一種增強(qiáng)植物耐鹽性的擬南芥AtPGK2基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明克隆了一種增強(qiáng)植物耐鹽性的擬南芥3-磷酸甘油酸激酶基因AtPGK2，并公開了其應(yīng)用。該基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，也包括與SEQIDNO:1核苷酸序列同源性在90～100%之間的基因。本發(fā)明同時還提供了重組載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因的方法以應(yīng)用上述基因，可培育耐鹽性更強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物新品種，具有廣泛的應(yīng)用價值。
【專利說明】-種增強(qiáng)植物耐鹽性的擬南芥基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體說是利用分子生物學(xué)技術(shù)獲得一種能夠增強(qiáng) 植物耐鹽性的基因及其在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 土壤鹽漬化在全世界都十分嚴(yán)重，鹽脅迫是影響全球農(nóng)作物產(chǎn)量的重要非生物脅 迫之一（Parvaiz and Satyawati, 2008)。我國鹽漬土面積大、分布廣、類型多，約占國土 面積的10%，而且每年鹽堿化和次生鹽堿化都在不斷加重，使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展受到威 脅，嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育和經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量與品質(zhì)(孫建昌等，2008)。因此，培育耐鹽 性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物新品種是一項(xiàng)十分迫切的任務(wù)。
[0003] 植物基因工程是指在生物體外，利用工具酶對DNA分子進(jìn)行"剪接"和"拼接"形 成重組的DNA分子，將其轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并使其表達(dá)。目前，利用植物基因工程培育耐鹽性 增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物新品種已取得一定的進(jìn)展。許多研究表明，將植物的耐鹽相關(guān)基因?qū)?自身或者其他物種的細(xì)胞并產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株，可以顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽能力。如在 擬南芥中過量表達(dá)玉米的基因能夠提高轉(zhuǎn)基因植株在萌發(fā)期和幼苗期對鹽脅迫的 耐受性（Wang et al.，2007);Chen等（2008)利用組成型啟動子dKJ仍驅(qū)動擬南芥 基因在蕎麥中過量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因蕎麥植株中主要營養(yǎng)成分的含量未受高鹽脅迫的影 響；Liang等（1997)利用dK J仍啟動子驅(qū)動菠菜的似Μ基因在煙草植株中過量表達(dá)， 轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性顯著提高。
[0004] 植物的3_磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase, PGK)作為重要的酶催 化3-磷酸甘油酸和1，3-二磷酸甘油酸之間的互變，在碳固定、糖酵解和糖異生代謝中具 有重要功能（Blake and Rice, 1981; Watson et al·，1982)。目前，許多編碼 PGKs 的 基因在植物、動物和微生物中被克?。╓atson and Littlechild，1990)。在植物中，如豌 豆（Pacold and Anderson, 1975)、小麥（Longstaff et al·，1989)、大麥（McMorrow and Bradbeer, 1990)、疲菜（Kopke-Secundo et al·，1990)和番爺（Rao et al·，1995)等 的PGKs先后被分離和克隆，并且其編碼的蛋白多數(shù)被純化用于酶活性研究。序列分析表 明，高等植物的PGKs由兩個細(xì)胞核基因編碼，其編碼蛋白的氨基酸序列具有較高的同源 性，其中，一個基因編碼的氨基酸序列在N-末端有一段大約由70個氨基酸組成的定位于 葉綠體的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，相反，另一個基因編碼的氨基酸序列在N-末端并無轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列。因此， 推測由高等植物細(xì)胞核編碼的兩個PGKs分別定位于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)（Longstaff et al.， 1989; Kitayama and Togasaki, 1995)。以上所述對高等植物PGKs基因的分離、克隆、序 列分析和其編碼蛋白的酶活性研究多數(shù)集中在上世紀(jì)后期。進(jìn)入本世紀(jì)，雖然近期有研究 表明在鹽脅迫條件下，植物體內(nèi)PGK蛋白的含量顯著增加 （Kosova et al.，2011; Wang et al.，2013)，但是對于其生理功能特別是參與植物響應(yīng)鹽脅迫的功能尚不清楚。
