專利名稱：調節(jié)植物器官大小和花器官內部非對稱性的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術和植物學領域；更具體地，本發(fā)明涉及調節(jié)植物器官大小和花器官內部非対稱性的方法。
背景技術：
與動物的器官發(fā)育不同，植物側部器官(如葉和花等)都是在植物的胚后發(fā)育過程中產生的，它們都是由非決定性的莖頂端分生組織干細胞衍生而來。一般來說，整個植物的生長發(fā)育沒有固定的終點，但是植物的個體器官都有特定的大小和形狀。在植物各物種漫長的進化歷程中，植物器官大小千變萬化，例如香蕉樹巨大的葉片和模式植物擬南芥微小葉片。雖然植物間的器官大小差異非常大，但種內植物器官最終大小差異比較小，這說明植物器官的大小受到嚴謹的遺傳調控，由植物基因型和器官屬性所決定。 目前現有的ー些野生型植物，特別是ー些農作物或經濟作物，存在著器官過大或過小以及花型結構不理想的問題，導致花粉不易于傳播或其它問題。以豆科植物為例，大豆花中的雌雄蕊被花瓣嚴密包裹，天然異交率低而且不穩(wěn)定，目前仍未實現大面積、產業(yè)化規(guī)模的制種。在作物生產中，異花授粉主要通過風媒和蟲媒兩種途徑，由于大豆與其他蝶形花科植物一祥，在自然進化過程中，已經形成蟲媒花型。大豆在自然環(huán)境中的異花授粉必須由特定的授粉昆蟲來實現。豆科植物獨特的傳粉情況主要與蝶形花的花瓣結構有關旗瓣大而平展，并且具有鮮艷顏色和能被昆蟲識別的花蜜引導線；翼瓣位居花的兩側、易于授粉昆蟲的降落；兩枚龍骨瓣把雄蕊和柱頭緊密包裹，在授粉昆蟲訪問的情況下，花粉可暴露和黏附在昆蟲的體毛上；當授粉昆蟲訪問不同花朵的時候，便可以完成異花授粉的過程。因此，進行大豆雜種優(yōu)勢利用分子設計育種將主要從改造花型著手。本發(fā)明人先期的研究中，也對大豆花粉的傳播與昆蟲的關系做了一些初步的探討。已有的研究表明，放養(yǎng)切葉蜂有可能解決大豆的雜交問題，但目前切葉蜂的繁衍困難，雜交大豆制種成本比較高。發(fā)掘和利用田間自然狀態(tài)下土著昆蟲進行傳粉，則遇到規(guī)?；N時如何應對大田生產條件下環(huán)境生態(tài)進行控制的難題。另ー個可行的解決途徑則是利用人工馴養(yǎng)的蜜蜂進行傳粉。但是，從目前的研究看，存在著栽培大豆花型與蜜蜂不匹配的情況1，單個大豆花與蜜蜂體形相比偏?。?，與采集大豆花粉的切葉蜂相比，蜜蜂無高效打開大豆花龍骨瓣采集花粉的行為。因此，可以充分利用大豆具有蟲媒花的特點，在豆科作物中克隆決定大豆花型的關鍵基因。在此基礎上，利用轉基因生物技術，改造大豆花型，使之與馴化的蜜蜂相配合。其中的技術關鍵是創(chuàng)造龍骨瓣形態(tài)發(fā)生變化的花型，使雌雄蕊暴露和易于接觸訪花的昆蟲，提高昆蟲的傳粉效率，最終解決大豆雜種優(yōu)勢利用中雜交制種困難的問題。因此，本領域需要對調控植物器官大小或花型的基因進行深入開發(fā)和研究，以使得借助基因工程技術來改變植物器官大小或花型成為可能
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供調節(jié)豆科植物器官大小和花器官內部非対稱性的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多肽，該多肽選自下組(a) SEQ ID NO 6所示氨基酸序列的多肽(ΒΙ0蛋白);(c)將SEQ ID NO 6所示氨基酸序列經過ー個或多個(如1_50個，較佳地1_20個，更佳地1-10個，更佳地1-8個，更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)的多肽相同功能的由(a)衍生的多肽。在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼所述多肽的多核苷酸；或(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。 在另ー優(yōu)選例中，該多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID N0:1或2(編碼的序列相應于SEQ ID NO 6或其衍生多肽)。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多肽的截短體(突變體)，該截短體是如SEQ ID NO 6中第1-328位所示氨基酸序列的多肽。在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，它編碼所述的多肽截短體。在本發(fā)明的另一方面，提供ー種載體，它含有所述的多核苷酸或多核苷酸截短體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有所述的載體，或其基因組中整合有所述的多核苷酸或多核苷酸截短體。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多肽或多肽截短體、或編碼所述多肽或多肽截短體的多核苷酸的用途，用干調節(jié)植物株型大小；調節(jié)植物器官大??；或調節(jié)植物器官的內部非対稱性。在另ー優(yōu)選例中，所述的器官包括(但不限干)葉子(葉片)，花器官(如花瓣)，種子。在另ー優(yōu)選例中，所述的調節(jié)植物器官的內部非対稱性是調節(jié)植物花器官(如花瓣)的內部非対稱性。在另ー優(yōu)選例中，所述的多肽編碼所述多肽的多核苷酸用于促進植物株型變小(過量表達BIO基因出現此表型);促進植物器官變小(過量表達BIO基因出現此表型)；較佳地，所述的器官變小包括但不限于花器官變小、葉片變小、果莢變小(含變短)。在另ー優(yōu)選例中，所述的多肽截短體或編碼所述多肽截短體的多核苷酸用干促進植物器官(如花器官)的內部対稱性。在另ー優(yōu)選例中，所述的調節(jié)植物花器官(如花瓣)的內部非対稱性包括過量表達突變的BIO基因(BlOm，如SEQID NO :6中第1-328位所示氨基酸序列的多肽的編碼基因)出現花器官內部變對稱的表型，而過量表達野生型BIO基因(如SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的多肽的編碼基因)則促進花器官內部非対稱性。在本發(fā)明的另一方面，提供一種所述的多肽或其編碼基因的調節(jié)劑，其是激動劑或抑制劑。在另ー優(yōu)選例中，所述的調節(jié)劑是抑制劑，其是特異性干擾所述的多肽的編碼基因(在mRNA水平上)表達的干擾分子(包括但不限于siRNA，miRNA，shRNA,反義核苷酸)；或是特異性抑制所述的多肽表達的抗體或配體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種調節(jié)植物大小、調節(jié)植物器官大小或調節(jié)植物花器官內部非対稱性的方法，其包括調節(jié)植物中所述的多肽或其編碼基因的表達或活性。在另ー優(yōu)選例中，所述方法包括將編碼BIO蛋白的多核苷酸轉入植物中；或將干擾BIO蛋白的編碼基因表達的干擾分子轉入植物中；或將編碼BIO蛋白的截短體的多核苷酸轉入植物中；或在植物基因組中，將所述的多肽的編碼基因進行突變，從而降低植物中所述的多 肽的表達。在另ー優(yōu)選例中，所述的突變包括插入或缺失突變(如采用T-DNA插入法進行缺失突變)；或快中子誘變。在另ー優(yōu)選例中，所述的快中子誘變方法包括利用快中子誘變獲得植物品系，從中鑒定獲得所述的多肽的編碼基因發(fā)生缺失或突變的植株。鑒定方法較佳地為獲得經由快中子突變處理的植物植株，提取基因組DNA，利用PCR技術來擴增(例如選自SEQ ID NO:16-20的引物擴增)所述的多肽的編碼基因，若沒有獲得擴增產物或擴增產物突變，則該植物中所述的多肽的編碼基因發(fā)生缺失或突變。在另ー優(yōu)選例中，所述方法包括(I)提供攜帯表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有編碼BIO蛋白或的多核苷酸、編碼BIO蛋白的截短體的多核苷酸或干擾BIO蛋白的編碼基因表達的干擾分子；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(I)中的農桿菌接觸，從而使編碼BIO蛋白的多核苷酸、編碼BIO蛋白或的截短體的多核苷酸或干擾BIO蛋白的編碼基因表達的干擾分子轉入植物細胞或組織或器官。 