使用aav衣殼變異體的高度有效的基因轉移的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于AAV介導的基因治療的改進的組合物和方法。
【專利說明】使用AAV衣殼變異體的高度有效的基因轉移的組合物和方 法
[0001] 本申請要求分別于2012年4月18日和2013年3月15日提交的美國臨時專利申 請第61/635, 273和61/794, 995號的優(yōu)先權，各專利申請的全部內容以似乎完整地陳述的 參考方式并入本文中。

【技術領域】
[0002] 本申請涉及基因治療和分子生物學領域。更具體地，本發(fā)明提供包含蛋白質衣殼 變異體的AAV載體，該蛋白質衣殼變異體提高包含治療上有利的轉基因的AAV載體的轉導 效率。

【背景技術】
[0003] 本說明書的全文中引用若干公開物和專利文件，以便描述本發(fā)明所屬領域的狀 態(tài)。這些引用文件中的每一個以似乎完整地陳述的參考方式并入本文中。
[0004] 腺相關病毒（AAV)的一種小的（20nm)復制缺陷的無包膜病毒。已在人和非人靈長 類動物中鑒定出許多不同的AAV血清型。AAV基因組是由在兩端具有145bp的末端反向重 復（ITR)的單鏈DNA所構成。存在兩個開放閱讀框（ORF) :R印和Cap。雖然R印產物對于 AAV復制是必不可少的，但有3種衣殼蛋白（VP1、VP2、和VP3)是由Cap基因表達。VP1、VP2 和￥?3以1 :1:10的比率共同地形成二十面體衣殼（乂丨6〇6七&1，2002)。在重組44￥〇^八￥) 載體產生期間，將由ITRs旁側（flank)的表達盒被包裝入AAV衣殼中。AAV的復制所需的 基因不包含在該表達盒中。重組AAV被認為是最安全的，并且是最廣泛使用的用于體內基 因轉移的病毒載體之一。這些載體可以感染來自于提供強的和持續(xù)的轉基因表達的多種組 織類型的細胞。它們也是非致病的，并且具有低的免疫原性（High KA，2011)。
[0005] 基因治療試驗的一個直接目的是優(yōu)化載體以在使載體劑量最小化的同時使組織 轉導最大化。當進入細胞時，AAV衣殼蛋白經歷蛋白酶體介導的降解。AAV衣殼的表面暴露 酪氨酸殘基的磷酸化代表了經由泛素-蛋白酶體途徑導致病毒降解的第一步驟中的一個 步驟（Zhong L et al，2007)。細胞中大部分的受控蛋白水解是經過此途徑而發(fā)生。泛素是 在所有真核細胞中均可以發(fā)現的小蛋白質（約8. 5kDa)。泛素連接到底物蛋白氨基酸的側 鏈。在其它泛素蛋白質經由最初連接的泛素連接到底物之后，形成多聚泛素鏈并且標記底 物用于降解（Thrower JS et al 2000，Peng J et al 2003，Bedford L et al，2011)。已證 明表面暴露酪氨酸殘基的突變導致AAV 2載體的轉導效率的提高（Zhong L et al，2008)。 最近，若干個研究小組已證明該方案也可有效地用于在若干組織中的其它AAV血清型，包 括AAV血清型6和8。
[0006] 顯然，在本領域中對于在有需要的患者中改善攜帶臨床上重要的轉基因的AVV的 轉導的組合物和方法存在著需求。


【發(fā)明內容】

[0007] 根據本發(fā)明，提供了新型的腺相關病毒變異體，該變異體當與缺乏本文中公開的 修飾的AAV血清型（例如，44￥1、44￥244￥8、44￥-1^74)相比時顯示提高的轉導效率。這種 改進的載體可用于包括肝臟、肌肉、大腦和視網膜在內的多種組織的轉導。
[0008] 在一個實施方式中，提供腺相關病毒（AAV)載體，該載體包含改變的VPl衣殼蛋 白，該改變的VPl衣殼蛋白包含賴氨酸殘基替換（substitution),由此降低衣殼的泛素化 并提高將變異體AVV轉導入靶組織和細胞中的轉導效率。在一個實施方式中，載體還包含 異源核酸（例如，包含AAV末端反向重復和異源核酸序列的小基因），該異源核酸可操作地 連接到調控序列，該調控序列引導宿主細胞中由異源核酸序列對產物的表達。在一個優(yōu)選 的實施方式中，AAV載體包含如在本文中所給出的表中提供的VPl中的一個或多個賴氨酸 替換。在另一個實施方式中，AAV載體屬于AAV8血清型，并且含有表3中示出的改變。
[0009] 在一個優(yōu)選實施方式中，包含變異體衣殼蛋白的本發(fā)明的AAV載體可用于治療性 肽或者治療性核酸的表達。這種肽類包括但不限于：抗病毒RNAi分子、第八因子、第九因子 或者其功能性片段。其它的表達產物包括例如：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、嵌合免疫球蛋白、 人源化抗體、或者單鏈抗體。在一個方面，表達產物是可用于抑制HCV(丙型肝炎病毒）感 染和復制的RNAi。在另一個實施方式中，表達產物是可用于下調所研究的靶細胞的反義核 酸。
[0010] 在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供包含在生物學相容載體中的本發(fā)明的變異體 AAV載體的藥物組合物。本發(fā)明還涉及包含本文中所公開載體的細胞培養(yǎng)物。
[0011] 本發(fā)明還涉及一種將轉基因傳遞至受試對象中的細胞的方法；所述方法包括如本 文中所公開的使細胞與AAV載體接觸的步驟，其中所述AAV載體包含轉基因，其中所述載體 中的VPl衣殼序列中的賴氨酸替換（substitution)與降低的泛素化以及提高的轉導效率 有關。
