專利名稱：人工合成豬生長激素基因及其表達(dá)純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)，具體涉及編碼動物蛋白質(zhì)的基因，更具體地說是一種人工 合成豬生長激素基因及其表達(dá)純化方法。
背景技術(shù)：
我國是一個以食用豬肉為主的養(yǎng)豬大國，存欄數(shù)達(dá)到約5億頭之多，豬肉產(chǎn)量占世界產(chǎn)量 的55%以上。生豬"瘦肉精"的殘留在我國己經(jīng)造成多起中毒事件，引起我國政府的關(guān)注。在 豬肉產(chǎn)量、品質(zhì)和人類健康之間產(chǎn)生了生產(chǎn)者和消費(fèi)者的矛盾。解決這一矛盾的有效途徑是 找到一種更為安全的生長調(diào)節(jié)劑，同時提高肉產(chǎn)品的品質(zhì)和產(chǎn)量，使生產(chǎn)者和消費(fèi)者能同時接 受。
豬生長激素(porcine growth hormone, PGH)是由豬腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的一種單一 肽鏈的蛋白質(zhì)激素(190-191aa)。給豬注射外源PGH，能顯著提高豬的生長速率，降低單位飼 料的消耗量，促進(jìn)肌肉的生長和減少組織的脂肪合成。最主要的是，PGH為蛋白質(zhì)類激素制 品，不同于固醇類激素和人工合成的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(如瘦肉精)，不在動物體內(nèi)殘留，使生肉 產(chǎn)品更為安全，是一種生產(chǎn)者和消費(fèi)者都能接受的生長調(diào)節(jié)劑。
PGH最早是從豬的機(jī)體組織中提取的，但從腦垂體提取PGH成本太高既花費(fèi)時間和精力， 而且產(chǎn)量很有限，無法應(yīng)用于大規(guī)模的生產(chǎn)。隨著科技的發(fā)展，人們開始通過微生物生產(chǎn)該 激素，Evock(Evocketal., 1991)等人首次用DNA重組技術(shù)在大腸桿菌(Eco//)中表達(dá)了重組 豬生長激素(rPGH)，其生物活性與由腦垂體提取的生長激素相同。目前為止，用大腸桿菌 表達(dá)系統(tǒng)得到的PGH多以包涵體形式存在，需包涵體的體外溶解并且蛋白質(zhì)得到重新正確折 疊后才有活性；其次是PGH表達(dá)的表達(dá)量不夠高，經(jīng)過變復(fù)性后，最后得到的純化的可溶性 PGH的產(chǎn)量偏低，不能用于工業(yè)大規(guī)模制備，因此，PGH的高成本限制了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能在大腸桿菌中高效表達(dá)的人工合成豬生長激素基因及其表 達(dá)純化方法，該方法適合于豬生長激素的大規(guī)模制備。
本發(fā)明根據(jù)已報道0 ://^^11(^.111111.11化《(^/)的豬生長激素的氨基酸序列和大腸桿菌 偏愛密碼子的使用原則，設(shè)計(jì)編碼與豬體內(nèi)氨基酸序列一致的豬生長激素的核苷酸序列，進(jìn) 行體外合成，在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，并利用酸堿度進(jìn)行包涵體變復(fù)性，得到純化的可 溶性PGH。
3本發(fā)明提供的一種人工合成豬生長激素基因，是序列表中SEQ ID N01的核苷酸序列。 該人工合成豬生長激素基因長度為576bp的PGH基因序列，編碼191個氨基酸。 人工合成豬生長激素基因在大腸桿菌中的表達(dá)純化方法，包括如下步驟-
(1) 構(gòu)建含有人工合成的PGH基因的重組質(zhì)粒pET-28a+-PGH;
(2) 將重組質(zhì)粒pET-28a+-PGH轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞BL21(DE3)中，得到含有重組質(zhì)粒的工程 菌株；
(3) 將工程菌株接種到LB培養(yǎng)基溶液中培養(yǎng)，當(dāng)工程菌培養(yǎng)液濃度OD6oo達(dá)到0.6-0.8時， 加入0.5mmol/LIPTG， 37。C誘導(dǎo)表達(dá)6小時，得到高效表達(dá)的PGH包涵體；離心，棄上清， 清洗包涵體；
(4) 逐滴加入pH為12的含有2mol/L尿素的100mmol/L Tris緩沖液，溶解PGH包涵體；
(5) 按0.1mL/min逐滴緩慢加入pH為8.5，含有50mmol/LTris、 sucrose 5%、 2mol/LUrea 的復(fù)性緩沖液，4。C溫育2小時，13000rpm， 4°C離心30min，取上清，得到可溶性的PGH;
(6) 用superdex-75凝膠層析的方法去除可溶性PGH中的尿素，得到目的蛋白PGH。目的 蛋白PGH純度鑒定，在280nm與215 nm處出現(xiàn)一個單峰。10% SZM-iMGE分析經(jīng)變復(fù)性實(shí) 驗(yàn)及純化的目的蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示，本發(fā)明得到了電泳純的目的蛋白質(zhì)；Western blotting鑒 定結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)目的蛋白質(zhì)及其純度。
與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果
