L-肉堿脫氫酶的提純方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種L-肉堿脫氫酶的提取與純化方法，包括制備L-肉堿脫氫酶粗酶液，硫酸銨分級(jí)鹽析和DEAE-cellulose離子交換層析步驟。經(jīng)過本發(fā)明處理后，L-肉堿脫氫酶被初步提純，純化倍數(shù)達(dá)到104.7倍，酶活7.49U/ml，比活達(dá)到2.848U/mg。
【專利說明】L-肉堿脫氫酶的提純方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生化領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及L-肉堿脫氫酶的提取與純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]L-肉堿(L-carnitine),別名L-肉毒堿、維生素Bt、左卡尼汀等，化學(xué)名為L- β -羥基-Y -三甲胺丁酸，是人體內(nèi)必需的一種類維生素化合物。自從1973年Engel報(bào)告第一例人類CN缺乏癥(CD)以來，有關(guān)L-肉堿的生理生化，⑶的病理和臨床報(bào)告日漸增多，成為臨床醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)的一個(gè)重要課題。L-肉堿作為藥物治療由CD引起的各種疾病取得了很好的效果，其生產(chǎn)方法的改進(jìn)和創(chuàng)新對(duì)于L-肉堿的大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。目前生產(chǎn)L-肉堿的方法中，酶轉(zhuǎn)化法具有環(huán)境友好、成本低、產(chǎn)品安全性高等特點(diǎn)，是較有吸引力的方法。
[0003]在酶轉(zhuǎn)化法中，L-肉堿脫氫酶(EC1.1.1.108)是所需要的一個(gè)重要的酶，因此它的性質(zhì)對(duì)該方法的使用和推廣非常重要。雖然已有少量文獻(xiàn)對(duì)此類酶進(jìn)行了報(bào)道，但在這些已報(bào)道的酶中，大多數(shù)都存在著酶活和專一性不高的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種L-肉堿脫氫酶的提取與純化方法。該方法制備的L-肉堿脫氫酶產(chǎn)物的酶活7.49U/ml,比活達(dá)到2.848U/mg。
[0005]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:L_肉堿脫氫酶的提取與純化方法，包括以下步驟: [0006](I)L-肉堿脫氫酶粗酶液的獲得:
[0007]①菌株發(fā)酵:
[0008]菌株活化:將Ochrobactrum屬的一株能產(chǎn)優(yōu)良性質(zhì)的L-肉堿脫氫酶(EC1.1.1.108)的菌株L-3菌株接入斜面培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)20_30h進(jìn)行活化；
[0009]一級(jí)培養(yǎng):再將活化后的菌株接一環(huán)到液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為:100mL錐形瓶中裝液20mL，30 °C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180rpm，培養(yǎng)24小時(shí)；
[0010]二級(jí)培養(yǎng):然后以1%的接種量將菌液加入到液體培養(yǎng)基中，在與一級(jí)培養(yǎng)相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h ；
[0011]三級(jí)培養(yǎng)，15L發(fā)酵罐中裝IOL的液體培養(yǎng)基發(fā)酵27h，發(fā)酵的條件:發(fā)酵溫度30°C，攪拌速度 180rpm, ρΗ6.5 ；
[0012]②發(fā)酵液的濃縮處理
[0013]將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液8000rpm離心30min收集菌體，并用50mmol/L，pH7.0的PB緩沖液洗滌細(xì)胞一次；洗滌完之后，將所得的菌體懸浮于500mL PB緩沖液中，用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破壁，之后SOOOrpm離心30min去除細(xì)胞壁碎片，即得粗酶液，4°C下保存；
[0014](2) L-肉堿脫氫酶的純化
[0015]①硫酸銨分級(jí)鹽析[0016]在所述粗酶液中緩慢加入硫酸銨粉末，使飽和度分別達(dá)到35%、45%、55%、65%，同時(shí)不斷調(diào)節(jié)pH使其穩(wěn)定在7.0,鹽析過夜,在每個(gè)濃度都將粗酶液以8000rpm離心30min,在沉淀中以1:2的比例加入50mmol/L，pH7.0的PB緩沖液后測酶活和蛋白含量，將比活較高的部分收集起來裝入透析袋，用0.01mol/L, pH8.0的Tris-HCl緩沖液與4°C下透析,每隔12小時(shí)換一次透析液,換三次；透析結(jié)束后8000rpm離心30分鐘取上清以用于下一步的純化；
[0017]②DEAE-cellulose離子交換層析