[0012] 在最后的方面，本發(fā)明提供誘餌病毒變異體，該誘餌病毒變異體不足以感染細胞， 但可有效地阻斷攜帶有利的轉基因的病毒變異體的抗體中和，原因在于這兩種病毒變異體 的結構相似性。用于此目的的示例性衣殼變異體包括例如K38R、K143R、K510R和K709R。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1 :在這里所使用的AAVl、AAV2和AAV8的表面上的賴氨酸：所使用的AAV血清 型的PDB數量如下： AAV1:3NG9、AAV2:1LP3、和AAV8:2QA0。箭頭代表各自的賴氨酸殘基。（A)在AAV1VP3 的表面上有11個賴氨酸。殘基的顏色如下：K258紅、K459藍、K491黃、K493品紅、K508青、 K528深肉色、K533淡綠、K545淡藍（藍灰色）、K567深肉色、K666淡青、K707灰。（B)在 AAV2VP3的表面上有10個賴氨酸。殘基的顏色如下：K258紅、K490黃、K507青、K527深肉 色、K532淡綠、K544淡藍（藍灰色）、K549淡黃、K556淺品紅、K665淡青、K706灰。（C)在 AAV8VP3的表面上有8個賴氨酸。殘基的顏色如下：K259紅、K333綠、K510青、K530深肉 色、K547淡藍（藍灰色）、K569深肉色、K668淡青、K709灰。應注意AAVl的K567以及K528 和AAV8的Κ530以及Κ569在結構中為并排的，并且顯示具有相同的顏色。
[0014] 圖2 :將AAV8衣殼的若干賴氨酸殘基突變?yōu)榫彼?。在動物經過尾靜脈注射病毒 8周后從這些動物中采集血液。利用ELISA檢測hF. IX水平（A)利用軟件預測以高和中等 置信度水平被泛素化的殘基突變?yōu)榫彼帷＝涍^尾靜脈給每只小鼠注射2. 5X 101°個病毒 顆粒（B、C)。利用軟件預測以低置信度被泛素化的殘基突變?yōu)榫彼?。經過尾靜脈給每只 小鼠注射2. 5 X IO9個病毒顆粒。（B) K569R和K668R衣殼突變（C)對K38R、K143R、K259R、 K510R、K547R衣殼突變的影響與對K530R突變的影響進行比較。
[0015] 圖3 :K向R衣殼突變的組合（A)K137R、K33R和K530R突變的組合仍然高于野生 型，但在統(tǒng)計學上并非不同于K530R。（B)K709R突變對AAV8轉導產生負面影響。將K709R 突變加入到K (137/333/530) R突變體也降低病毒的轉導。（C)多個賴氨酸-精氨酸突變的 組合不提高轉導率。（D) 3個賴氨酸突變?yōu)榫彼釟埢c4或6個酪氨酸突變?yōu)楸奖彼釟?基的組合降低轉導率。
[0016] 圖4 :AAV1轉導：(A)在三個不同的MOI 5K、50K和500K處用AAV-I賴氨酸突變體 轉導的HHL5-B7肝細胞的CTL殺傷。將肽（用于AAVl的IPQYGYLTL ;用于AAV2的VPQYGYLTL) 用作陽性對照。LDH釋放與細胞殺傷相關聯。（B)在50K和500K MOI處的不同結構之間對 GFP陽性細胞總數和GFP表達進行了比較。
[0017] 圖 5 :AAV2 轉導：(A)對 AAV2K137R、K527R 或 K532R 突變體與 WT AAV2 在 HHL5 細 胞系轉導率方面進行了比較。在1〇Κ、50Κ、100K和500K MOI處轉染這些細胞，并且在24小 時后對GFP表達進行檢查。（B)顯示利用測試變異體的LDL釋放所測量的細胞毒性的圖。
[0018] 圖6 :CTL測定，其中用AAV-2載體以增加的濃度將靶肝細胞進行轉導，然后與HLA 相配效應子細胞一起保溫培養(yǎng)。如圖所示的AAV載體編碼的野生型AAV-2衣殼或者單個賴 氨酸突變。針對AAV-2MHC I類表位VPQYGYLTL的效應子是從在體外擴大的PBMC中獲得，并 且效應子-靶比率為10:1，結果表示為相對于野生型載體的CTL活性的百分比（與用10% SDS處理的細胞進行比較的細胞毒性％，作為在背景減除后的最大細胞毒性對照）。
[0019] 圖7 :RH74數據：利用對于人F. IX是特異性的ELISA所測量的血漿中 人F. IX轉基因表達水平。⑷TMR = K的定義（137/333/530) R，HMF的定義= Y (253/275/447/703/707/733)F。（B)HMR 的定義：K(137/259/333/530/552/569)R， 195/202 的定義：G195A+L199V+S201P+G202N。雖然 HMR+195/202、HMR+195/202+K (38) R、 腿尺+195/202+1((51)1?、腿1?+195/202+1((61)1?、和腿1?+195/202+1((77)1?當給小鼠注射時產生 較高的 hFIX 產量，但 HMR+195/202+K (122/123) R 或者 HMR+195/202+K (142/413) R 注射根本 不產生任何可檢測的hFIX。（C):與Rh74WT相比RHM13_1突變體產生類似的hFIX水平，而 來源于RHM17_1-處理的小鼠的hFIX水平僅僅超過背景值。（D)與Rh74WT相比，RHM14_2 突變體產生類似的hFIX水平；RHM15_1的性能是在AAV8和AAVrh74WT之間。

【具體實施方式】
[0020] 根據本發(fā)明，我們已發(fā)現使AAV衣殼上的賴氨酸殘基突變到精氨酸殘基提高腺相 關病毒轉導效率。我們的初步實驗證明預測是泛素化靶的賴氨酸殘基的單個替換導致與接 受未修飾的AAV載體的動物相比小鼠中較高水平的人第九因子IX(FIX)轉基因的表達。本 文中描述的AAV賴氨酸突變體可以用于有利于產生將肝臟、CNS、肌肉、和與野生型AAV衣殼 相比具有較高效率的其它器官作為靶的載體。因此，此發(fā)現可以用于開發(fā)用于治療血友病 A和B、亨廷頓舞蹈病、和需要提高的將期望的轉基因轉導入所關注的靶組織中的轉導水平 的實際上任何其它疾病的治療劑。