本發(fā)明使用了大腸桿菌偏愛密碼子設(shè)計(jì)了 PGH的基因序列，在大腸桿菌中得到了高效 表達(dá)，比之前的方法在表達(dá)量上有很大提高，占到菌體總蛋白表達(dá)量的70%左右。
用園二色譜技術(shù)分析變性過程中二級結(jié)構(gòu)含量，結(jié)果顯示，本發(fā)明的變復(fù)性過程中，由 于使用了低濃度的尿素，其二級結(jié)構(gòu)受到較小的破壞，結(jié)構(gòu)基本保持穩(wěn)定(見圖1)。該方法有 利于復(fù)性過程中變性蛋白質(zhì)的復(fù)性速率和正確結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，是一種理想的變復(fù)性方法。
重組PGH的細(xì)胞活性分析。用MTT比色法分析本發(fā)明得到的可溶性PGH對細(xì)胞生長 的影響(見圖2)，結(jié)果顯示，本發(fā)明得到的目的PGH對細(xì)胞的生長具有明顯的促生長作用。8 小時內(nèi)隨著PGH濃度的提高，對HEK293T細(xì)胞的生長具有明顯的劑效關(guān)系(見圖3)。


圖1園二色譜技術(shù)分析其二級結(jié)構(gòu)受到較小的破壞，結(jié)構(gòu)基本保持穩(wěn)定 圖2用MTT比色法分析本發(fā)明得到的可溶性PGH對細(xì)胞生長的影響 圖3對HEK293T細(xì)胞的生長具有明顯的劑效關(guān)系
圖4人工合成PGH基因與豬體內(nèi)表達(dá)的野生型基因核苷酸序列比對，圖中黑色陰影的 堿基為密碼子優(yōu)化后改變的堿基圖5 pET-28a+-PGH重組質(zhì)粒構(gòu)建流程
圖6 pET-28a+-PGH重組質(zhì)粒構(gòu)建的PCR和酶切鑒定電泳分析泳道1為PCR鑒定結(jié) 果；泳道2為A^el和^oI酶切鑒定結(jié)果。
圖7 10% SDS-PAGE分析IPTG誘導(dǎo)含有重組質(zhì)粒pET-28a-PGH的大腸桿菌￡.co// BL21在37'C，表達(dá)16小時目的蛋白質(zhì)的表達(dá)情況泳道1:誘導(dǎo)前五.co//BL21/pET-28a-PGH 的細(xì)胞裂解液；泳道2: 37°C, IPTG誘導(dǎo)后Aco// BL21裂解液；泳道3: 37°C， IPTG誘 導(dǎo)后￡.co// BL21/pET-28a-PGH裂解液；泳道4:中分子量蛋白Marker;泳道5/7:誘導(dǎo)后五.co// BL21/pET-28a-PGH表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在；泳道6: 37°C, IPTG誘導(dǎo)后￡. co// BL21/pET-28a-PGH離心上清液。
圖8工程菌BL21(DE3)/pET28a-PGH的誘導(dǎo)表達(dá)及包涵體洗滌技術(shù)路線
圖9 Western blotting鑒定表達(dá)的蛋白質(zhì)為目的蛋白質(zhì)PGH
圖10用變性緩沖液溶解包涵體的技術(shù)路線
圖ll通過pH的改變進(jìn)行包涵體復(fù)性的技術(shù)路線
圖12用superdex-75凝膠層析的方法進(jìn)行去除尿素，在280nm與215 nm處出現(xiàn)一個單 峰，表明目的蛋白質(zhì)得以純化
圖13 10% S2W-iMGE分析經(jīng)變復(fù)性實(shí)驗(yàn)及純化的目的蛋白質(zhì)泳道l: 37°C, IPTG 誘導(dǎo)后Eco// BL21裂解液；泳道2: 37°C， IPTG誘導(dǎo)后Eco/Z BL21/pET-28a-PGH上清液； 泳道3: 37°C, IPTG誘導(dǎo)后五.co"BL21/pET-28a-PGH沉淀(包涵體)；泳道4: 溶解于2M urea的包涵體；泳道5:中分子量蛋白Marker;泳道6:變復(fù)性后的可溶性PGH蛋白質(zhì)； 泳道7:凝膠過濾層析后的PGH蛋白質(zhì)
圖14 Western blotting鑒定結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)目的蛋白質(zhì)及其純度
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、本發(fā)明人工合成的PGH基因
本發(fā)明根據(jù)已報道(http://wwW.ncbi.nlm.nih.goV/)的豬生長激素的氨基酸序列和大腸桿菌 偏愛密碼子的使用原則，設(shè)計(jì)編碼與豬體內(nèi)氨基酸序列一致的豬生長激素的核苷酸序列，見 序列表中SEQ ID N01的核苷酸序列，其核苷酸序列與豬體內(nèi)的野生型基因序列比較(見圖4)。 該人工合成豬生長激素基因長度為576bp的PGH基因序列，編碼191個氨基酸。
實(shí)施例2、人工合成PGH基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)
(1)設(shè)計(jì)帶有I和JW20 I酶切位點(diǎn)的引物5'-gtggtg"咖gaa gaa ttc ccg gcca-3，和 5'-gtggt"cg"g cta gaa ggc gca ggag-3'，擴(kuò)增人工合成的PGH基因，將人其克隆至含有T7
強(qiáng)啟動子的原核生物表達(dá)載體pET-28a+中，構(gòu)建成含有人工合成的PGH基因的重組質(zhì)?？凇甓?28&+- 011(見圖5,6);
