一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白AsSnRK及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白 AsSnRK及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥作為我國(guó)重要的糧食作物之一，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有非常重要的地位。然而，每 年因干旱、鹽堿等逆境脅迫條件對(duì)我國(guó)小麥造成的減產(chǎn)約800億公斤，嚴(yán)重影響著小麥的 產(chǎn)量和品質(zhì)，制約著我國(guó)小麥糧食安全。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)從 分子水平上深入研究植物與非生物逆境之間的關(guān)系，揭示植物對(duì)逆境脅迫信號(hào)傳導(dǎo)及基因 表達(dá)調(diào)控分子機(jī)理，為培育作物抗逆新種質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)。
[0003] 近年來(lái)，通過(guò)蛋白激酶的結(jié)構(gòu)與功能分析來(lái)鑒定、闡明各種條件下基因表達(dá)調(diào)控 的機(jī)理得到了廣泛關(guān)注。蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶家族（SnRKs)在植物的許多生理過(guò)程中 起著重要的作用，例如激素信號(hào)傳導(dǎo)、非生物脅迫和植物的生長(zhǎng)發(fā)育等 [45 48]。SnRK蛋白激 酶屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶超級(jí)家族，由于基因序列的相似性和基因結(jié)構(gòu)的不同，被 分為三個(gè)亞家族分別是：SnRKl，SnRK2和SnRK3。SnRK蛋白激酶三個(gè)亞家族都有相似的結(jié) 構(gòu)特點(diǎn)，N-端都有一段能與其他蛋白相互作用的激酶結(jié)構(gòu)域，并且結(jié)構(gòu)在三個(gè)家族中是高 度變化的。
[0004] 第一個(gè)SnRK2成員是從ΑΒΑ處理的小麥胚胎cDNA文庫(kù)中分離得到的PKABA1， PKABA1的表達(dá)除受ΑΒΑ和干旱脅迫所誘導(dǎo)。SnRK2家族基因在功能上表現(xiàn)出一定的差異性， 擬南芥中SnRK家族成員中有9個(gè)基因被高滲脅迫（甘露醇或NaCl)誘導(dǎo)，5個(gè)基因被ΑΒΑ 誘導(dǎo)，但均不受冷脅迫誘導(dǎo)。擬南芥SnRK2. 6基因通過(guò)參與調(diào)控主要的新陳代謝過(guò)程和ΑΒΑ 途徑來(lái)控制氣孔的開(kāi)度。水稻中SnRK基因，通過(guò)蛋白磷酸化分析表明所有成員都能被高滲 脅迫激活，但是只有0sSAPK8、0sSAPK9和OsSAPKIO這三個(gè)基因受ΑΒΑ誘導(dǎo)表達(dá)。小麥中 得SnRK2家族基因在功能上也有一定不同，在擬南芥中過(guò)表達(dá)TaSnRK2. 4基因可以明顯增 強(qiáng)植物的抗逆性；TaSnRK2. 7基因功能分析顯示，在糖代謝、降低滲透勢(shì)、增強(qiáng)光系統(tǒng)II的 活性以及促進(jìn)植物生根等生理生化過(guò)程中起著重要作用；過(guò)表達(dá)TaSnRK2. 8基因的擬南芥 對(duì)干旱、低溫、高鹽等脅迫均有一定耐性。因此，利用抗旱、耐鹽的燕麥克隆、分離抗逆相關(guān) SnRK蛋白激酶基因改良和提高作物的抗逆性，對(duì)抗逆育種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)會(huì)產(chǎn)生巨大推動(dòng)作用 和經(jīng)濟(jì)效益，具有非常重要應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白AsSnRK。
[0006] 本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋AsSnRK的基因。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組細(xì)胞。
[0009] 本發(fā)明的另一目的提供上述植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白AsSnRK的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明所提供的抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白AsSnRK，來(lái)源于燕麥，其氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。
[0011] 本發(fā)明的蛋白激酶由360個(gè)氨基酸殘基組成，是SnRK類(lèi)蛋白激酶。自SEQIDNO. 1 的氨基末端第25-40位氨基酸殘基是ATP結(jié)合域，自SEQIDNO. 1的第128-142位氨基酸 殘基為絲氨酸/蘇氨酸結(jié)合域。
[0012] SEQIDNO. 1
[0013]
[0014] 為了使蛋白AsSnRK便于純化，可在由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白 質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0015] 表1標(biāo)簽的序列
[0016]
[0017] 根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的SEQIDNO. 1序列，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子AsSnRK可人工合成， 也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的AsSnRK編碼基因具有如SEQ ID N0. 2所示cDNA序列。
[0019]SEQIDNO. 2
[0022] 含有AsSnRK基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0023] 可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有AsSnRK基因的重組表達(dá)載體。
[0024] 所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植 物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與 mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的 3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)（Ti)質(zhì)粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因3'端轉(zhuǎn)錄 的非翻譯區(qū)均具有類(lèi)似功能。
[0025] 使用AsSnRK構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種 增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒（CaMV)35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子 (Ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu) 建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以 是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整 個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可 以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
[0026] 為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、 螢光素酶基因等）、具有抗性的抗生素標(biāo)記物（慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等）或是 抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因（如抗除莠劑基因）等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選 擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0027] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育耐逆植物的方法。
[0028] 本發(fā)明所提供的培育耐逆植物的方法，是將上述任一種含有AsSnRK基因的重組 表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中，得到耐逆植物。
[0029] 利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的SnRK 蛋白激酶AsSnRK基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對(duì)干旱和鹽等非生物逆境脅迫耐受力增強(qiáng)的 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶有編碼基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植 物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞 或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以 是雙子葉植物，如：擬南芥、小麥、燕麥、擬南芥、水稻、玉米、黃瓜、番茄、楊樹(shù)、草坪草、苜宿 等。
[0030] 本發(fā)明以抗旱、耐鹽性較強(qiáng)的燕麥（AvenasativaL.)為實(shí)驗(yàn)材料，得到了抗逆相 關(guān)的AsSnRK蛋白及其編碼基因，并將其導(dǎo)入擬南芥，顯著提高了植物的抗旱、耐鹽性。本發(fā) 明的抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)Ω牧?、增?qiáng)擬南芥抗逆性，提高產(chǎn)量、加速抗逆分 子育種進(jìn)程，以及有效節(jié)省水資源具有十分重要的理論和實(shí)際意義。
[0031] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1為T(mén)1代AsSnRK轉(zhuǎn)基因煙草株系的鑒定。M:marker;1 :陰性對(duì)照；2 :水對(duì)照； 3~11 :不同轉(zhuǎn)基因煙草株系。
[0033] 圖2為轉(zhuǎn)基因煙草耐旱性鑒定。CK是野生型煙草，L1、L2、L3是3個(gè)獨(dú)立的AsSnRK轉(zhuǎn)基因煙草株系。
[0034] 圖3轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性鑒定。CK是野生型煙草，Ll、L2、L3是3個(gè)獨(dú)立的AsSnRK 轉(zhuǎn)基因煙草株系。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》 (第三版）J.薩姆布魯克一書(shū)中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0036] 以下的實(shí)施例便于更好