[0018]DEAE-cellulose 層析柱(5.5X50cm)先用 0.01mol/L, ρΗ8.0 的 Tris-HCl 緩沖液平衡，再將透析后的酶液上此離子交換柱，用NaCl濃度為O到lmol/L的0.01mol/L,pH8.0的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速為lmL/min，15min收集一管；用Folin-酚法測定各管蛋白含量和測定各管酶活；將比活較高的幾管收集合并。
[0019]所述斜面培養(yǎng)基的成分為:1.0%L-肉堿，1.0%酵母膏，1.0%葡萄糖，0.2%三水磷酸氫二鉀，0.05%磷酸二氫鉀，，0.05%七水硫酸鎂，1.0%(ν/ν)微量元素液，1.5%瓊脂粉，ρΗ7.0。
[0020]所述液體培養(yǎng)基的成分為:0.5%L-肉堿，0.1%酵母膏，0.2%葡萄糖，0.2%三水磷酸氫二鉀，0.05%磷酸二氫鉀，，0.05%七水硫酸鎂，1.0%(ν/ν)微量元素液，1.5%瓊脂粉，pH6.5。
[0021]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0022](I)本發(fā)明L-肉堿脫氫酶經(jīng)過鹽析和DEAE-Cellulose離子交換層析后純化倍數(shù)達(dá)到104.7倍，酶活7.49U/ml,比活達(dá)到2.848U/mg。
[0023]( 2)本發(fā)明工藝 簡單，易操作，生產(chǎn)成本低。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為實(shí)施例2中的Folin-酚法的蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0025]圖2為實(shí)施例2中的各管酶活和蛋白含量。
【具體實(shí)施方式】
[0026]為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明所述的內(nèi)容后，該領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改動(dòng)或調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027]實(shí)施例
[0028]實(shí)驗(yàn)方法
[0029]1.菌體生長量的測定
[0030]細(xì)菌生長量通過測定發(fā)酵液在600nm處的吸光度來確定，調(diào)整菌液的稀釋倍數(shù)，使吸光度小于1.000。
[0031]2.L-肉堿脫氫酶酶活測定
[0032]在37°C 預(yù)熱后的 3.6mL 含 IOmM L-肉堿和 ImM NAD 的 Tris-HCl (50mM ；pH9.0)緩沖液中加入0.4mL待測樣品，充分混勻后立刻測定340nm處的吸光值，每隔30秒記錄一個(gè)讀數(shù)，調(diào)整待測樣品的稀釋倍數(shù)，使每分鐘吸光度變化在0.060-0.100之間。酶活定義為37°C每分鐘生成I μ mo I的NADH的酶量為一個(gè)酶活單位。
[0033]3蛋白濃度測定
[0034]3.1分光光度法
[0035]用分光光度計(jì)測定280nm處的吸收值,并根據(jù)公式10D280=1.67mg/mL來計(jì)算。
[0036]3.2Folin_ 酚法
[0037]Folin-酚法試劑:1、( I) 4%碳酸鈉(2) 0.2M氫氧化鈉(3) 1%硫酸銅(4) 2%酒石酸鉀鈉。(I)和(2)等體積混合。(3)和(4)等體積混合。然后將兩夜以50:1混合成試劑甲。當(dāng)天使用。2、1M Folin-酹試劑乙。
[0038]在試管中加0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.0OmL 牛血清白蛋白(500 μ g/mL)，加水不足lmL，平行做兩份，按序各加5mL試劑甲，搖勻，室溫放置10分鐘，再依次加入0.5mL試劑乙，搖勻，30°C保溫30分鐘。然后在分光光度計(jì)上比色測定(OD5J。橫坐標(biāo)為蛋白含量，縱坐標(biāo)為光密度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測樣品如上反應(yīng)和測定，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出蛋白含量。
[0039]3.3Lineweaver_Burk 作圖法
[0040]以酶促反應(yīng)底物濃度的倒數(shù)Ι/s為橫坐標(biāo)，酶促反應(yīng)速率的倒數(shù)Ι/v為縱坐標(biāo)作一直線圖，縱軸截距為_l/vmax，斜率為KmzVmax，橫軸截距為-1/Km。
[0041]實(shí)施例1關(guān)于液體培養(yǎng)基中酵母膏濃度的確定