[0021] 提供下面的定義，以便于對本發(fā)明的理解。
[0022] I.定義：
[0023] "基因治療"是將基因插入個體的細胞和/或組織中以治療疾病，通常是遺傳病，其 中用功能性的等位基因來替換或補充缺陷突變體等位基因。
[0024] 來自細小病毒科的"腺相關病毒"是具有單鏈DNA的基因組的小病毒?？梢栽谌?色體19上的特定位點處將遺傳物質插入這些病毒，并且這些病毒是優(yōu)選的，因為它們與人 中的致病性疾病不相關。
[0025] "治療性"肽或蛋白質是可緩解或減輕由于細胞或受試對象中蛋白質缺乏或缺陷 所造成的癥狀的肽或蛋白質?？商娲?，"治療性"肽或蛋白質是為受試對象賦予利益（例 如抗癌作用）的肽或蛋白質。治療性肽和蛋白質包括但不限于=CFTR(囊性纖維化跨膜調 節(jié)蛋白）、肌養(yǎng)蛋白（包括肌養(yǎng)蛋白小基因的蛋白質產物，參見例如Vincent et al (1993) Nature Genetics 5:130)、肌營養(yǎng)不良相關蛋白（Tinsley et al(1996)Nature 384:349)、 凝血因子（Factor XIII、Factor IX、Factor X 等）、單克隆抗體（Lewis et al，2002)、促 紅細胞生成素、LDL受體、脂蛋白脂肪酶、鳥氨酸氨甲酰基轉移酶、β-珠蛋白、α-珠蛋白、 血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脫氨酶、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶、β-葡糖腦苷脂 酶、鞘磷脂酶、溶酶體氨基己糖苷酶、支鏈酮酸脫氫酶、激素、生長因子（例如，胰島素樣生 長因子1和2、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、神經生長因子、神經營養(yǎng)因子-3和-4、 腦源性神經營養(yǎng)因子、膠質源性生長因子、α和β-轉化生長因子等）、細胞因子（例如， α -干擾素 、β -干擾素 、Y -干擾素、白細胞介素_2、白細胞介素-4、白細胞介素-12、粒細 胞-巨噬細胞集落刺激因子、淋巴毒素）、自殺基因產物（例如，單純皰疹病毒胸苷激酶、胞 嘧啶脫氨酶、白喉毒素、細胞色素 Ρ450、脫氧胞苷激酶、和腫瘤壞死因子）、賦予用于癌癥治 療的藥物耐藥性的蛋白質、腫瘤抑制基因產物例如，口53、他、1卜1、即1、￥見3?(：、等）、和在 有需要的受試對象中具有治療效果的任何其它肽或蛋白質。
[0026] 其它示例性的治療性肽或蛋白質包括可用于疾病治療的治療性肽或蛋白質，這些 疾病包括但不限于：囊性纖維化（和其它肺?。?、血友病Α、血友病Β、珠蛋白生成障礙性貧 血、貧血癥和其它血液病、艾滋病、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮側 索硬化、癲癇、和其它神經系統(tǒng)疾病、癌癥、糖尿病、肌肉萎縮癥（例如，Duchenne氏、Becker 氏）、高雪氏病、赫爾勒氏病、腺苷脫氨酶缺乏癥、糖原貯積病和其它代謝缺陷、視網膜退行 性疾病（和其它眼?。?、和實體器官的疾病（例如，大腦、肝臟、腎臟、心臟）。
[0027] 本文中使用的術語"啟動子"或"啟動子"可以指代與編碼重組產物的DNA序列相 鄰的DNA序列。優(yōu)選地，啟動子可操作地連接到相鄰的DNA序列。與啟動子不存在時所表 達的重組產物的量相比較，啟動子通常增加由DNA序列所表達重組產物的量。來自一個生 物體的啟動子可以用于提高來自來源于另一個生物體的DNA序列的重組產物表達。例如， 脊椎動物啟動子可用于脊椎動物中水母GFP的表達。另外，一個啟動子元件可以增加為多 個串聯連接的DNA序列所表達的重組產物的量。因此，一個啟動子元件可以增強一個或多 個重組產物的表達。多個啟動子元件對于本領域技術人員是眾所周知的。
[0028] 在一個實施方式中，高水平的組成型表達將是期望的。這種啟動子的實例包括但 不限于：逆轉錄勞斯肉瘤病毒（RSV)LTR啟動子/增強子、巨細胞病毒（CMV)即刻早期啟動 子 / 增強子（見例如，Boshart et &1，0611，41:521-530(1985))、5￥40啟動子、二氫葉酸還 原酶啟動子、細胞質β-肌動蛋白啟動子、和磷酸甘油激酶（PGK)啟動子。
[0029] 在另一個實施方式中，誘導型啟動子會是理想的。誘導型啟動子是由外來提供的 化合物所調節(jié)的那些誘導型啟動子，該外源性化合物是采用順式或反式的形式，包括但不 限于：鋅誘導羊金屬硫蛋白（MT)啟動子、地塞米松（Dex)誘導的小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV) 啟動子、T7聚合酶啟動子系統(tǒng)（W0 98/10088)、四環(huán)素阻遏系統(tǒng)（6〇886116丨31，？1'〇(3· Natl.Acad. Sci. USA，89 :5547-5551(1992));四環(huán)素誘導系統(tǒng)（Gossen et al，Science， 268:1766-1769(1995);也見 Harvey et al，Curr.Opin.Chem.Biol. ,2:512-518(1998)); RU486 誘導系統(tǒng)（Wang et al，Nat. Biotech.，15 :239-243(1997)和 Wang et al，Gene Ther·，4 :432-441 (1997)];和雷帕霉素誘導系統(tǒng)（Magari et al，J. Clin. Invest·，100: 2865-2872(1997) ;Rivera et al，Nat.Medicine.2:1028-1032(1996))?？捎糜诒景l(fā)明的 其它類型的誘導型啟動子是由特定生理狀態(tài)（例如溫度、急性期）所調節(jié)，或者僅僅用于復 制細胞。