在另ー優(yōu)選例中，所述方法還包括(3)選擇出轉入了編碼BIO蛋白或的多核苷酸、編碼BIO蛋白或的截短體的多核苷酸或干擾所述的BIO蛋白的編碼基因表達的干擾分子的植物細胞或組織或器官；和(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植物。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備植物的方法，將轉入了編碼BIO蛋白的多核苷酸、編碼BIO蛋白的截短體的多核苷酸或干擾所述的BIO蛋白的編碼基因表達的干擾分子的植物與非轉基因植物雜交，獲得雜交后代，該后代在植物株型大小、植物器官大小、植物花器官內部非対稱性方面呈現與非轉基因植物不同的表型。在本發(fā)明的另一方面，提供ー種植物，其由前述任ー制備植物的方法制備獲得。在本發(fā)明的另一方面，提供一種所述的多肽或其截短體的制備方法，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出所述的多肽或其截短體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種所述的多肽或其編碼基因的用途，用作鑒定植物的株型或器官大小，以及鑒定植物器官(如花器官)內部非対稱性的分子標記物。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖I :bio和ele2突變體的表型，分別以它們的野生型作為對照。A,成熟的野生型(Gifu)和bio植株；B, Gifu和bio葉片;C, Gifu和bio花瓣；D,Gifu和bio種子；E,野生型(wt)和ele2花瓣；F,野生型和ele2植株；G,野生型和ele2葉片。圖2 BI0/ELE2比較基因組學定位和共線性分析。A :百脈根bio精細定位和物理圖譜；Β :ΒΙ0在蒺藜苜蓿中對應的共線性區(qū)域；黑框表示在蒺藜苜蓿和百脈根共線性區(qū)域共有的11個同源基因；白框表示共線性區(qū)域沒有同源性的基因；虛線表示對應的關系；c :蒺藜苜蓿中共線性區(qū)域物理圖譜；D :豌豆ele2基 因比較基因組學定位。圖3 ΒΙ0基因的結構和突變位點。BIO基因由4個外顯子和3個內含子組成。紅色和紫色框框分別表示BIO蛋白N端和C端的保守結構域；黑色箭頭表示bio突變體中Gypsy反轉座子插入。圖4、35S =BIOm-GFP在百脈根中的轉基因表型。圖5、35S =BIO-GFP在夏堇中的轉基因表型。
具體實施例方式本發(fā)明人經過長期的研究，首次定位和分離到ー類新的植物基因，其能夠調控植物的株型大小、器官大小以及花器官的內部非対稱性?；谠摶蚧蚱湔{控分子(如干擾分子)，可制備株型、器官大小改變的轉基因植物或花器官內部非対稱性改變的轉基因植物。如本文所用，所述的“植物(或作物)”包括任何種類的植物，只要該植物適合進行基因的轉化操作(轉基因操作)，如各種農作物、花卉植物、或林業(yè)植物等。所述的植物比如可以是雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。例如但不限于豆科的豌豆、大豆、百脈根、花生、蠶豆、菜豆；十字花科蕓薹屬的大白菜、小白菜；十字花科鼠耳芥屬植物；禾本科的水稻、大麥、小麥；此外還包括煙草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更具體地，所述的植物包括(但不限干)豌豆、大豆、百脈根、小麥、大麥、黒麥、水稻、玉米、高梁、甜菜、蘋果、梨、李、桃、杏、櫻桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罌粟、齊墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫蘆、黃瓜、西瓜、棉花、亞麻、大麻、黃麻、柑桔、檸檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、蘆筍、洋白菜、大白菜、小白菜、胡蘿卜、洋蔥、土豆、西紅柿、青椒等。如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的BIO蛋白”或“分離的BIO多肽”是指BIO蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化BIO蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帯。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構
成”、“基本上由......構成”、和“由......構成”；“主要由......構成”、“基本上
由......構成”和“由......構成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選的是重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括BIO蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的BIO蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有ー個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu) 選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另ー個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚こニ醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術語“ΒΙ0蛋白”指具有調節(jié)植物株型、器官大小或花器官內部非対稱性的功能的SEQ ID NO :6序列的多肽。該術語還包括具有調節(jié)植物株型、器官大小或花器官內部非対稱性的、SEQ ID NO :6序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，還更佳如1_8個或1-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失ー個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失ー個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括BIO蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與BIO蛋白的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗BIO蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含BIO蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了 BIO蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有BIO蛋白序列的至少約20個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸,更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸,最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。本發(fā)明還提供BIO蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然BIO蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技木。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如こ?；螋然?。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，“BIO蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO 6的氨基酸序列相比，有至多20個，較佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表I進行氨基酸替換而產生。表I
