專利名稱：一種與植物耐鹽性相關(guān)的miRNA——gma-miRN11及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與植物耐鹽性相關(guān)的miRNA，尤其是一種來源于大豆根瘤的、能夠調(diào)節(jié)大豆耐鹽性的新miRNA ；本發(fā)明還涉及此miRNA的前體、其前體的編碼基因及其用途。
背景技術(shù)：
miRNA是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一種長(zhǎng)20 24 nt的內(nèi)源性非蛋白編碼RNA。miRNA 基因最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNAs。隨后pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)出核，在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通過序列互補(bǔ)與特定靶基因的mRNA結(jié)合，引起mRNA 降解或抑制mRNA翻譯從而對(duì)基因的表達(dá)起到負(fù)調(diào)節(jié)作用(Llave et al. , 2002; Palatnik et al. , 2003; Tang et al. , 2003)。土壤鹽漬化嚴(yán)重影響著植物的生長(zhǎng)與發(fā)育，制約著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。大豆是世界上重要的蛋白和油料作物。植物在應(yīng)對(duì)鹽脅迫時(shí)會(huì)有一系列的保護(hù)機(jī)制，研究大豆抗鹽的分子機(jī)制，培育大豆耐鹽新品種是提高大豆產(chǎn)量的一個(gè)主要途徑。目前，在植物抗鹽機(jī)制研究中， 研究較為清楚的是SOS途徑(Qiu et al. , 2002; Quintero et al.，2002)，大豆中也克隆到了一些抗鹽相關(guān)的基因(Li et al. , 2005; Liao et al. , 2008; Xie et al. , 2009; Cheng et al.，2009)。另外，有研究表明，microRNA (miRNA)在植物抗鹽機(jī)制中也發(fā)揮重要作用(Zhu et al. , 2004; Jung et al. , 2007; Zhao et al. , 2009)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種與植物耐鹽性相關(guān)的miRNA、其前體序列及其前體序列的編碼基因，利用此miRNA能夠提高大豆的耐鹽性，對(duì)提高大豆產(chǎn)量具有重大的意義。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。一種與植物耐鹽性相關(guān)的miRNA，其具有序列表中SEQ ID NO 1所示的序列。上述與植物耐鹽性相關(guān)的miRNA的前體序列，其具有序列表中SEQ ID NO 2所示的序列。編碼上述與植物耐鹽性相關(guān)的miRNA前體序列的DNA序列，其具有序列表中SEQ ID NO 3所示的序列。上述與植物耐鹽性相關(guān)的miRNA在培育耐鹽轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。作為上述應(yīng)用的一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述耐鹽轉(zhuǎn)基因植物為大豆。作為上述應(yīng)用的一種優(yōu)選技術(shù)方案，在大豆中過表達(dá)SEQ ID NO :1所示的miRNA， 或抑制SEQ ID NO 1所示miRNA的表達(dá)，培育出具有高耐鹽性的轉(zhuǎn)基因大豆。采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于本發(fā)明提供了一種新的大豆miRNA， Solexa測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明miRNA的表達(dá)受到鹽脅迫的調(diào)節(jié)，說明其在大豆適應(yīng)高鹽脅迫機(jī)制中起重要作用，基于此，可利用其培育具有高耐鹽性的轉(zhuǎn)基因大豆，對(duì)提高大豆產(chǎn)量具有重大的意義。


圖1為gma-miRNll在Solexa測(cè)序中鹽脅迫和非鹽脅迫條件下表達(dá)次數(shù)的較， 結(jié)果顯示，gma-miRNll在正常生長(zhǎng)條件下表達(dá)數(shù)為0，鹽處理后表達(dá)次數(shù)為475，表明 gma-miRNll的表達(dá)受到鹽脅迫的調(diào)節(jié)，說明其在大豆適應(yīng)高鹽脅迫機(jī)制中起重要作用。圖2為gma-miRNll前體序列的莖環(huán)結(jié)構(gòu)圖，可見其前體序列折疊成一種穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，屬于miRNA前體典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)，符合miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征。圖3為實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)gma-miRNll在鹽脅迫條件下和非鹽脅迫條件下表達(dá)特征的分析結(jié)果，結(jié)果顯示gma-miRNll的表達(dá)受鹽誘導(dǎo)明顯上調(diào)，說明其在大豆適應(yīng)高鹽脅迫機(jī)制中起重要作用。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例詳細(xì)說明了本發(fā)明。