 0· 02 ?0· 05v/v · min。
[0016] 有益效果：
[0017] 1、和原始菌株相比，在杜氏管試驗中，原菌在40°C基本已不再產(chǎn)氣，而U-30在 40°C產(chǎn)氣速度較快，在41°C條件下仍能夠產(chǎn)氣，可見U-30比原菌耐高溫能力強。原菌在乙 醇濃度為10 %時能夠產(chǎn)氣，但當乙醇濃度為12 %時就不再發(fā)酵產(chǎn)氣；U-30在乙醇濃度達到 12%時，仍能產(chǎn)氣。可見，U-30比原菌的乙醇耐受性強。
[0018] 2、突變株U-30在高溫條件下乙醇發(fā)酵性能顯著提高，在37°C下?lián)u瓶發(fā)酵的乙醇 產(chǎn)量為16. 45g/L，比原始菌株提高了 36. 5%;突變株在30°C，搖瓶發(fā)酵條件下發(fā)酵5天，乙 醇濃度達到39. 04g/L，乙醇得率為0. 39g/g，木糖利用率為100%，生產(chǎn)速率為0. 325g/L *h， 而原菌的乙醇得率為0. 30g/g，和原菌相比提高了 30% ;突變株在30°C，5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵 時間縮短為72h，木糖利用率100%，乙醇濃度達到39. 875g/L，乙醇得率為0. 40g/g，達到理 論得率的87%，生產(chǎn)速率達到0. 553g/L *h，原菌的乙醇得率為0. 32g/g?？梢?，突變株無論 是在高溫、低溫、搖瓶或發(fā)酵罐利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇過程中的性能均優(yōu)于原始菌株。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0019] 圖I U-30和原菌在5L發(fā)酵罐中的木糖消耗；
[0020] 圖2 U-30和原菌在5L發(fā)酵罐中的乙醇產(chǎn)量。

【具體實施方式】：
[0021] 下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段 均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也 屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0022] 實施例 I :Spathaspora passalidarumU-30 突變菌株篩選
[0023] 1.以 Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907 為出發(fā)菌株，紫外條件下，20W，照 射20s，取誘變后的菌液ImL轉(zhuǎn)接于木糖濃度為2%的YPX液體培養(yǎng)基，40°C避光培養(yǎng)24h 后轉(zhuǎn)接于新鮮的2% YPX液體培養(yǎng)基，24h后再轉(zhuǎn)接于新鮮2% YPX液體培養(yǎng)基，直到OD62tl 值不再發(fā)生變化。取該菌液稀釋后均勻涂布于木糖平板上，30°C避光培養(yǎng)l-2d后挑取突變 株。
[0024] 2%的YPX培養(yǎng)基：木糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，pH自然。
[0025] 木糖平板：木糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，瓊脂2%，pH自然。
[0026] 2.對1中獲得的突變株進行木糖培養(yǎng)基試管發(fā)酵，30°C，180r/min下培養(yǎng)5d，離 心，DNS法測定上清液中木糖的含量，初篩出木糖利用能力比出發(fā)菌株強的突變株。
[0027] 3.對2中獲得的突變株進行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基為：100g/L木糖，20g/L蛋白 胨，10g/L酵母浸粉，pH自然。發(fā)酵條件為：裝液量100mL，接種量5%，37°C，100rpm發(fā)酵5 天。離心，高效液相色譜測定上清液中乙醇的含量，復(fù)篩出乙醇高產(chǎn)菌株U-30。乙醇產(chǎn)量較 出發(fā)菌株有大幅提升，發(fā)酵結(jié)果見表1。
[0028] 表1突變菌株U-30與出發(fā)菌株乙醇生成量比較
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一株耐高溫酵母突變株，其特征在于，所述突變株具體為Spathaspora passalidarum U-30,保藏編號為 CGMCC No:9863〇
2. 如權(quán)利要求1所述的一株耐高溫酵母突變株，其特征在于，所述突變株能耐受41°C 高溫和12%的乙醇。
3. -種利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1所述的耐高溫突 變株為生產(chǎn)菌株進行發(fā)酵，具體步驟如下： (1) 種子培養(yǎng)：YPD培養(yǎng)基中進行兩級培養(yǎng)得備用種子液； (2) 發(fā)酵培養(yǎng)： 搖瓶發(fā)酵條件：接種量5?10%，溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速120?150rpm，裝液量80? 120/250mL。 發(fā)酵罐發(fā)酵條件：接種量5?10%，溫度30°C，轉(zhuǎn)速120?300rpm，裝液量50?80%， 通氣量 〇? 02 ?0? 05v/v ? min。
4. 如權(quán)利要求3所述的一種利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培 養(yǎng)的培養(yǎng)基為：木糖60?100g/L，玉米漿15?25g/L，磷酸二氫鉀2. 5g/L，七水硫酸鎂 0? lg/L，pH4. 5 ?5. 5。
5. 如權(quán)利要求1所述的一株耐高溫酵母突變株在木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/16GK104480030SQ201410709989
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】陳葉福, 肖冬光, 黃文連, 張鑫鑫, 付更新, 郭學(xué)武, 董健, 張翠英, 杜麗平, 馬立娟 申請人:天津科技大學(xué)