氨基酸殘基代表性的取代優(yōu)選的取代
Ala(A)Val ；Leu ；IleVal
Arg(R)Lys ；Gln ；AsnLys
Asn(N)Gln ；His ;しys ；ArgGln
Asp (D)GluGlu
Cys(C)SerSer
Gln (Q)AsnAsn
Glu(E)AspAsp
Gly(G)Pro ；AlaAla
His (H)Asn ；Gln ;しys ；ArgArg
He (I)Leu ；Val ；Met ；Ala ；PheLeu
Leu (L)lie ；Val ；Met ；Ala ；Phelie
Lys(K)Arg ；Gln ；AsnArg
Met (M)Leu ；Phe ；IleLeu
Phe(F)Leu ；Val ；Ile ；Ala ；TyrLeu
Pro (P)AlaAla
Ser(S)ThrThr
Thr(T)SerSerTrp (W)Tyr ；PheTyr
Tyr (Y)Trp ；Phe ；Thr ；SerPhe
Val (V)lie ；Leu ；Met ；Phe ；AlaLeu本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明BIO蛋白或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO :1-2任一所示的編碼區(qū)序列相同 或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO :6的蛋白質或其衍生蛋白，但與SEQ ID NO :1-2任一所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。編碼SEQ ID NO 6的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是ー個多核苷酸的替換形式，它可能是ー個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如O. 2 X SSC，O. 1% SDS，60°C;或(2)雜交時加有變性劑，如50% (v/v)甲酰胺，O. 1%小牛血清/O. 1% Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在80%以上，較好至少90%以上，更好是95%以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO :6所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼BIO蛋白的多聚核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析。用BIO蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測BIO蛋白的轉錄產物。本發(fā)明還涉及BIO蛋白的截短體，它們例如選自如SEQ ID NO :6中第1-328位所示氨基酸序列的多肽。它們對于調節(jié)植物株型大??；調節(jié)植物器官大??；或調節(jié)植物花器官(如花瓣)內部非対稱性是有用的。所述的截短體的編碼核酸也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明的BIO蛋白核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短吋。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或BIO蛋白編 碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發(fā)明所述多肽的方法。通過常規(guī)的重組DNA技術，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列來表達或生產重組的BIO蛋白。一般來說有以下步驟(I).用本發(fā)明的編碼BIO蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。本發(fā)明中，BIO蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的ー個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含BIO蛋白編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的ニ氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞等。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另ー種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法、水稻幼胚轉化法等。對于轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得性狀發(fā)生改變的植物。獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結
ム
ロ ο重組的BIO蛋白有多方面的用途。例如用于篩選促進或對抗BIO蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組BIO蛋白篩選多肽庫可用于尋找有價值的能抑制或刺激BIO蛋白功能的多肽分子。本發(fā)明提供了所述的BIO蛋白或其編碼基因的用途，用于調控植物的株型或器官大小或花器官的內部非対稱性。在ー種方式下，正義表達BIO蛋白可用于促進植物株型變小、促進植物花器官變小、調節(jié)植物花器官(如花瓣)的內部非対稱性。在另ー種方式下，反義轉入BIO基因，或轉入BIO基因的干擾分子(包括但不限于siRNA，miRNA，shRNA,反義核苷酸)以及截短的BIO基因后可促進植物株型變大、促進植物花器官變大、調節(jié)植物花器官(如花瓣)的內部非対稱性。因此，可基于BIO蛋白對于植物的上述影響作用來改變植物，從而達到根據實際生產需要改良植物品質的目的。較佳地，所述的植物是豆科植物。本發(fā)明還涉及BIO蛋白或其編碼基因的激動劑或抑制劑(如反義的BIO基因，或siRNA,miRNA, shRNA,反義核苷酸)及其用途。由于BIO的激動劑或抑制劑可調節(jié)BIO的表達和/或調節(jié)BIO的活性等，因此，所述的BIO的激動劑或抑制劑也可通過對BIO的影響來調節(jié)植物的表型(包括株型、器官大小、花器官的內部非対稱性)，從而達到改良植物的目的。任何可調節(jié)BIO蛋白的活性、調節(jié)BIO蛋白的穩(wěn)定性、促進或抑制BIO基因的表達、延長或減少BIO蛋白有效作用時間、或促進或降低BIO基因的轉錄和翻譯的物質均可用于本發(fā)明，作為可用于調節(jié)植物的表型(包括株型、器官大小、花器官內部非対稱性)的有效物質。本發(fā)明還涉及ー種改良植物的方法，該方法包括調節(jié)所述植物中BIO蛋白的表達。一方面，本發(fā)明提供了一種促進植物株型變小、促進植物花器官變小、促進植物器官(如花器官；進ー步如花瓣)的対稱的方法，所述的方法包括使所述植物過量表達BIO蛋白。另ー方面，本發(fā)明還提供了一種促進植物株型變大、促進植物花器官變大、促進植物花器官(如花瓣)的不對稱的方法，所述的方法包括降低所述植物中BIO蛋白的表達(包括使BIO蛋白不表達或低表達)。在得知了所述的BIO蛋白的用途后，可以采用本領域人員熟知的多種方法來調節(jié)所述的BIO蛋白的表達。比如可通過一定的途徑將攜帯BIO編碼基因的表達單位(比如表達載體或病毒等)遞送到靶點上，并使之表達活性的BIO蛋白。