本發(fā)明所使用的各種原料及各項(xiàng)設(shè)備均為常規(guī)市售產(chǎn)品，均能夠通過市場(chǎng)購買直接獲得。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)， 結(jié)果取平均值。本發(fā)明提供的miRNA來源于大豆成熟根瘤，命名為gma-miRNll，其長(zhǎng)度為21nt ；參看附圖2，其前體序列可折疊成一種穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，屬于miRNA前體典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)，符合miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征。實(shí)施例1 =Solexa測(cè)序分析驗(yàn)證gma-miRNll在大豆耐鹽機(jī)制中的作用一、材料培養(yǎng)及NaCl處理
猴子毛大豆種子用70%的酒精滅菌30 S，dH20沖洗6遍后播種于無菌培養(yǎng)皿中，皿底置2張無菌濾紙，dH20浸濕，28 °C暗萌發(fā)3天；芽長(zhǎng)至2 cm時(shí)，移至放有濕潤(rùn)濾紙的試管中，芽長(zhǎng)至4 5 cm，移至活化的根瘤菌菌液中，接種30 min，低N水培，10，000 lx，溫度為26 °C，相對(duì)濕度為70%，培養(yǎng)28天，125 mM NaCl處理5小時(shí)，對(duì)照為正常環(huán)境，取根瘤， 液氮冷凍，_80°C儲(chǔ)藏。二、Solexa 測(cè)序分析
上步所得樣品送往華大基因公司，進(jìn)行solexa測(cè)序及分析，參看圖1，結(jié)果顯示， gma-miRNll在正常生長(zhǎng)條件下表達(dá)數(shù)為0，鹽處理后表達(dá)次數(shù)為475，這表明gma-miRNll的表達(dá)受到鹽脅迫的調(diào)節(jié)，說明其在大豆適應(yīng)高鹽脅迫機(jī)制中起重要作用，在大豆中過表達(dá) gma-miRNll，或抑制gma-miRNll的表達(dá)，將影響大豆對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)能力，培育出具有高耐鹽性的轉(zhuǎn)基因大豆，對(duì)提高大豆的產(chǎn)量具有重大的意義。實(shí)施例2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time PCR)分析驗(yàn)證gma-miRNll在大豆耐鹽機(jī)制中的作用
一、材料培養(yǎng)及NaCl處理
猴子毛大豆種子用70%的酒精滅菌30 S，dH20沖洗6遍后播種于無菌培養(yǎng)皿中，皿底置2張無菌濾紙，dH20浸濕，28 °C暗萌發(fā)3天；芽長(zhǎng)至2 cm時(shí)，移至放有濕潤(rùn)濾紙的試管中，芽長(zhǎng)至4 5 cm，移至活化的根瘤菌菌液中，接種30 min，低N水培，10，000 lx，溫度為26 °C，相對(duì)濕度為70%，培養(yǎng)28天，125 mM NaCl處理5小時(shí)，對(duì)照為正常環(huán)境，取根瘤， 液氮冷凍，"80°C儲(chǔ)藏；
4二、miRNA的分離，用microRNA提取試劑盒(百泰克公司，Cat# RP5301)取樣提取小片段RNA，提取方法如下
(1)勻漿處理所取根瘤用液氮在研缽內(nèi)快速磨碎，每50 100mg組織加1 ml試劑盒內(nèi)的裂解液后勻漿；
(2)將勻漿樣品劇烈震蕩混勻，在15 30°C條件下孵育5min以使核蛋白體完全分
解
(3)在4°C的條件下12，000rpm離心10 min，小心取上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的RNase free 的離心管中；
(4)每1ml裂解液加0. 2 ml氯仿；蓋緊樣品管蓋，劇烈振蕩15s并將其在室溫下孵育 3min ；
(5)樣品于4°C、12，000rpm離心10 min，會(huì)分成三層下層有機(jī)相，中間層和上層無色的水相，RNA存在于水相中；水相層的容量大約為所加裂解液體積的60%，把水相轉(zhuǎn)移到新管中，進(jìn)行下一步操作；
(6)加入0.6倍體積70%乙醇，顛倒混勻(此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀)；得到的溶液和可能沉淀一起轉(zhuǎn)入microRNA提取試劑盒內(nèi)的吸附柱RA中；
(7)10，000rpm離心45 s，收集下濾液(下濾液中含有miRNA)，準(zhǔn)確估計(jì)下濾液的體積，加入2/3倍體積的無水乙醇，顛倒幾次混勻，將混合液倒入到microRNA提取試劑盒內(nèi)的吸附柱RB中，10，000 rpm離心30 s，棄掉廢液；
(8)加入700μ 1試劑盒內(nèi)的漂洗液RW，12，000 rpm離心60 s，棄掉廢液；
(9)加入500μ 1試劑盒內(nèi)的漂洗液RW，12，000 rpm離心60 s，棄掉廢液；
(10)將吸附柱RB放回空收集管中，12，000rpm離心2 min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)；
(11)取出吸附柱RB，放入一個(gè)RNasefree離心管中，在吸附膜中間部位加60 80 μ 1 RNase free water (事先在65 70°C水浴中加熱)，室溫放置2 min，然后12,000 rpm離心1 min ；收集得到純凈microRNA保存于-80 °C冰箱；
三、反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用天根miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒將純化的miRNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA
(DmiRNA的Poly㈧加尾，反應(yīng)液配方為(除miRNA外的各成分均取自上述試劑盒) miRNA, 6 μ 1 ;E_PAP (5U/μ 1 )，0. 4 μ 1 ;10XPAP Buffer, 2 μ 1 ；5XrATP solution, 4 μ 1 ；Nuclease-free Water, 7. 6 μ 1 ；總體積，20 μ 1 ；輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心使得管壁上的反應(yīng)液沉落，37°C反應(yīng)60min;所得反應(yīng)液可以直接進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，也可以放置在-20°C短暫保存，如需長(zhǎng)期保存存放于-80°C ；
(2) Poly(A)修飾的miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)液配方為(除Poly (A)反應(yīng)液外的各成分均取自試劑盒):Poly(A)反應(yīng)液，2 μ 1 ；10XRT primer,2y 1 ；10XRT Buffer,2y 1 ；超 t屯 dNTP Mixture(2. 5Mm),1 μ 1 ；Rnasin(40U/μ 1)，1 μ 1；Quant Rtase,0. 5μ 1 ；RNase-free ddH20,1. 5μ 1 ；總體積，20 μ 1 ；輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心使得管壁上的反應(yīng)液沉落，37。C反應(yīng)60min ；合成的cDNA反應(yīng)液放置_20°C保存，也可以直接進(jìn)行下游熒光定量檢測(cè)；
四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR:混勻如下反應(yīng)體系，然后分裝入96孔光學(xué)板中，并覆蓋上光學(xué)膜，擴(kuò)增使用的儀器為 ABI公司的熒光定量PCR儀；
擴(kuò)增程序?yàn)?5 "C 30s ；95 "C 5 s，60 "C 34s,45 cycles ；95 "C 15 s，60 "C lmin, 95 "C 15 s ；
20 μ 1 反應(yīng)體系配制如下DNA 模板，2 μ 1 ；SYBR Primix Ex taq (2X), 10 μ 1 ；PCR Forward PrimerClOy Μ),0. 4μ 1 ；PCR Reverse PrimerClOy M),0. 4μ 1 ；ROX Reference Dye II (50 X)，0. 4 μ 1 ;ddH20，6. 8 μ 1 ；總體積，20 μ 1 ;
弓丨物序列 *:N11-F:AAAGCCATGACTTACACACGC(SEQ ID NO 4) ；5. 8S rRNA-F ACGCCTGCCTGGGTGTCACAC (SEQ ID NO 5) ；AMRM :GCGAGCACAGAATTAATACGACT (SEQ ID NO: 6) ；(5. 8S rRNA為內(nèi)參，AMRM為反向引物)； 五、結(jié)果
參看圖3，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的結(jié)果顯示gma-miRNll的表達(dá)受鹽誘導(dǎo)明顯上調(diào)， 這同樣表明gma-miRNll的表達(dá)受到鹽脅迫的調(diào)節(jié)，在大豆中過表達(dá)gma-miRNll，或抑制 gma-miRNll的表達(dá)，將影響大豆對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)能力，培育出具有高耐鹽性的轉(zhuǎn)基因大豆， 對(duì)提高大豆的產(chǎn)量具有重大的意義。 上述描述僅作為本發(fā)明可實(shí)施的技術(shù)方案提出，不作為對(duì)其技術(shù)方案本身的單一限制條件。
權(quán)利要求
1.一種與植物耐鹽性相關(guān)的miRNA，其特征在于其具有序列表中SEQ ID N0:1所示的序列。
2.權(quán)利要求1所述的與植物耐鹽性相關(guān)的miRNA的前體序列，其特征在于其具有序列表中SEQ ID NO 2所示的序列。
3.編碼權(quán)利要求2所述的與植物耐鹽性相關(guān)的miRNA前體序列的DNA序列，其特征在于其具有序列表中SEQ ID NO 3所示的序列。
4.權(quán)利要求1所述的與植物耐鹽性相關(guān)的miRNA在培育耐鹽轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的與植物耐鹽性相關(guān)的miRNA的用途，其特征在于所述耐鹽轉(zhuǎn)基因植物為大豆。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的與植物耐鹽性相關(guān)的miRNA的用途，其特征在于在大豆中過表達(dá)SEQ ID NO :1所示的miRNA，或抑制SEQ ID NO :1所示miRNA的表達(dá)，培育出具有高耐鹽性的轉(zhuǎn)基因大豆。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與植物耐鹽性相關(guān)的miRNA，其具有序列表中SEQ ID NO1所示的序列；在大豆中過表達(dá)SEQ ID NO1所示的miRNA，或抑制SEQ ID NO1所示miRNA的表達(dá)，以培育出具有高耐鹽性的轉(zhuǎn)基因大豆，對(duì)提高大豆產(chǎn)量具有重大的意義。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102220331SQ20111015539
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者李霞, 石磊, 董章輝 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所