[0005] 植物為適應(yīng)鹽脅迫，以最大限度減少鹽脅迫對自身的傷害，從對鹽脅迫信號的感 知、胞間信號傳遞和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到最終調(diào)控脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，使植物產(chǎn)生一系列形 態(tài)、生理和生化的變化來抵御鹽脅迫（Zhu, 2002; Jiang and Deyholos, 2006; Radi et al.，2013)。為了挖掘植物耐鹽基因并培育耐鹽性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物，本發(fā)明克隆了擬南 芥編碼3-磷酸甘油酸激酶基因?qū)⒃摶蜣D(zhuǎn)化模式植物擬南芥，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥 植株對鹽脅迫的耐受性明顯增強(qiáng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是分離和克隆植物的耐鹽基因，并對其參與鹽脅迫響應(yīng)的功能進(jìn)行鑒 定，提供一種分子生物學(xué)模式植物擬南芥3-磷酸甘油酸激酶基因及其在轉(zhuǎn)基因植 物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供了一種新的、1437 bp的擬南芥3-磷酸甘油酸激酶基因序列， 該基因的核酸序列選自： (a) 如序列表SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列； (b) 在（a)限定的核酸序列中具有90?100%之間的同源性核苷酸序列。作為具體應(yīng) 用的實(shí)例，本發(fā)明提供了一種擬南芥編碼3-磷酸甘油酸激酶基因的克隆方法，具體 操作步驟如下： (1) 提取擬南芥植株的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA ; (2) 以cDNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增Ji/^似基因的⑶S序列； (3) 回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0008] 本發(fā)明同時提供了擬南芥3-磷酸甘油酸激酶基因植物耐鹽性脅迫的應(yīng) 用，即：利用克隆的基因的CDS序列，構(gòu)建的融合基因，進(jìn)行植 物轉(zhuǎn)化，從而獲得在擬南芥中組成型表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。其中所述的融合 基因中的目的基因可以是任何針對基礎(chǔ)研究、轉(zhuǎn)化技術(shù)、花卉或者農(nóng)作物耐鹽性狀改良需 要的目的基因。
[0009] 作為具體應(yīng)用的實(shí)例，本發(fā)明提供了一種"dK "融合基因的構(gòu)建及 其在轉(zhuǎn)基因擬南芥參與鹽脅迫的應(yīng)用。具體操作過程如下： (1) 用Afco I/fc仿11雙酶切通過PCR擴(kuò)增的J ?/^尤?基因的⑶S序列片段； (2) 用Afco I/fc仿II雙酶切pCAMBIA 1301 (購自CAMBIA公司）質(zhì)粒，回收大的載體 片段； (3) 混合上述第一步得到的^#6尤?基因的⑶S序列片段和第二步得到的pCAMBIA 1301載體大片段，在連接酶催化下進(jìn)行連接反應(yīng)，完成在pCAMBIA 1301載體上的"dK "融合基因的構(gòu)建。
[0010] 其中所設(shè)計(jì)的J 基因的⑶S序列的PCR擴(kuò)增引物如下，其中上游引物引入了 Afco I酶切位點(diǎn)，下游引物引入了 仿II酶切位點(diǎn)： 上游引物：5 ' -CATGCCATGGCTTCCACCGCCGCAACTGCA-3 ' 下游引物：5' -GGGTAACCTTAAACAGTGACTGGCGTTGCT-3，。
[0011] 所述應(yīng)用中的"dK "融合基因的構(gòu)建在轉(zhuǎn)基因擬南芥中組成型表達(dá) 表達(dá)，操作過程如下： 擬南芥轉(zhuǎn)化的具體方法，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Floral dip的方法（Clough and Bent, 1998)，獲得的種子經(jīng)過50 mg Γ1潮霉素抗性篩選，生長正常的抗性植株轉(zhuǎn)土培養(yǎng)，利用50 mg Γ1的潮霉素進(jìn)行抗性篩選獲得轉(zhuǎn)化4^6尤?基因的純合轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，然后檢測轉(zhuǎn) 基因擬南芥株系的耐鹽性。
[0012] 本發(fā)明的積極效果： 試驗(yàn)結(jié)果表明，將克隆的編碼3-磷酸甘油酸激酶基因轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，可 以顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。本發(fā)明的融合基因構(gòu)建"dK "可作為基因 資源在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上使用或選育轉(zhuǎn)基因植物以提高耐鹽性，具有廣泛的應(yīng)用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1是轉(zhuǎn)化"dK 融合基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中目的基因 的表達(dá)分析，#P < 0. 01。