此外，也可以采用本領域人員熟知的多種方法來降低BIO蛋白的表達或使之缺失表達，比如將攜帶反義BIO基因的表達單位(比如表達載體或病毒等)遞送到靶點上，使得細胞或植物組織不表達或降低表達BIO蛋白。作為本發(fā)明的一種實施方式，將BIO蛋白的編碼基因通過常規(guī)的方法克隆到適當 的載體中，將所述的帶有外源基因的重組載體導入到可表達所述BIO蛋白的植物細胞中，使所述的植物細胞表達BIO蛋白?？赏ㄟ^將所述植物細胞再生成植物，獲得過量表達BIO蛋白的植物。優(yōu)選的，一種促進植物株型變小、促進植物花器官變小、調節(jié)植物器官(如花瓣)的內部非対稱性的方法包括(I)提供攜帯表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有與表達載體正向連接的BIO的編碼基因；(2)將植物細胞、組織或器官與步驟(I)中的農桿菌接觸，從而使BIO的編碼基因轉入植物細胞；(3)選擇出轉入了 BIO的編碼基因的植物細胞、組織、器官；和(4)將步驟(3)中的植物細胞、組織、器官再生并選出轉基因植物，即為所需的轉基因植物。優(yōu)選的，一種促進植物株型變大、促進植物花器官變大、調節(jié)植物花器官(如花瓣)的內部非対稱性的方法包括(Si)提供攜帯表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有BIO基因的干擾分子(包括但不限于siRNA，miRNA，shRNA,反義核苷酸)，或與表達載體反向連接的BIO的編碼基因，或截短的BIO蛋白的編碼基因；(s2)將植物細胞、組織或器官與步驟(Si)中的農桿菌接觸，從而使所述BIO基因的干擾分子(包括但不限于siRNA，miRNA, shRNA，反義核苷酸)或反向的BIO的編碼基因轉入植物細胞；(s3)選擇出轉入了 BIO基因的干擾分子(包括但不限于siRNA，miRNA, shRNA,反義核苷酸)或反向的BIO的編碼基因或截短的BIO蛋白的編碼基因的植物細胞、組織、器官；和(s4)將步驟(S3)中的植物細胞、組織、器官再生并選出轉基因植物，即為所需的轉基因植物。如本文所用，所述的正向連接是指ΒΙ0的編碼基因與表達載體的連接是正義的連接，即編碼基因按照5’ 一3’的方向連接于載體上。通常，BIO的編碼基因位于表達載體中啟動子的下游，也即啟動子的3’端下游連接該編碼基因的5’端。所述的編碼基因是可操作性地連接到表達載體上的。所述的“操作性連接”或“可操作地連于”指這樣ー種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。如本文所用，所述的反向連接是指ΒΙ0的編碼基因與表達載體的連接是反義的連接，即編碼基因按照3’ 一 5’的方向連接連接于載體上。通常，BIO的編碼基因位于表達載體中啟動子的下游，也即啟動子的3’端下游連接該編碼基因的3’端?？刹捎萌魏芜m當的常規(guī)手段，包括試劑、溫度、壓カ條件等來實施所述的方法。其它增加BIO表達的方法是本領域周知的。例如，可通過用強啟動子驅動從而增強BIO的表達?；蛘咄ㄟ^增強子來增強該BIO基因的表達。適用于本發(fā)明方法的強啟動子包括但不限于35s啟動子、水稻、玉米的Ubi啟動子等。BIO蛋白的編碼基因的另ー個應用作為鑒定植物株型大小、器官大小或花器官內部非対稱性的分子標記?？赏ㄟ^分析待測植物(如植物的種子或幼苗)中BIO蛋白的表達 情況，來判斷其株型大小、器官大小或花器官內部非対稱性。例如，鑒定到植物中BIO蛋白的表達低或無，則該植株的器官可呈現內部對稱性的表型；而若鑒定到BIO蛋白的正常表達或較高表達，則該植株的器官可呈現內部非対稱性的表型。本發(fā)明的主要優(yōu)點在干本發(fā)明人利用豆科比較基因組和功能基因組的技術手段，定位和克隆控制豆科器官大小發(fā)育的基因，并探討基因控制器官大小的分子機制，為大豆高產和花型的分子設計提供理論依據。進而利用轉基因等分子生物學技術獲得花瓣變大，適合馴化蜜蜂傳粉的形態(tài)結構，創(chuàng)造適用于大豆雜交優(yōu)勢利用的育種材料。下面結合具體實施例，進ー步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人,分子克隆實驗室指南(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按
重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。I.材料和方法I.實驗材料I. I.植物材料豌豆(P. sativum)材料野生型豌豆生態(tài)型Terese、JI2822、JI31和JI992 (獲自英國 John Innes centre);突變體 elel_l、elel_2、ele2、Iat (JIlO)(獲自英國 John Innescentre)和MD404及(獲自澳大利亞Tasmania大學)。豌豆種子在水中浸泡24小時后，播種于土中I厘米深處，種植于植物生理生態(tài)研究所人工氣候室，16小時光照/8小時黑暗，15-20°C 生長。百脈根L. japonicus :生態(tài)型 Gifu B-129 (Gifu), Miyakojima 20 (MG20)(獲自日本KAZUSA研究所及突變體bio (獲自上海植物生理生態(tài)研究所)，種植于植物生理生態(tài)研究所人工氣候室，16小時光照/8小時黑暗，18-22°C生長。1.2.植物材料遺傳雜交豌豆突變體遺傳分析(l)elel-l作為父本本與ele2X JWgZF1植株雜交，用于elel-1及ele2等位分析或構建elel_lele2雙突變體。(2) ele2作為父本本與Terese回交，純化背景。elel_l作為父本與JI2822回交，
純化背景。百脈根突變體遺傳分析

bio作為父本與Gifu回交,用于bio遺傳分析和純化背景。bio作為父本與MG20雜交,用于構建bio F2定位群體。1.3.菌株和克隆載體大腸桿菌菌株DH5 a、JM109 (購自 Invitrogen)；農桿菌菌株GV3101(購自 Invitrogen)、ΕΗΑ105 (購自 Invitrogen)；酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株AH109(購自 Clontech)、Y187 (購自Clontechノ ；基因克隆載體pBS_T (購自天根公司)、pGEM-T (購自天根公司);轉基因構建載體pCAMBIA1302 (購自CAMBIA公司);酵母雙雜交載體pGBKT7_53(購自Clontech)、pGBKT7_lam(購自 Clontech)、PGBKT7 (購自 Clontech)和 pGADT7 (購自 Clontech)。1.4.擬南芥幼苗的種植擬南芥Columbia(獲自上海植物生理生態(tài)研究所)種子用70% (v/v)こ醇消毒30sec,7% (v/v)次氯酸鈉浸泡lmin，高壓滅菌水沖洗3_5次，均勻播種于MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)皿用封ロ膜封ロ之后置4°C冰低溫處理48hr使種子萌發(fā)整齊，然后20 22°C、16hr光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)9 13日，待幼苗長出2 4片真葉后移栽于栽培土(蛭石東北泥炭珍珠巖=3 I 0.5)中，于人工氣候室溫度20 22°C、16hr光照中生長。2.實驗方法2. I.重組質粒的構建轉基因質粒首先利用引物SL6160/SL5808 (BIO)，SL6160/SL5818 (BIOm)和 KOD Plus (—種高保真DNA聚合酶，購自Toyobo)擴增百脈根cDNA，PCR產物回收加A連接到pBS_T載體，轉化大腸桿菌鑒定陽性克隆，抽提質粒DNA，經過測序驗證后，Ncol/Bglll (ΒΙ0, B10m)雙酶切質粒，回收酶切產物后與經過Ncol/Bglll雙酶切的pCAMBIA1302連接，轉化大腸桿菌鑒定陽性克隆，抽提質粒DNA備用。這些重組質粒分別稱為BI0-GFP(也稱為35S =BIO-GFP ；ΒΙ0插入 pCAMBIA1302 中)和 BIOm-GFP (也稱為 35S BI0m-GFP ；BI0m 插入 pCAMBIA1302 中)。引物序列如下SL6160 ccatggctATGCCGAGGCCAGGGCCAAGG(SEQ ID NO 3)SL5808 agatctCAAACCTGGCCTACCAATAAAACGA(SEQ ID NO 4)SL5818 agatetGCTGCCCTCCTGAGAAAGTCCTAA(SEQ ID NO :5)2. 2.植物遺傳轉化及篩選