[0030] 在另一個實施方式中，將使用用于所研究的轉基因或核酸序列的天然啟動子。當 理想的是轉基因或核酸序列的表達應當模擬天然表達時，天然啟動子可以是優(yōu)選的。當必 須暫時地或進展地、或者以組織特異性方式、或者響應于特定的轉錄刺激來調節(jié)轉基因或 其它核酸序列的表達時，可使用天然啟動子。在另一個實施方式中，也可將其它天然表達的 控制元件，諸如增強子元件，多聚腺苷酸化位點或者Kozak共有序列用于模擬天然表達。
[0031] 在一個實施方式中，重組病毒基因組包含可操作地連接到組織特異性啟動子的 轉基因。例如，如果骨骼肌中的表達是期望的，則可使用在肌肉中起作用的啟動子。這些 包括：來源于編碼骨骼α -肌動蛋白、肌球蛋白輕鏈2A、肌養(yǎng)蛋白、肌肉肌酸激酶、以及活 性高于天然存在啟動子的合成肌肉啟動子的基因的啟動子。見Li et al，Nat. Biotech.， 17:241-245(1999)。已知用于肝白蛋白的組織特異性的啟動子的實例，Miyatake et al.J. Virol. ,71:5124-32 (1997);乙型肝炎病毒核心啟動子，Sandig et al，Gene Ther. 3: 1002-9(1996);甲胎蛋白（AFP)，Arbuthnot et al，Hum.Gene Ther. ,7:1503-14(1996)]， 骨骼（骨鈣蛋白，Stein et al，Mol. Biol. R印·，24 :185-96 (1997);骨唾液蛋白，Chen et al，J. Bone Miner. Res. 11 :654-64(1996))、淋巴細胞（CD2，Hansal et al，J. Tmmunol.， 161 :1063-8(1998);免疫球蛋白重鏈；T細胞受體a鏈）、神經元（神經元特異性烯醇化酶 (NSE)啟動子，Andersen et al。Cell. Mol. Neurobiol. ,13:503-15(1993);神經絲輕鏈基 因 ，Piccioli et al，Proc.Natl.Acad. Sci. USA，88 :5611-5(1991);神經元特異性 vgf 基 因 ，Piccioli et al，Neuron，15 :373-84(1995)];等等。
[0032] 本文中使用的術語"多個增強子"或"增強子"可以是指與編碼重組產物的DNA序 列相鄰的DNA序列。增強子元件通常位于啟動子元件的上游或者可以位于DNA編碼序列的 下游或者其內部（例如，被轉錄或翻譯入重組產物中的DNA序列）。因此，增強子元件可以 定位在編碼重組產物的DNA序列的上游或下游的100個堿基對、200堿基對、或300個以上 的堿基對的位置。增強子元件可以將由DNA序列所表達重組產物的量增加到超過由啟動子 元件所提供的增加的表達。本領域技術人員可容易地獲得多個增強子元件。
[0033] 本文中使用的"核酸"或"核酸分子"是指任何單鏈或者雙鏈的DNA或RNA分子； 如果是單鏈的，其互補序列的分子采用線性形式或環(huán)形形式。在對核酸分子進行描述中，在 本文中可按照提供在5'到3'方向上的序列的正常慣例對特定核酸分子的序列或結構進行 描述。關于本發(fā)明的核酸，有時使用術語"分離的核酸"。此術語，當應用于DNA時，是指在 生物體的天然存在的基因組中緊密鄰接的序列中所分離的DNA分子。例如，"分離的核酸" 可包含被插入載體（諸如質?；虿《据d體）中、或者結合入原核細胞或真核細胞或者宿主 生物體的基因組DNA的DNA分子。
[0034] "載體"是指可以連接另一個基因序列或元件（DNA或者RNA)從而引起所連接序列 或元件的復制的復制子，諸如質粒、黏粒、桿粒、噬菌體或病毒。
[0035] "表達操縱子"是指可具有轉錄和翻譯控制序列并且促進宿主細胞或生物體中的 多肽編碼序列的表達的核酸片段，諸如啟動子、增強子、轉錄起始信號（例如，ATG或AUG密 碼子）、多聚腺苷酸化信號、終止子等。
[0036] 術語"轉化"、"轉染"、"轉導"應是指將核酸導入細胞或宿主生物體的任何方法或 手段，并且可以互換地使用以傳達相同的含義。這種方法包括但不限于：轉染、電穿孔、顯微 注射、感染、PEG融合等。
[0037] 可以或者可以不將所導入的核酸結合（共價連接）入受體細胞或生物體的核酸。 在細菌、酵母菌、植物和哺乳動物的細胞中，例如，可以將所導入的核酸作為附加體元件或 者獨立的復制子（諸如質粒）而維持?？商娲?，所導入的核酸可以變得結合入受體細胞 或生物體的核酸并穩(wěn)定地維持在細胞或生物體中且進一步傳遞到受體細胞或生物體的后 代細胞或者由受體細胞或生物體的后代細胞或生物體遺傳。最后，所導入的核酸可僅短暫 地存在于受體細胞或者宿主生物體中。
[0038] 術語"可選擇的標記基因"是指當表達時為被轉化細胞或植物賦予可選的表現型 (諸如抗生素抗性）的基因。