[0014] 圖2是轉(zhuǎn)化"dK "融合基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系幼苗期的耐鹽性 分析。
[0015] 圖3是轉(zhuǎn)化"dK J"融合基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系成苗期的耐鹽性 分析。*Ρ < 0.05。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 實(shí)施例1 :擬南芥編碼3-磷酸甘油酸激酶基因的克隆 (1)利用異硫酸腈胍-酚法提取擬南芥植株的總RNA，藥品的使用、配制以及具體操作 步驟參考黃培堂等（2002)的方法。
[0017] (2 )根據(jù)已知的擬南芥J 基因的⑶S序列設(shè)計(jì)特異引物，在上游引物中引入 Afco I酶切位點(diǎn)，在下游引物中引入仿11酶切位點(diǎn)。
[0018] h游引物：5' -CATGCCATGGCTTCCACCGCCGCAACTGCA-3' (引入 Afco I 酶切位點(diǎn)） 下游引物：5' -GGGTAACCTTAAACAGTGACTGGCGTTGCT-3' (引入仿 II 酶切位點(diǎn)） (3)取1 mg RNA作反轉(zhuǎn)錄的模板，以P2853為引物利用Promega的反轉(zhuǎn)錄酶ImProm-II ?進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，P2853引物序列、反轉(zhuǎn)錄程序和反轉(zhuǎn)錄體系如下。
[0019] P2853 引物序列：5' -GCGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' 反轉(zhuǎn)錄程序： 72°C 5分鐘；25°C 5分鐘；42°C 60分鐘；80°C 20分鐘；4°C保溫。
[0020] 反轉(zhuǎn)錄體系：

【權(quán)利要求】
1. 一種增強(qiáng)植物耐鹽性的擬南芥基因，其特征在于，是下列核苷酸序列之一： (a) 如序列表SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列； (b) 在（a)限定的核酸序列中具有90?100%之間的同源性核苷酸序列。
2. 如權(quán)利要求1所述增強(qiáng)植物耐鹽性的擬南芥基因的克隆方法，具體操作步驟 如下： (1) 提取擬南芥植株的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA ; (2) 以cDNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增Ji/^似基因的⑶S序列； (3) 回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
3. 如權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)植物耐鹽性的擬南芥基因的應(yīng)用，它是利用克隆 的基因的CDS序列，構(gòu)建" dK "的融合基因，進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化，從而獲 得在擬南芥中組成型表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的融合基因中的目的 基因可以是任何針對基礎(chǔ)研究、轉(zhuǎn)化技術(shù)、花卉或者農(nóng)作物耐鹽性狀改良需要的目的基因； "dK 融合基因的構(gòu)建及其在轉(zhuǎn)基因擬南芥參與鹽脅迫的應(yīng)用，具體操作過 程如下： (1) 用Afco I/fc仿11雙酶切通過PCR擴(kuò)增的J ?/^尤?基因的⑶S序列片段； (2) 用Afco I/fc仿II雙酶切pCAMBIA 1301 (購自CAMBIA公司）質(zhì)粒，回收大的載體 片段； (3) 混合上述第一步得到的^#6尤?基因的⑶S序列片段和第二步得到的pCAMBIA 1301載體大片段，在連接酶催化下進(jìn)行連接反應(yīng)，完成在pCAMBIA 1301載體上的"dK "融合基因的構(gòu)建； 其中所設(shè)計(jì)的基因的CDS序列的PCR擴(kuò)增引物如下，其中上游引物引入了 Afco I酶切位點(diǎn)，下游引物引入了辦仿Π 酶切位點(diǎn)： 上游引物：5 ' -CATGCCATGGCTTCCACCGCCGCAACTGCA-3 ' 下游引物：5' -GGGTAACCTTAAACAGTGACTGGCGTTGCT-3' ； 所述應(yīng)用中的" dK "融合基因的構(gòu)建在轉(zhuǎn)基因擬南芥中組成型表達(dá)，操 作過程如下：擬南芥轉(zhuǎn)化的具體方法，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Floral dip的方法，獲得的種子 經(jīng)過50 mg Γ1潮霉素抗性篩選，生長正常的抗性植株轉(zhuǎn)土培養(yǎng)，利用50 mg Γ1的潮霉素 進(jìn)行抗性篩選獲得轉(zhuǎn)化基因的純合轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，然后檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥株 系的耐鹽性； 所述植物為小麥、大麥、水稻、玉米、大豆、花生、棉花、馬鈴薯、油菜、番茄、黃瓜、苜蓿或 擬南芥。
【文檔編號】C12N15/54GK104120138SQ201410358406
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月26日
【發(fā)明者】劉棟, 李衛(wèi)春, 馬利霞, 程建峰 申請人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)