擬南芥遺傳轉化將野生型擬南芥種子消毒后置于MS培養(yǎng)基萌發(fā)，10 15天后移栽到土壌中，一周澆灌一次O. 5XPNS營養(yǎng)液。植株普遍抽薹后打頂，待側花序長出而且花苞最多時，進行遺傳轉化。首先將構建好的質粒(35S =BIO-GFP和35S =BIOm-GFP)用熱激轉化法轉入GV3101農桿菌菌株中，28°C培養(yǎng)2天。挑取單菌落接種到5ml液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入相應抗生素，28°C振蕩培養(yǎng)過夜。I : 100擴大培養(yǎng)，待00600 = 1.0 I. 3吋，5000rpm離心收集菌體。用MS重懸菌體至0D600 = O. 8。重懸的菌液噴至擬南芥植株上，噴到滴水為止。噴完后，用保鮮膜包好放置黑暗處過夜，24hr后去掉保鮮膜。待果莢成熟后收Ttl代種子。夏堇遺傳轉化夏堇種子經過滅菌在1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)并生長為無菌苗。然后將構建好的質粒(35S =BIO-GFP和35S =BIOm-GFP)用熱激轉化法轉入LBA4404農桿菌菌株中，28°C培養(yǎng)2天。挑取單菌落接種到5ml液體LB培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜。待0D600=1.0 1.3時，6000印111離心收集菌體。以葉片為外植體，共培養(yǎng)4天后，移到選擇培養(yǎng)基上生長10 15天，然后將外植體轉到誘芽培養(yǎng)基(Hyg 15mg/L)上繼續(xù)誘導芽的生長；隨后將抗性芽的外植體轉到1/2MS培養(yǎng)基(Hyg 15mg/L)上，以后每隔2周轉I次培養(yǎng)基，當 芽長到Icm以上時將抗性芽切下放入1/2MS培養(yǎng)基(Hyg 15m g/L+Cef 500mg/L)上生根，根長約4cm時移栽。百脈根遺傳轉化提前10天用液氮處理種子I分鐘，70%醇浸泡I分鐘，7% NaClO浸泡15分鐘，無菌水沖洗4次，最后接種到MSO固體培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)6天，光下4天。然后將構建好的質粒(35S :BI0-GFP和35S =BIOm-GFP)用熱激轉化法轉入EHA105農桿菌菌株中，28°C培養(yǎng)2天。挑取單菌落接種到5ml液體LB培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜。待0D600=I. O I. 3時，6000rpm離心收集菌體。同時,于轉化前一天切取無菌苗的子葉和胚作軸為外植體，置于Cim培養(yǎng)基上預培養(yǎng)。用BStl重懸菌體至0D600 = O. 7。用此重懸的菌液浸泡外植體15分鐘，撈出外植體，用濾紙吸干，置于原預培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗中共培養(yǎng)2天后將外植體用無菌水沖洗3次,用濾紙吸干,置于Cim+Cef500mg/L+Hyg250mg/L培養(yǎng)基,篩選抗性愈傷。然后于 Cim+Cef500mg/L+Hyg250mg/L 中培養(yǎng)40-50 天，在 Sim+Cef500mg/L+Hyg250mg/L培養(yǎng)20-25天。直到愈傷在Sim+Cef500mg/L+Hyg25mg/L中分化出O. 5-lcm高的芽時，移入 0utg3+Cef250mg/L+Hyg5mg/L 至芽長 3_4cm。最后在 B5+Hyg25mg/L 生根，約長至 5cm 左右移栽。2. 3. PNS營養(yǎng)液配方成分(各成分単獨配制，使用時依量混合)(I) 1Μ(200Χ)ΚΝ03(101·1 克)5ml(2) 1M(500X)MgSO4 (120. 37 克)2ml(3) IM (500X)Ca (NO3) 2 (400. 148 克)2ml(4) 20m M (400X) EDTA-Fe (7. 44/5. 6 克)2. 5ml(5)微量元素(1000X)Iml(6) (400X)Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04 (136. 1/2 28 . 2 克) 2. 5mlddH20985ml調PH = 5. 5。其中，微量元素(1000X)(mg/L)
H3BO46200mg/L
MnS04.4H2022300mg/L
ZnS04.7H2010600mg/L
Na2MoO4^H2O250mg/L
CuS04.5H2025mg/L CoC12.6H2025mg/L2. 4.數據分析平臺與軟件序列BLAST分析NCBI在線分析平臺。序列Alignment 分析BioEdit 7. O. 5 軟件。序列預測與分析GenScan平臺，Softberry FGENESH 平臺，Vector NTI 8.0。引物設計PrimerPremier 5. O 軟件。2.5.百脈根和豌豆總RNA提取收集目標材料，液氮中研磨破碎(之后所有操作在冰上或4°C進行)。約將破碎的細胞移入 I. 5ml 離心管，加入 500μ I RNA 提取液(50mM Tris, 150m MliCl,5mM EDTA和5% SDS)的，迅速混勻，再加入500 μ I的等體積(酸性)酚/氯仿，抽提5至10分鐘，離心13，OOOgX5分鐘，取上清重復抽提數次。取上清，加入等體積的氯仿抽提一次，離心13，OOOgX 5分鐘。取上清，加入1/3體積8Μ LiCl，4°C沉淀過夜。次日離心13，OOOgX 10分鐘，棄上清，加入75% (v/v)こ醇/30% O. 5MNaCl O. 5毫升洗滌沉淀數分鐘，離心，重復洗滌沉淀數次。用75%こ醇再洗滌2次沉淀，用槍頭吸盡殘液，真空干燥2分鐘。加入20-50 μ I的DEPC處理過的水溶解RNA。用分光光度法和電泳檢測RNA完整性及濃度。馬上進行RNA反轉錄或分裝放_80°C保存?zhèn)溆谩?. 6.反轉錄 PCR(RT-PCR)取約10 μ g RNA,加DEPC水補至11 μ 1，65°C變性5分鐘，冰浴5分鐘。然后依次加入 4μ1 5 X 反轉錄緩沖液、I μ I Rnasin (40U/μ 1),2 μ I dNTP (每種 IOmM)、I μ I 引物Olig(T)17(IOOyM)和Ιμ AMV反轉錄酶(10U/μ I)，反應終體積為20 μ I?；靹?，42 °C反應I小時，70°C 5分鐘終止反應，-20°C保存。PCR反應時取O. I μ 1、1 μ I和5 μ I為模板。通過電泳檢測PCR結果。2. 7. 3，-RACE(Rapid Amplification of cDNA 3，Ends)取約5yg RNA，加DEPC水補至11μ 1，65°C變性5分鐘，冰浴5分鐘。然后依次加入 4μ1 5 X 反轉錄緩沖液、I μ I Rnasin (40U/μ 1),2 μ I dNTP (每種 IOmM)、I μ I 引物Β26 (GACTCGAGTCGACATCGA (T) 17 (SEQ ID NO :7)) (100 μ Μ)和 I μ I AMV 反轉錄酶(10U/μ I)，反應終體積為20 μ I?；靹?，42°C反應I小時，700C 5分鐘終止反應，_20°C保存。PCR反應時取0. 1μ 1、1μ I和5μ I為模板，以特異引物(AAGAAACGGCTTTAGGCACTC(SEQ ID NO 8)和 CAGGAGTCACAGGGCAGGGAA(SEQ ID NO :9))和B25 (TCGATGTCGACTCGAGTC (SEQ ID NO : 10))進行兩輪巢式PCR。電泳檢測PCR結果，回收產物連接轉化大腸桿菌GM109鑒定陽性克隆測序。