[0039] 術語"可操作地連接的"表示將對于編碼序列的表達所必需的調控序列置于DNA 分子中相對于編碼序列的適當位置，從而影響編碼序列的表達。有時將該相同的定義應用 于轉錄單位和其它轉錄控制元件（例如增強子）在表達載體中的布置。
[0040] 本文中使用的術語"寡核苷酸"是指本發(fā)明的序列、引物和探針，并且被定義為由 兩個或兩個以上優(yōu)選地多于三個的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸所構成的核酸分子。寡核 苷酸的精確尺寸將取決于各種因素以及寡核苷酸的具體應用和用途。
[0041] 詞組"特異性地雜交"是指在充分互補序列的兩個單鏈核酸分子之間的締合，以便 在本領域中通常使用的預定條件下實現這種雜交（有時被稱為"大體上互補的")。具體地， 該術語是指利用大體互補序列使包含在本發(fā)明的單鏈DNA或RNA分子中的寡核苷酸雜交， 以大體上排除寡核苷酸與非互補序列的單鏈核酸的雜交。
[0042] 本文中使用的術語"引物"是指單鏈或雙鏈的DNA寡核苷酸，來源于生物系統(tǒng)，由 限制性酶內切產生，或者通過合成而產生，當置于適當的環(huán)境中時能夠功能性地用作模板 依賴性核酸合成的引發(fā)劑。當提供有適當的核酸模板、合適的核酸的三磷酸核苷前體、聚合 酶、合適的輔因子、和條件（諸如合適的溫度和PH值）時，引物可以利用聚合酶的作用或 者類似的活性通過添加核苷酸在其3'末端延伸以獲得引物延伸產物。引物的長度可以基 于應用的具體條件和要求而變化。例如，在診斷應用中，寡核苷酸引物的長度通常為15-25 個或更多的核苷酸。引物必須具有充分的針對期望模板的互補性，用以啟動期望延伸產物 的合成，亦即，能夠以足以在用于由聚合酶或者類似酶引發(fā)的合成的適當的鄰近位提供引 物的3'羥基基團的方式，與期望的模板鏈復性。不要求引物序列代表期望的模板的精確互 補。例如，非互補的核苷酸序列可連接到互補引物的5'末端?？商娲?，非互補堿基可散 布在寡核苷酸引物序列中，前提是引物序列與期望的模板鏈的序列具有充分的互補性，以 便功能性地提供用于延伸產物合成的模板-引物復合物。
[0043] 美國專利第4, 683, 195、4, 800, 195、和4, 965, 188號中已描述了聚合酶鏈反應 (PCR)，它們的全部公開內容以參考的方式并入本文中。
[0044] 術語"分離的"可以是指已充分地與將會自然地結合的其它化合物分離的化合物 或復合物。"分離的"并非意圖排除與其它化合物或材料的人工或合成混合物，也非意圖排 除不影響基本活性或者接下來的測定并且會例如由于不完全的純化或者穩(wěn)定劑的添加而 存在的雜質的存在。
[0045] 術語"免疫應答"意圖是指脊椎動物受試對象的免疫系統(tǒng)對抗原或抗原決定簇的 任何應答。示例性的免疫應答包括：體液免疫應答（例如抗原特異性抗體的產生）和細胞 介導的免疫應答（例如淋巴細胞增殖），如下文中的定義。
[0046] II.本發(fā)明變異體AAV載體的使用方法和給予方法
[0047] 本發(fā)明的方法提供一種用于將異源核酸序列輸送入大范圍宿主細胞（包括分裂 和非分裂細胞）中的手段。另外，作為治療的方法等，本發(fā)明的載體和其它試劑、方法和藥 物制劑可用于將蛋白質或肽給予有需要的受試對象的方法。因此，可以這種方式在受試對 象體內產生蛋白質和肽。作為治療的方法等，受試對象會需要蛋白質或肽，因為受試對象具 有蛋白質或肽的缺乏，或者因為在受試對象中蛋白質或肽的產生會賦予一些治療性作用， 如下面進一步的說明。
[0048] 一般來說，本發(fā)明可用于傳輸具有生物學效應的任何外來核酸，以便治療或減輕 與有關基因表達的任何疾病相關的癥狀。說明性的疾病狀態(tài)包括但不限于：囊性纖維化 (和其它肺?。⒀巡、血友病B、珠蛋白生成障礙性貧血、貧血癥和其它血液凝固障礙、 艾滋病、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮側索硬化、癲癇、和其它神經 系統(tǒng)疾病、癌癥、糖尿病、肌肉萎縮癥（例如，Duchenne氏、Becker氏）、高雪氏病、赫爾勒氏 病、腺苷脫氨酶缺乏癥、糖原貯積病和其它代謝缺陷、視網膜退行性疾?。ê推渌鄄。?、實 體器官的疾?。ɡ纾竽X、肝臟、腎臟、心臟）等。
[0049] 另外，本發(fā)明可用于傳輸已知提供有利的生物學效果以便治療或減輕與癌癥、傳 染病、和諸如類風濕關節(jié)炎在內的自身免疫病相關的癥狀的編碼單克隆抗體的核酸或者其 片段。其它序列可編碼例如細胞因子，諸如可調節(jié)疾病過程的α-干擾素。
[0050] 基因轉移在了解和提供疾病狀態(tài)的治療中具有顯著的潛在用途。存在一些其缺陷 基因是已知的并且已被克隆的遺傳性疾病。在有些情況下，這些克隆化基因的功能是已知 的。一般來說，上述疾病狀態(tài)分為兩種類型：通常以隱形的方式遺傳的缺陷狀態(tài)，通常是酶 的缺陷狀態(tài)；和不平衡狀態(tài)，其至少有時與以顯性方式遺傳的調控或結構蛋白有關。就缺乏 狀態(tài)疾病而言，可以利用基因轉移使正常的基因進入受感染的組織用于替代治療，以及利 用反義突變建立疾病的動物模型。就不平衡疾病狀態(tài)而言，基因轉移可以用于形成模型系 統(tǒng)中的疾病狀態(tài)，然后可以用于致力于對抗疾病狀態(tài)。因此，本發(fā)明的方法能夠治療遺傳性 疾病。本文中使用的"疾病狀態(tài)"是通過部分或完全地治療導致疾病或者使它更加嚴重的 缺乏或不平衡疾病而得以治療。導致突變或糾正缺陷的核酸序列的位點特異性整合的應用 也是可行的。