(2) 制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用熱休克法(42t:熱激45秒)將重組質(zhì)粒 pET-28a+-PGH轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞BL21(DE3)中，得到含有重組質(zhì)粒的工程菌株；
(3) 將工程菌株接種到LB培養(yǎng)基溶液中，當(dāng)工程菌培養(yǎng)液濃度OD6冊達(dá)到0.6-0.8時，加 入0.5mmol/L IPTG， 37'C誘導(dǎo)表達(dá)6小時，得到高效表達(dá)的PGH包涵體，占到菌體總蛋白 表達(dá)量的70°/。左右(見圖7);離心，棄上清，清洗包涵體(技術(shù)路線見附圖8); Western blotting 鑒定表達(dá)的蛋白質(zhì)為目的蛋白質(zhì)PGH (見圖9);
(4) 在高pH值(pH42)的條件下，逐滴加入含有2mol/L尿素的100mmol/L Tris緩沖液， 溶解PGH包涵體(技術(shù)路線見圖10);
(5) 按0. lmL/min逐滴緩慢加入pH8.5 ，含有50mmol/L Tris、 sucrose 5 % 、 2mol/L Urea的 復(fù)性緩沖液，4。C溫育2小時，13000rpm， 4°C離心30min，取上清,得到可溶性的PGH，其 復(fù)性效率在30%左右(具體的技術(shù)路線見圖11);
(6) 用superdex-75凝膠層析的方法去除可溶性PGH中的尿素，得到目的蛋白PGH。目的 蛋白PGH純度鑒定，在280nm與215 nm處出現(xiàn)一個單峰(附圖12)。 10%S2Xy-ZMG^:分析經(jīng) 變復(fù)性實(shí)驗(yàn)及純化的目的蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示，本發(fā)明得到了電泳純的目的蛋白質(zhì)，純度達(dá)98% 以上(見圖13); Western blotting鑒定結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)目的蛋白質(zhì)及其純度(見圖14)。山西大學(xué)
人工合成豬生長激素基因及其表達(dá)純化方法 <7卯> 無案巻參考號
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權(quán)利要求
1、一種人工合成的豬生長激素PGH基因，其特征在于，它是序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列。
2、 如權(quán)利要求1所述的人工合成的豬生長激素基因的表達(dá)純化方法，其特征在于，包 括如下步驟(1) 構(gòu)建含有人工合成的PGH基因的重組質(zhì)粒pET-28a+-PGH;(2) 將重組質(zhì)粒pET-28a+-PGH轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞BL21(DE3)中，得到含有重組質(zhì)粒的工程 菌株；(3) 將工程菌株接種到LB培養(yǎng)基溶液中培養(yǎng)，當(dāng)工程菌培養(yǎng)液濃度OD6oo達(dá)到0.6-0.8時， 加入0.5mmol/LIPTG， 37"C誘導(dǎo)表達(dá)6小時，得到高效表達(dá)的PGH包涵體；離心，棄上清， 清洗包涵體；(4) 逐滴加入pH為12的含有2mol/L尿素的100mmol/LTris緩沖液，溶解PGH包涵體；(5) 按0.1mL/min逐滴緩慢加入pH8.5，含有50mmol/L Tris、 sucrose 5 % 、 2mol/L Urea的 復(fù)性緩沖液，4。C溫育2小時，13000rpm， 4°C離心30min，取上清，得到可溶性的PGH;(6) 用superdex-75凝膠層析的方法去除可溶性PGH中的尿素，得到目的蛋白PGH。
全文摘要
本發(fā)明涉及人工合成豬生長激素基因及其表達(dá)純化方法，本發(fā)明依據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子使用原則，設(shè)計(jì)了適合在大腸桿菌中高效表達(dá)的豬生長激素PGH的DNA序列，其表達(dá)的PGH蛋白與豬體內(nèi)表達(dá)的PGH編碼區(qū)氨基酸序列一致。將該基因克隆到pET-28a⁺表達(dá)系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。0.5mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)6小時的條件下，電泳檢測到該基因的表達(dá)產(chǎn)物占全菌蛋白的70％以上，產(chǎn)物以包涵體的形式存在，適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)的需要。包涵體用低濃度尿素(2M)和高pH(12)緩沖液溶解，通過降低pH值至8.5，進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性率達(dá)到30％以上。進(jìn)一步凝膠層析進(jìn)行純化，得到純度達(dá)98％以上的PGH蛋白。
文檔編號C12N15/18GK101665788SQ200910075520
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月21日
發(fā)明者付月君, 張志云, 張振興, 柴寶峰, 梁愛華, 偉 王, 泉 申 申請人:山西大學(xué)