2.8.5’ -RACE(Rapid Amplification of cDNA 5’ Ends)5’ -RACE 采用 Takala 公司 5’ -Full RACE kit。第一鏈cDNA的合成取約5yg RNA，加入 1·5μ1 IOX 反轉錄緩沖液、O. 5 μ I Rnasin (40U/μ I)、2 μ IdNTP (每種 IOmM)、1 μ I 引物 5，end-phosphorylatedRT-Primer* (GCTCCCTTTCTCCCTGTATTG(SEQ ID NO :11)) (200pmol/y I)和1μ I AMV反轉錄酶(5U/μ I)，反應終體積為 15 μ I?；靹?，30°C反應10分鐘，50°C反應60分鐘，80°C 2分鐘終止反應，_20°C保存。RNA的酶解第一鏈cDNA合成產物15 μ 1，依次加入15 μ I 5x RNA降解緩沖液，45 μ IddH2O,I μ I RNase H 30°C反應60分鐘，加入2倍無水こ醇沉淀cDNA。 單鏈cDNA的自我連接在沉淀cDNA管中，加入8μ I 5Χ RNA(ssDNA)連接緩沖液，20 μ I 40 %PEG#60001 μ I T4RNA 連接酶，15°C過夜連接。PCR 反應第一輪PCR反應體系連接產物Ιμ IOx LA PCR Buffer II (Mg2+plus)5 μ IdNTP Mixture (2. 5mM)8 μ I1st PCR SI Primer(20pmol/y I)0. 5 μ I (GAGGTTGAGGGTGGTGGTGA(SEQ ID NO :12))1st PCR Al Primer(20pmol/μ I)0. 5 μ I (CACCGGATAAGGCACAGTCA(SEQ ID NO :13))TaKaRa LA Taq (5units/μ I) 0. 5 μ IddH20 補充至50 μ IPCR 反應94で 3min, 94°C，30sec, 55°C，30sec, 72°C，30sec 35 個循環(huán)，最后 72で延イ申5min第二輪PCR反應體系第一輪PCR 產物I μ IIOx LA PCR Buffer II(Mg2+plus)5 μ IdNTP Mixture (2. 5mM)8 μ I1st PCR S2 Primer(20pmol/μ I)0. 5 μ I (TGGCGGTGTATGGCGGAGGA(SEQ ID NO :14))1st PCR A2 Primer(20pmol/μ I)0. 5 μ I(GCAGTTTGGGCTTCTTCTTG(SEQ ID NO :15))TaKaRa LA Taq (5units/μ I)0. 5 μ IddH20 補充至50 μ IPCR 反應94°C 3min，94°C，30sec，55°C，30sec，72°C，30sec 35 個循環(huán)，最后 72°C延イ申5min。電泳檢測PCR結果，回收產物連接轉化大腸桿菌JM109，鑒定陽性克隆測序。
II.實施例實施例I. bio和ele2突變體的分離和表型分析本發(fā)明人以百脈根生態(tài)型Gifu B-129為材料進行大規(guī)模EMS(甲基磺酸こ酷)誘變，在50000個M2家系中，篩選到一個側生器官變大的突變體bio ;突變體花瓣的內部非対稱性同時發(fā)生變化，所有的花瓣都呈現兩側對稱，腹部的單個花瓣可形成龍骨結構，而在野生型中兩個腹部花瓣融合形成龍骨結構，突變體與野生型植株及器官的形態(tài)對比見圖1A-D。本發(fā)明人還在豌豆Terese背景下進行大規(guī)?？熘凶诱T變篩選，一共3500fM2家系，種植于上海青浦農場大棚，在豌豆中也篩選到ー類與bio表型相似的突變體PDL023(ele2)，該突變體與野生型植株及器官的對比見圖1E-G。實施例2. ele2和bio突變體遺傳分析為了檢測bio和ele2是否為單基因突變所致，bio和ele2分別與其親本Gifu及Terese回交，分析回交F2群體中野生型與突變體分離比。在百脈根中，bio與Gifu回交后 F1植株表型正常，■F1植株花與野生型相比，側部花瓣內部非対稱性發(fā)生改變，變得較為對稱。在140株F2分離群體中，34株個體呈現突變體表型，65株個體出現類似F1植株表型，41株個體呈現野生型表型，群體中各種表型分離比符合I : 2 l(x2 = 1.57 < X2atl5 =5. 99)。以上實驗結果表明bio受單位點半顯性基因控制。在ele2與Terese回交F2群體中，其中野生型105株，突變體32株，野生型與突變體分離比符合3 1(χ2 = 0. 197 < X2atl5=3. 84)。以上結果說明突變體ele2也為單基因隱性突變所致。實施例3. BIO的比較基因組定位和克隆3. I. BIO的比較基因組學定位和克隆為了分離克隆ELE2和BIO基因，本發(fā)明人利用比較基因組學進行定位克隆基因。bio突變體與百脈根生態(tài)型MG-20雜交，F1植株大量繁殖種子構建F2定位群體。bio突變體為半顯性突變體，因此定位群體中的每個單株都可以在當代通過觀察花瓣的表型來鑒定其基因型。為了確定與bio連鎖的染色體位點，本發(fā)明人通過百脈根公共數據庫查詢，從百脈根中選取了約36個SSR分子標記進行初定位，其中相鄰分子標記的遺傳距離在IOcM左右，所用bio初定位群體為F2定位群體中呈現bio突變體表型的100個植株。實驗中采集相應單株的葉片，微量制備基因組DNA作為模板。利用集團分離分析法(bulked segregationanalysis, BSA)，通過百脈根SSR分子標記的初步篩選，本發(fā)明人發(fā)現bio位于百脈根4號染色體長臂上的兩個分子標記TM1874與TM0030之間5cM的區(qū)間。然后利用含有F2大群體對bio基因進行精細定位(3025株)，將bio定位到百脈根TM0234與TM2397之間。之后，本發(fā)明人得到BIO定位區(qū)段的完整重疊群CM0234，由TM0234、BM2378、BM2381、TM2397及TM1095克隆組成，涵蓋區(qū)間約450Kb。本發(fā)明人將ele2突變體與JI992雜交，構建F2定位群體。以覆蓋豌豆七個連鎖群的SSR標記，以親本TereSe、JI992、雜交后代F1基因組DNA以及從ele2定位群體中隨機挑選的15個突變體DNA混合池為模板進行PCR擴增，尋找與ele2連鎖的分子標記。連鎖分析表明ele2基因與SSR標記AA430942連鎖，位于豌豆4號連鎖群上，進ー步研究發(fā)現，dCAPs標記SPS與ele2連鎖，在165個突變體單株構成的ele2定位群體中SPS與ele2有9個交換單株。表2、用于bio和ele2定位分子標記
標記型_正向引物反向引物
PiGH dCAPS (Taq I } ACA AGAGGATGGAGGGTAAGA CiXOAGACACGGATTCOTGGAATTG
CTATTCG
I \ψιι H > I M11 f I \ ·\ ·\ τj-i \ Tfi ΛΤΓ4·<ITi^TTTT CU^ -χ τr TΤΓΙΤ-'rTΓ1 -SΓ' \Tif"1 4 Γ' 'ΤΤΓχ ^TCI 5.-1^ Vi Π v.,.-\r ο \ 4-\111 I rΛΛ·Τ·~\Λ,τ_·\ I iA_T i 1Λ_Τ、Τ \ J I I I I ·~^Λ_Γ^·I ν,ΤI I Ι,τ 1 i. .Λ.··.Κ., I I U.-i 11.
PiSTKC CAPS (Pst I } TTTCTTCTTTCTTCTC'CCTTCfCT CAOOACaOAOATCAATGCMCAALjANTH tlCAPS (Nck I ) (MCOCTTaGAAGGATOTGGACTTOTCTTTAATTTCAAAACCATAT