[0051] 最后，本發(fā)明還可應用于診斷和篩選方法，由此在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)或者可替代地轉 基因動物模型中短暫地或穩(wěn)定地表達所研究的基因。
[0052] III.受試對象、藥物制劑、疫苗、和給藥方式
[0053] 本發(fā)明可用于獸醫(yī)和醫(yī)學應用。合適的受試對象包括禽類和哺乳動物，其中優(yōu)選 的是哺乳動物。本文中使用的術語"禽類"包括但不限于：雞、鴨、鵝、鵪鶉、火雞和雉雞。本 文中使用的術語"哺乳動物"包括但不限于：人類、牛類、綿羊類、山羊類、馬類、貓類、犬類、 兔類等。人受試對象是最優(yōu)選的。人受試對象包括胎兒、新生兒、幼兒、青少年和成人受試 對象。
[0054] 在具體的實施方式中，本發(fā)明提供了一種包含在藥學上可接受的載體或者其它醫(yī) 用劑、藥用劑、載體、佐劑、稀釋劑等中的本發(fā)明的病毒顆粒的藥物組合物。就注射而言，載 體通常將是液體。就其它給藥方法而言，載體可以是固體或者液體，諸如無菌無熱原水或者 無菌無熱原磷酸鹽緩沖生理鹽水。就吸入給藥而言，載體將是可吸入的，并且將優(yōu)選地采用 固體或液體顆粒形式。作為注射介質，優(yōu)選的是使用含有可用于注射液的添加劑（諸如穩(wěn) 定劑、鹽類或生理鹽水、和/或緩沖劑）的水。
[0055] 在其它實施方式中，本發(fā)明提供一種包含在藥學上可接受的載體或者其它醫(yī)用 齊U、藥用劑、載體、佐劑、稀釋劑等中的細胞的藥物組合物；在該細胞中將AAV原病毒結合入 基因組。
[0056] "藥學上可接受的"表示并非生物學不合適的物質，例如可在不引起任何不良生物 學效應的情況下將該物質給予受試對象。因此，這種藥物組合物可以用于例如細胞的離體 轉染，或者用于將病毒顆粒或細胞直接地給予受試對象。
[0057] 本發(fā)明還提供一種將核酸傳遞至細胞的方法。就體外方法而言，可利用如本領域 已知的標準病毒轉導方法將病毒提供給細胞。優(yōu)選地，按照適合于特定靶細胞的標準轉導 方法，以適當的多重性感染將病毒顆粒加入到細胞中。所給予的病毒滴度可以根據靶細胞 類型和具體的病毒載體而變化，并且可以由本領域技術人員在不需要過度實驗的情況下而 決定。可替代地，本發(fā)明細小病毒載體的給予可以利用本領域已知的任何其它方法而完成。
[0058] 優(yōu)選地，將重組病毒載體以生物有效量給予細胞。病毒載體的"生物有效"量是足 以導致異源核酸序列在細胞中感染（或轉導）和表達的量。如果將病毒體內給予細胞（例 如，將病毒給予受試對象，如下所述），則病毒載體的"生物有效"量是足以導致在靶細胞中 異源核酸序列的轉導和表達的量。
[0059] 被給予本發(fā)明病毒載體的細胞可屬于任何類型，包括但不限于：神經細胞（包括 周圍和中樞神經系統(tǒng)的細胞，特別是腦細胞）、肺細胞、視網膜細胞、上皮細胞（例如，腸道 和呼吸道上皮細胞）、肌肉細胞、胰腺細胞（包括胰島細胞）、肝細胞、心肌細胞、骨細胞（例 如，骨髓干細胞）、造血干細胞、脾臟細胞、角質形成細胞、成纖維細胞、內皮細胞、前列腺細 胞、生殖細胞等?？商娲?，細胞可以是任何祖細胞。作為另一個替代物，細胞可以是干細 胞（例如，神經干細胞、肝干細胞）。此外，細胞可以是來自于任何種類的來源，如上面所指 出。
[0060] 在本發(fā)明的【具體實施方式】中，從受試對象中取出細胞，將細小病毒載體導入其中， 然后將細胞替換回受試對象中。從受試對象中取出細胞用于離體治療接著導入受試對象中 方法的在本領域是已知的?？商娲?，將rAAV載體導入來自另一個受試對象的細胞，導入 培養(yǎng)的細胞中，或者導入來自任何其它合適來源的細胞，并且將細胞給予需要它的受試對 象。
[0061] 用于離體基因治療的合適細胞包括但不限于：肝細胞、神經細胞（包括中樞神經 系統(tǒng)和周圍神經系統(tǒng)的細胞，特別是腦細胞）、胰腺細胞、脾臟細胞、成纖維細胞（例如，皮 膚成纖維細胞）、角質形成細胞、內皮細胞、上皮細胞、成肌細胞、造血細胞、骨髓間質細胞、 祖細胞、和干細胞。
[0062] 給予受試對象的細胞的劑量將根據受試對象的年齡、主體的病情和種屬、細胞的 類型、細胞所表達的核酸、給藥方式等而變化。通常，每個劑量將給予至少大約IO 2至大約 1〇8、優(yōu)選地大約IO3至大約10 6個細胞。優(yōu)選地，以"治療有效量"給予細胞。
[0063] 本文中使用的"治療有效"量是足以緩解（例如，減輕、減弱、減?。┡c疾病相關的 至少一種癥狀的量?？商娲?，"治療有效"量是足以提供對受試對象病情的一些改善的量。
[0064] 本發(fā)明的另一方面是一種用本發(fā)明的病毒顆粒對受試對象進行體內治療的方法。 本發(fā)明的細小病毒顆粒向有需要的人受試對象或動物的給藥，可以采用本領域中已知的用 于給予病毒載體的任何方法。
[0065] 示例性的給藥方式包括：口服、直腸、經粘膜、局部、經皮、吸入、胃腸外（例如，靜 脈、皮下、皮內、肌肉、和關節(jié)內）給藥等方式，以及直接組織或器官注射，可替代地，鞘內、 直接肌肉、心室內給藥、靜脈給藥、腹腔內給藥、鼻內給藥、或眼內注射?？梢砸猿Ｒ?guī)的方式 將注射劑制備成溶液劑或懸浮劑、適合用于注射前的液體中的溶液劑或懸浮劑的固體形 式、或者乳劑的形式?？商娲兀梢跃植慷皇窍到y(tǒng)的方式給予例如在貯庫或者緩釋制劑 中的病毒。
[0066] 在本發(fā)明的具體執(zhí)行的實施方式中，將所研究的核苷酸序列傳輸至受試對象的肝 臟?？衫帽绢I域已知的任何方法實現對肝的給藥，包括但不限于：靜脈給藥、門靜脈給藥、 膽管給藥、動脈內給藥、和直接注射入肝實質。