[0042]先將Ochrobactrum屬的一株能產(chǎn)優(yōu)良性質(zhì)的L-肉堿脫氫酶(EC1.1.1.108)的菌株L-3菌株接入斜面培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)20-30h，再將活化后的菌株接一環(huán)到液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為=IOOmL錐形瓶中裝液20mL，30°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180rpm，培養(yǎng)24小時(shí)。然后以1%的接種量將菌液分別加入到含0,0.05%，0.1%, 0.2%, 0.5%，1.0%酵母膏的液體培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)24h。分別測定各培養(yǎng)基中菌體的生長量。用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)破碎菌體細(xì)胞，功率200W，工作4秒，停止4秒，循環(huán)99次。將破碎后的菌液8000rpm離心30分鐘，取上清即粗酶液測L-肉堿脫氫酶活性。
[0043]分別測定各培養(yǎng)基的酶活(見表I)和生長量(見表2)。
[0044]表I不同酵母膏濃度下L-3產(chǎn)生的L-肉堿脫氫酶活性
[0045]
【權(quán)利要求】
1.L-肉堿脫氫酶的提取與純化方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)L-肉堿脫氫酶粗酶液的獲得: ①菌株發(fā)酵: 菌株活化:將Ochrobactrum屬的一株能產(chǎn)優(yōu)良性質(zhì)的L-肉堿脫氫酶(EC1.1.1.108)的菌株L-3菌株接入斜面培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)20-30h進(jìn)行活化； 一級(jí)培養(yǎng):再將活化后的菌株接一環(huán)到液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為=IOOmL錐形瓶中裝液20mL，30 °C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180rpm，培養(yǎng)24小時(shí)； 二級(jí)培養(yǎng):然后以1%的接種量將菌液加入到液體培養(yǎng)基中，在與一級(jí)培養(yǎng)相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h ； 三級(jí)培養(yǎng)，15L發(fā)酵罐中裝IOL的液體培養(yǎng)基發(fā)酵27h，發(fā)酵的條件:發(fā)酵溫度30°C，攪祥速度 180rpm, pH6.5 ； ②發(fā)酵液的濃縮處理 將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液8000rpm離心30min收集菌體，并用50mmol/L，pH7.0的PB緩沖液洗滌細(xì)胞一次；洗滌完之后，將所得的菌體懸浮于500mLPB緩沖液中，用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破壁，之后SOOOrpm離心30min去除細(xì)胞壁碎片，即得粗酶液，4°C下保存； (2)L-肉堿脫氫酶的純化 ①硫酸銨分級(jí)鹽 析 在所述粗酶液中緩慢加入硫酸銨粉末，使飽和度分別達(dá)到35%、45%、55%、65%，同時(shí)不斷調(diào)節(jié)pH使其穩(wěn)定在7.0,鹽析過夜,在每個(gè)濃度都將粗酶液以8000rpm離心30min,在沉淀中以1:2的比例加入50mmol/L，pH7.0的PB緩沖液后測酶活和蛋白含量，將比活較高的部分收集起來裝入透析袋，用0.01mol/L,pH8.0的Tris-HCl緩沖液與4°C下透析，每隔12小時(shí)換一次透析液，換三次；透析結(jié)束后8000rpm離心30分鐘取上清以用于下一步的純化； ②DEAE-celIulose離子交換層析 DEAE-cellulose 層析柱(5.5X50cm)先用 0.01mol/L, ρΗ8.0 的 Tris-HCl 緩沖液平衡，再將透析后的酶液上此離子交換柱，用NaCl濃度為O到lmol/L的0.01mol/L,pH8.0的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速為lmL/min，15min收集一管；用Folin-酚法測定各管蛋白含量和測定各管酶活；將比活較高的幾管收集合并。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-肉堿脫氫酶的提取與純化方法，其特征在于，所述斜面培養(yǎng)基的成分為:1.0%L-肉堿，1.0%酵母膏，1.0%葡萄糖，0.2%三水磷酸氫二鉀，0.05%磷酸二氫鉀，,0.05%七水硫酸鎂，1.0%(ν/ν)微量元素液，1.5%瓊脂粉，ρΗ7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-肉堿脫氫酶的提取與純化方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基的成分為:0.5%L-肉堿，0.1%酵母膏，0.2%葡萄糖，0.2%三水磷酸氫二鉀，0.05%磷酸二氫鉀，,0.05%七水硫酸鎂，1.0%(ν/ν)微量元素液，1.5%瓊脂粉，ρΗ6.5。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103436503SQ201310378666
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月27日
【發(fā)明者】錢江, 馬曉航, 錢峰, 張鵬程 申請(qǐng)人:寧波賽克生物技術(shù)有限公司