ΤΜ239' SS RCA CAATG AATACAT GA CtCCA C'C GCXXTCCAAACTGCAAAA利用百脈根BIO定位區(qū)域的序列，搜索蒺藜苜蓿的基因組數據庫(www.medicago.org)，本發(fā)明人發(fā)現BIO區(qū)間與蒺藜苜蓿第8號染色體的一個區(qū)段存在共線性，而且該區(qū)段在染色體上與Mtsps基因的物理距離很近。以上結果表明，ele2可能是bio同源基因。為了證實這點和便于發(fā)展新的分子標記來精細定位ele2基因，對百脈根BIO區(qū)段及苜蓿對應區(qū)段的BAC序列進行基因預測和通過BLAST做基因功能注釋，結合蒺藜苜蓿IMAGE分析的結果，本發(fā)明人發(fā)現百脈根重疊群CM0234與蒺藜苜蓿的AC161031和AC152423有著非常好的微線性，在百脈根和蒺藜苜蓿基因組BIO對應的區(qū)段中有11個同源的基因，百脈根的基因與蒺藜苜蓿的基因核苷酸序列和蛋白序列相似性都非常高，而且基因排布順序也一致。在共線性分析的基礎上，本發(fā)明人利用這兩個模式系統中的序列信息來發(fā)展豌豆的SNP(CAPS/dCAPS)標記，用于精細定位ele2基因。選擇在百脈根BIO定位區(qū)段和在蒺藜苜蓿對應區(qū)段的同源基因而且在擬南芥基因組中拷貝數比較低的基因來發(fā)展標記。對百脈根和蒺藜苜蓿序列進行比對，在保守區(qū)段以蒺藜苜蓿的序列為基礎設計引物，以豌豆兩個親本Terese和JI992基因組DNA為模板進行同源克隆。通過實驗，本發(fā)明人克隆了 3個同源基因的部分片段PsGH、PsANTH, PsSTK0測序結果表明，豌豆的這三個基因在ele2定位群體的兩個親本Terese和JI992之間有單核苷酸多態(tài)性。用dCAPS Finder 2. O軟件將這三個基因發(fā)展成dCAPS分子標記(圖2，表2)，在ele2定位群體中鑒定這些分子標記與ele2的連鎖關系。結果發(fā)現，在ele2定位群體中，PsGH和PsSTK分別有2個和3個交換單株，而PsANTH與ele2基因共分離，從而將ele2定位在PsGH和PsSTK兩個分子標記之間。同時，本發(fā)明人也將百脈根LjANTH基因發(fā)展成dCAPS標記(表2)，在bio定位群體中檢測與bio的連鎖關系，結果表明LjANTH與bio基因共分離(圖2)。以上結果說明豌豆ELE2與百脈根BIO位點存在共線性，ele2與bio應該是同源基因突變所致。通過比較基因組學定位，本發(fā)明人發(fā)現ELE2與BIO位點具有很好的微線性，并將bio/ele2定位到CM0234 contig及對應的苜猜的兩個BAC上。通過序列比較分析,該區(qū)段在百脈根與苜蓿一共有11個基因同源。本發(fā)明人首先利用百脈根bio突變體和野生型DNA對這11個候選基因進行檢測。一系列引物擴增發(fā)現，其中ー個基因在bio突變體中PCR產物片段變大野生型Gifu擴增I. 2kb，而bio突變體中PCR產物片段大于5kb。以該基因序列設計一系列引物進行PCR擴增，結果表明該基因的第4個外顯子上有片段插入(Gypsy反轉座子插入在BIO基因基因組序列的1346位后和編碼序列的983位后)。同時其他10個基因的ORF測序沒有發(fā)現任何變化。利用3’ -RACE來分離bio突變體和野生型該基因轉錄本的3’末端。測序結果比對發(fā)現，在bio突變體的轉錄本中插入200bp的外源序列，導致BIO蛋白翻譯提前終止。用200bp BLAST百脈根基因組數據庫，結果發(fā)現這段外源序列來源于Gypsy反轉座子的一段序列。本發(fā)明人首先在豌豆中克隆BIO同源基因PsBIO，進而檢測在豌豆ele2突變體中PsBIO 是否突變。首先用引物 SL5474/SL5475 (序列分別是 ATGCCGCGGCCAGGGCCAAGGCC (SEQID NO :16)和 CCTAGATGCCGGCAAAATTG(SEQ ID NO : 17))克隆得到 BIO 同源性高的部分片段，然后用 SL5545、SL5546 和 B25 (序列分別是 AAGAAACGGCTTTAGGCACTC (SEQ IDNO 18)、CAGGAGTCACAGGGCAGGGAA(SEQ ID NO :19)和TCGATGTCGACTCGAGTC(SEQ ID NO :20))引物通過3’ -RACE得到豌豆中PsBIO基因的全長編碼序列。當在豌豆突變體ele2中擴增PsBIO時，沒有預期產物，而百脈根中bio旁鄰基因在豌豆的同源基因都能在ele2突變體中擴增出來，因此認為快中子誘變導致豌豆ele2突變體中PsBIO缺失。結合豌豆和百脈根的實驗結果，本發(fā)明人認為百脈根bio和豌豆ele2突變體是同源基因突變導致在百脈根bio突變體中Gypsy反轉座子插入(Gypsy反轉座子插入在BIO基因基因組序列的1346位后和編碼序列的983位后)導致蛋白翻譯提前終止，而在豌豆ele2突變體中快中誘變導致該基因缺失。

經分析BIO cDNA序列和基因組序列，本發(fā)明人發(fā)現BIO基因是由4個外顯子組成，編碼ー個與動物轉錄因子輔助因子非常同源的蛋白(圖3)。它的基因組序列(gDNA)如下LjBIO gDNA (加黑字體為外顯子，帶下劃線字體的為內含子，Li表示百脈根):
ATGCCGAGGCCAGGGCCAAGGCCTTACGAGTGTGTCAGAAGGGCTTGGCACAGCGAGCGCCACCAACCCATTA
GAGGAACCATCATTCAACAGATTTTCAG GTTCTGGGTTCATCTTGGTTTTTTCAGTTTCCCCTCTTTTTTCTTAG
CATGCCCATTTTGTTGACTTTGATTGTTGCACACCACCTGTTTGATTAG GGTCGTCAATGACGCGCACAGT
CCTGCTACTAAGAAGAACAAGGAATGGCAAGAGAAGCTTCCTTTTGTTGTTCTCAAAGCTGAAGAAATCATGT
ACTCCAAGGCAAATTCTGAG GTTTTTTACACCTAATGCTTGTGGAATTTTAGATCTTTCACTGTGTTGCATGAACC
CTTTTTGCCTAATTTTTGTGTGGTTTTGTTTGTTGGTTAG GCAGAGTACTTGAATCCTGATACGCTCTGG
GACCGCCTTAATGATGCTGTTAACACAATCATTCGGAGAGATGAGGCTACTGAGACAGGAGACCTCTTGCCCC
CATGTGTTGAAG GTACTCAATTTTTCATCTTTTATGGATCCACTACTTATAGTTTGTGTCAAAATGCTATTTTGTT
GTGTCATTTGGGATATAGAGAGTATGTATTGTAGAGTGAAAAGTTTAGTAATTTTAGCTGCCAGTGATGTGTTTTTC
ATTTTTGGTTTTCTGGGTATGTTTGATCAG CTGCACTCA ΑΓΓΤΓτΓτΟΑTGCA A AΓΓΑΓτΤΓτΑΓτΑΑΓΤΤ
CGAGAAGTGATCGGCACAATAACCCCAGAACATACCTTTCTCCAAGTACTCAACAACCTCCTCCTGGGTCTCC
TAGACCTGCTGGGGGGAATCCCTTAAACTATGCAAGAGTGACAACTTCTGCACTTGCATCTGTTCCTGTGTCA
AATTCTACCCACCAAAGTAGTAAGGTGATGGGTAACCGTAGCTATCCCTTTTCAGACAATTTCCCTTCTGGTC
ATCACCAGCCATTGGCAATGGAAGCTAAACCCTCATTGAACTTGGGTTCAGTTTATCCCTTGTACTATGTTTA
TGATGCCAGAGAGCCTCAACCAAGGTCGACCGCCCTAGATAACCCTTGTTCTGACACCATCTTTGTTGGCAGA
CCAGTCATTACTCCAGCCCCAGAGACATCTGGAATTGGTCTTTTGGAACACACATCCTATGGTAGGTTTCATC
ATGCTCCAAACAGAATTGCTAAGGAAACTGCTGTAGGCACTACTCAGGAGGAGTCACAAGATGGGGAATGTGA
TTTATCTTTGAGGTTGGGTCAGTGTTTGCATCCTTGTTCCAGCAGCAAAAGTGGTTCAGCATATGGAATTGAT
GATGTTAGTTTAGGACTTTCTCAGGAGGGCAGCAAGTTCAGTCATCTATCTTTGCAGAAAAATCAGGAGTTTT
GTTTTCACCCTAGAGAAGCAGGTTATGGGACCATTGACCCCAATTCCAGATATAATGTAGAGGGTGGAGATCA
GAACTTGGAGGCAACTTTCCGGAAGCGCAAAGCACCTTTAGGTAACAATGAGGAGGATGGGCAATTTTGCCGG
CATCTAGGAGTCCCATCCAATCGTTTTATTGGTAGGCCAGGTTTGTAG (SEQ ID NO :2)實施例4、不同的植物種屬中BIO基因功能驗證