[0067] 優(yōu)選地，利用編碼肽或蛋白質的重組細小病毒載體來感染細胞（例如，肝細胞）， 這些細胞表達編碼的肽或蛋白質并且以治療有效量將其分泌入循環(huán)系統(tǒng)（如上所定義 的）。可替代地，利用另一種細胞或組織（包括但不限于大腦、胰腺、脾臟或肌肉）來傳遞和 表達載體。
[0068] 在其它優(yōu)選實施方式中，將本發(fā)明的細小病毒顆粒通過肌肉注射給藥，更優(yōu)選地 利用肌肉注射或者利用局部給藥（如上所定義的）。在其它優(yōu)選實施方式中，將本發(fā)明的細 小病毒顆粒給予肺。
[0069] 可利用任何合適的方法將本文中公開的細小病毒載體給予受試對象的肺，但優(yōu)選 地通過給予由受試對象所吸入的本發(fā)明的細小病毒載體所構成的可吸入顆粒的氣霧劑懸 浮液的方式而給予?？晌腩w?？梢允且后w或者固體?？梢岳萌魏魏线m的方式（諸如用 壓力驅動的氣霧劑霧化器或者超聲霧化器）來制造包含本發(fā)明的細小病毒載體的液體顆 粒的氣霧劑，正如本領域技術人員所了解的。參見例如美國專利No. 4, 501，729。包含本發(fā) 明病毒載體的固體顆粒的氣霧劑，同樣地可利用藥學行業(yè)中已知的技術用任何固體顆粒藥 物氣霧劑發(fā)生器而制造。
[0070] 本發(fā)明的細小病毒顆粒的劑量將基于給藥方式、擬被治療的疾病或病情、單獨受 試對象的病情、具體的病毒載體、擬被給予的基因；并且可以常規(guī)的方式來決定。用于獲得 治療效果的示例性劑量為至少大約 105、106、107、108、109、l〇 1Q、?ο11、?ο12、?ο13、?ο14、?ο 15、?ο16 個或更多轉導單元、或者更優(yōu)選大約IO8至10 13個轉導單元、更優(yōu)選10 12個轉導單元的病毒 滴度。
[0071] 總之，本發(fā)明的細小病毒載體、試劑、和方法可以應用將核酸引導到分裂的細胞或 者非分裂的細胞，并且穩(wěn)定地在其中表達異源核酸。利用此載體系統(tǒng)，現在可以以體外或體 內方式將編碼影響細胞生理的蛋白質的基因導入細胞。因此，本發(fā)明的載體可以用于疾病 狀態(tài)的基因治療、或者用于細胞生理的實驗性修改。
[0072] 提供以下的實施例來說明本發(fā)明的某些實施方式。其目的不是以任何方式限制本 發(fā)明。 實施例I
[0073] 賴氨酸到精氨酸突變影響腺相關病毒轉導率和MHC給藥
[0074] AAVl和AAV8載體中被靶向的賴氨酸殘某的鑒定
[0075] 我們利用UbPred軟件來預測在AAV1、AAV2、AAV8和Rh74衣殼蛋白上的可能的泛 素化位點（Radivojac P et al, 2010) oUbPred 軟件從網站http ://www. ubpred. org/index. him!在線獲得。分析的輸出是對在指定的腺相關病毒血清型衣殼序列中的泛素化而言重要 的賴氨酸殘基的預測。見圖1和表1。這些如下：
[0076] AAVl衣殼蛋白VPl序歹1丨: MAADGYLPDffLEDNLSEGIREffffDLKPGAPKPKANQQKQDDG RGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKA ⑶NPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPL GLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFG QTCDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGA DGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISS ASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNW GFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQ LPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYC LEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQ YLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYR QQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKD DEDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVAT ERFGTVAVNFQSSSTDPATCDVHAMGALPGMVWQDRDVYLQGP IWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSA TKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSA NVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRP 賴氨酸 位置評分泛素化 26 0_59 否 31 0.55 否 33 0_47 否 38 0.61 否 51 0_54 否 61 0.72是中等置信度 77 0.63是低置信度 