擬南芥、夏堇和百脈根三個模式植物中分別進行了 BIO(野生型基因)(SEQID NO 6)和BI0m(突變基因)(SEQ ID NO 6的1-328AA)的轉基因工作，希望證明BIO基因在不同的植物種屬中都能行使調控器官大小的功能。I、在擬南芥中的轉基因結果35S =BIO-GFP質粒(載體為pCAMBIA 1302)進行擬南芥轉基因，一共得到15個株系，在其中4個株系的Ttl代植株中可以觀察到器官顯著變小的表型(轉基因植株葉片面積變小，約為野生型葉片面積的60% ;果莢變短，長度僅為野生型的45%，種子數目也相應地發(fā)生顯著減少)。2、在百脈根中的轉基因結果35S :BI0m-GFP質粒(載體為pCAMBIA 1302)轉基因目前已得到17個轉基因株系，已有5個株系開花，其中有I個株系的花有明顯不同于野生型的表型，側部花瓣變對稱；腹部花瓣的內部的非対稱性也有可見的變化，與百脈根中的ΒΙΟ/bio雜合子表型相似，如圖 4。3、在夏堇中的轉基因結果35S =BIO-GFP轉基因共得到50個轉基因株系，其中6個株系的花器官與野生型比較均發(fā)生顯著變小，如圖5。小結與討論I. ele和bio突變體的分離和遺傳分析本發(fā)明人通過在篩選豌豆中快中子誘變群體和百脈根中EMS誘變群體，得到ー類側生器官變大和影響花瓣內部非対稱性的突變體。遺傳分析表明在豌豆中ele2分別由單位點隱性基因控制，而百脈根bio為半顯性單基因調控。2.比較基因組學克隆BI0/ELE2基因初歩定位發(fā)現，ele2位于豌豆第4號連鎖群，bio定位到百脈根4號染色體。通過比較基因組學定位，ele2與bio被定位到豆科基因組的的ー個微共線性區(qū)域。通過序列比較分析，該區(qū)段在百脈根與苜蓿一共有11個基因同源。在突變體中對這些候選基因的序列分析和基因結構分析表明百脈根bio和豌豆ele2突變體是同源基因突變導致，在百脈根bio突變體中Gypsy反轉座子插入導致蛋白翻譯提前終止,而在豌豆ele2突變體中快中子誘變導致該基因缺失。本發(fā)明人共獲得了 3株等位的ele2突變體。本領域通常認為，多個等位突變都是同一基因突變造成的話，就可以認定此基因具有相應的功能。3. BIO基因在側生器官大小發(fā)育中的作用百脈根bio和豌豆ele2突變體突變后不僅植株變高大，葉片、花和種子等側生器官都變大。雖然BIO控制器官大小的分子機制暫時不還清楚，但從蒺藜苜蓿中bio相似突變體的芯片分析的數據來推測，它們是通過影響生長素和細胞分裂素等植物激素的信號轉導，進而調控器官大小發(fā)育的。利用BIO基因在豆科側生器官大小發(fā)育中的重要作用，利用轉基因技術，可以通過分子設計來改變大豆的花型，從而創(chuàng)造出花器官變大，有利于蜜蜂傳粉的、適合大豆雜種優(yōu)勢利用的育種材料。由于擬南芥、夏堇和百脈根分屬不同的科，在BIO或BIOm轉基因植株中得到器官大小或形狀發(fā)生變化的表型，有力地證明BIO在調控器官大小的分子途徑中具有保守的功倉^:。在夏堇中得到的BIO轉基因花明顯小于野生型的花，與預期相吻合BIO可以負調細胞的増殖，從而調控器官的大小。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每ー篇文獻被単獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種分離的多肽，該多肽選自下組 (a)SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的多肽；或 (b)將SEQID NO 6所示氨基酸序列經過ー個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)的多肽相同功能的由(a)衍生的多肽。
2.一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組 (a)編碼如權利要求I所述多肽的多核苷酸；或 (b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
3.如權利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO :1 或 2。
4.權利要求I所述的多肽的截短體，該截短體是 如SEQ ID NO 6中第1-328位所示氨基酸序列的多肽。
5.一種分離的多核苷酸，它編碼權利要求4所述的多肽截短體。
6.—種載體,其特征在于,它含有權利要求2-3、5中任一項所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體，或其基因組中整合有權利要求2-3、5任一所述的多核苷酸。
8.權利要求I所述的多肽或權利要求4所述的多肽截短體、或編碼所述多肽或多肽截短體的多核苷酸的用途，用干 調節(jié)植物株型大?。? 調節(jié)植物器官大??；或 調節(jié)植物花器官的內部非対稱性。
9.如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的器官包括葉片，花器官，種子。
10.如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的多肽或編碼所述多肽的多核苷酸用于 促進植物株型變??；或 促進植物器官變小。
11.如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的多肽截短體或編碼所述多肽截短體的多核苷酸用于 促進植物器官的內部対稱性。
12.—種權利要求I所述的多肽或其編碼基因的調節(jié)劑，其是激動劑或抑制劑； 較佳地，所述的調節(jié)劑是抑制劑，其是特異性干擾權利要求I所述的多肽的編碼基因表達的干擾分子；或是特異性抑制權利要求I所述的多肽表達的抗體或配體。
13.—種調節(jié)植物大小、調節(jié)植物器官大小或調節(jié)植物花器官內部非対稱性的方法，其包括調節(jié)植物中權利要求I所述的多肽或其編碼基因的表達或活性。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法包括 將權利要求2-3、5中任一項所述的多核苷酸轉入植物中；或將干擾權利要求I所述的多肽的編碼基因表達的干擾分子轉入植物中；或 在植物基因組中，將權利要求I所述的多肽的編碼基因進行突變，從而降低植物中權利要求I所述的多肽的表達。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法包括(1)提供攜帯表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有權利要求2-3任一所述的多核苷酸、權利要求5所述的多核苷酸或干擾權利要求I所述的多肽的編碼基因表達的干擾分子; (2)將植物細胞或組織或器官與步驟(I)中的農桿菌接觸，從而使權利要求2-3或5任一所述的多核苷酸或干擾權利要求I所述的多肽的編碼基因表達的干擾分子轉入植物細胞或組織或器官。
16.—種制備植物的方法,其特征在于,將轉入了權利要求2-3任一所述的多核苷酸、權利要求5所述的多核苷酸或干擾權利要求I所述的多肽的編碼基因表達的干擾分子的植物與非轉基因植物雜交，獲得雜交后代，該后代在植物株型大小、植物器官大小、植物花器官內部非対稱性方面呈現與非轉基因植物不同的表型。
17.—種權利要求I所述的多肽或其截短體的制備方法，其特征在于，該方法包含 (a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)權利要求7所述的宿主細胞； (b)從培養(yǎng)物中分離出權利要求I所述的多肽或其截短體。
18.—種權利要求I所述的多肽或其編碼基因的用途，用作鑒定植物的株型或器官大小，以及鑒定植物花器官內部非対稱性的分子標記物。
全文摘要
本發(fā)明涉及調節(jié)植物器官大小和花器官內部非對稱性的方法。本發(fā)明人首次定位和分離到一種新的植物基因，基于該基因或其調控分子可制備株型、器官大小改變的轉基因植物或花器官內部對稱性改變的轉基因植物。
文檔編號G01N33/68GK102675437SQ20121001991
公開日2012年9月19日 申請日期2012年1月21日 優(yōu)先權日2011年1月26日
發(fā)明者李信, 楊軍, 羅達 申請人:中國科學院上海生命科學研究院, 中山大學