84 0.72是中等置信度 122 0.17 否 123 0.26 否 137 0.90是高置信度 142 0.62是低置信度 143 0.81是中等置信度 161 0.70是中等置信度 168 0.25 否 169 0.26 否 258 0.49 否 310 0·14 否 315 0 15 否 322 0.48 否 459 0.8丨是中等置信度 476 0.43 否 491 0.20 否 493 0 28 否 508 0.62是低置信度 528 0.67是低置信度 533 0.70是中等置信度 545 0.65是低置信度 567 0.66是低置信度 621 0.50 否 641 0.50 否 650 0.45 否 666 0.58 否 689 0.65是低置信度 693 0.65是低置信度 707 0.78是中等置信度 圖例： 標注 評分范圍 敏感性 特異性 低置信度 0.62 < s < 0.69 0.464 0.903 中等置信度 0.69 < s < 0.84 0.346 0.950 高置信度 0.84<s< 1.00 0.197 0.989 AAV-I中的期望的突變體 AAV8衣殼蛋白VPl序列：

【權利要求】
1. 一種改進的腺相關病毒（AAV)載體，所述載體包含VP1衣殼蛋白，所述VP1衣殼蛋白 包含一個或多個賴氨酸替換，所述載體還包含小基因，所述小基因包含AAV反向末端重復 和能操作連接到調控序列的異源核酸序列，所述調控序列引導在宿主細胞中由所述異源核 酸序列對產物的表達，所述賴氨酸替換對于抑制所述衣殼蛋白的泛素化是有效的，由此增 加所述AAV載體向靶細胞中的轉導。
2. 如權利要求1所述的AAV載體，所述載體具有選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV-rh74、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8 和 AAV9 中的血清型。
3. 如權利要求1所述的AAV載體，所述載體包含VP1衣殼蛋白，所述VP1衣殼蛋白具 有在表中所示的賴氨酸殘基處的至少一個賴氨酸替換，其中所述至少一個替換提高轉導效 率。
4. 如權利要求2所述的AAV載體，所述載體包含選自AAV8K137R、AAV8K333R和 AAV8K530R中的改變的AAV8VP1衣殼蛋白。
5. 如前述權利要求中任一項所述的AAV載體，其中所述異源核酸序列的表達產物是治 療性肽或核酸。
6. 如權利要求5所述的AAV載體，其中所述治療性肽是選自第八因子、第九因子或者其 功能性片段中的凝血因子。
7. 如權利要求4所述的AAV8載體，其中所述異源核酸序列的表達產物是IgG、IgM、 IgA、IgD、IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗體、或者單鏈抗體。
8. 如權利要求7所述的AAV8載體，其中所述異源核酸序列的表達產物是嵌合免疫球蛋 白。
9. 如權利要求4所述的AAV8載體，其中所述異源核酸序列的表達產物是單鏈抗體。
10. 如權利要求5所述的AAV載體，其中所述表達產物是抗病毒RNAi。
11. 如權利要求10所述的AAV載體，其中所述抑制性RNA對于抑制HCV的感染和復制 是有效的。
12. 如權利要求10所述的AAV載體，其中所述抑制性RNA對于抑制真核靶基因的表達 是有效的。
13. 如權利要求4所述的AAV載體，其中所述轉基因編碼疾病修飾細胞因子。
14. 如權利要求4所述的AAV載體，其中所述轉基因編碼成對的鋅指核酸酶。
15. 如權利要求1所述的AAV載體，所述載體包含2、3或4個賴氨酸替換。
16. 如權利要求3所述的AAV載體，其進一步包括包含VP1衣殼蛋白的第二AAV載體， 所述VP1衣殼蛋白具有在表中所示賴氨酸殘基處的至少一個賴氨酸替換，其中所述替換降 低轉導效率，所述第二AAV載體的傳遞對于中和對第一 AAV載體的抗體應答是有效的。
17. -種藥物組合物，包含如權利要求3所述的AAV載體及其生理學相容的載體。
18. -種細胞培養(yǎng)物，包含如權利要求1所述的AAV載體。
19. 一種將轉基因傳遞至受試對象中的細胞的方法，所述方法包括使所述細胞與如權 利要求17所述的藥物組合物接觸的步驟，其中所述AAV載體包含所述轉基因，其中所述VP1 衣殼蛋白中所述賴氨酸替換的存在與所述衣殼的泛素化的減小相關，由此提高使用所述載 體的靶細胞的轉導效率。
20. 如權利要求19所述的方法，其中所述轉基因是第九因子。
21. -種藥物組合物，包含如權利要求16所述的AAV載體及其生理學相容的載體。
22. -種將轉基因傳遞至受試對象的細胞的方法，所述方法包括使所述細胞與如權利 要求21所述的藥物組合物接觸的步驟，其中所述第一 AAV載體包含所述轉基因，其中所述 賴氨酸替換在所述VP1衣殼蛋白中的存在與所述衣殼的泛素化的減小相關，由此提高使用 所述載體的靶細胞的轉導效率，并且所述第二載體顯示相對于野生型降低的轉導效率并且 對中和不希望有的對所述第一 AAV載體的抗體應答是有效的。
23. 如權利要求22所述的方法，其中所述轉基因是第九因子。
【文檔編號】C07K14/015GK104487579SQ201380020980
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年4月18日 優(yōu)先權日:2012年4月18日
【發(fā)明者】穆斯塔法·N·雅思斯格魯, 費德里科·麥格茲, 澤維爾·安谷拉, 凱瑟琳·A·海 申請人:費城兒童醫(yī)院