專利名稱：一種豬α-干擾素的生產(chǎn)方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于治療豬感染病領域，主要是提供了一個高效簡單的干擾素分泌、分離純化方法。
背景技術(shù)：
干擾素最早被分為I型與II型，I型曾被稱為白細胞干擾素，II型曾被叫成纖維細胞干擾素。后來發(fā)現(xiàn)I型干擾素中還有二種成分，雖然它們共用受體成分，但二者的結(jié)構(gòu)不同，免疫原性也完全不同，于是將I型又分為α及β兩類。其中IFN-α是2 O個結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子量約為ISKDa的多肽家族，每個由獨立的基因編碼；IFN-β是個單基因產(chǎn)物， 是分子量20KDa的糖蛋白。后來把II型則定為Y類，IFN-γ是由大約21_MKDa的亞基組成的以同源雙體形式存在的糖蛋白，對56°C、pH2和0. 1%SDS敏感。因此，干擾素就分為α、 β、Y三大類。近年來，還發(fā)現(xiàn)了 ω、τ等類型的干擾素。I型干擾素又稱抗病毒干擾素，其生物學活性以抗病毒為主；II型干擾素又稱免疫干擾素，其生物學活性以免疫調(diào)節(jié)為主。常規(guī)發(fā)酵表達干擾素的方法，在回收干擾素時要進行菌體破碎。菌體破碎存在以下不足之處一是成本高，操作復雜；二是菌體破碎工藝對干擾素有一定破會作用，使干擾素活性和穩(wěn)定性受到影響；三是菌體破碎會產(chǎn)生很多雜蛋白以及其他雜質(zhì)，混合在干擾素中，難于分離，使干擾素產(chǎn)品純度下降，生物活性下降。如果是用大腸桿菌作為表達體系，菌體破碎會使內(nèi)毒素混合在干擾素中，給用藥安全造成一定風險。若從發(fā)酵液中回收干擾素時，通常采用鹽析法，鹽析法存在以下不足之處一是鹽析法沒有選擇性，雜蛋白也會被沉淀混合在干擾素中，使干擾度純度下降；二是鹽析法對干擾素活性存在一定影響，部分干擾素在沉淀過程中因為結(jié)構(gòu)被破壞而散失活性。豬α-干擾素主要用于藍耳病毒、豬瘟病毒、圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒、流感病毒、流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒等感染，同時還可調(diào)劑動物機體免疫功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在簡化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本，獲得高活性、高穩(wěn)定性重組豬 α-干擾素產(chǎn)品。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)方法是一是用甲醇的混合物生產(chǎn)干擾素；二是采用多效超濾提純干擾素。根據(jù)干擾素分子量選擇不同截留分子量的超濾膜做成過濾器，通過過濾使發(fā)酵液中大于干擾素分子量的雜蛋白和雜質(zhì)、小于干擾素分子量的雜蛋白、無機鹽以及水被出去，僅保留干擾素和少量的水，冷凍干燥得到的干擾素成品純度高、活性高、穩(wěn)定性好。一種豬α -干擾素的生產(chǎn)方法，其步驟包括 一、用甲醇的混合物生產(chǎn)干擾素
第一步、備料單克隆、甘油、甲醇的混合物；
第二步、單克隆接種到一級種子液，培養(yǎng)17 20h ；
第三步、按XX =YY=I 10比例二級接種于三角燒瓶，培養(yǎng)4 他；第四步、發(fā)酵
PH5.0，溫度20°C，D0> 35%，當溶氧上升到10 15后；轉(zhuǎn)速加50%甘油；待甘油耗盡， 溶氧再次上升后；
第五步、甲醇的混合物誘導得到α-干擾素
用含甲醇的混合物以轉(zhuǎn)速1開始誘導，誘導4 后，得到α -干擾素。二、純化α-干擾素
第六步、α-干擾素液體經(jīng)二級串聯(lián)過濾器過濾，一級串聯(lián)過濾器串接二級串聯(lián)過濾器，一級串聯(lián)過濾器濾膜孔徑為0. 45 μ m、二級串聯(lián)過濾器濾膜孔徑為0. 22 μ m ； 第七步、濾液通過22KD超濾系統(tǒng)過濾； 第八步、所得濾液再通過18KD超濾系統(tǒng)進行濃縮； 第九步、冷凍干燥后得到的較純的α-干擾素。本發(fā)明采用改造后的畢赤酵母表達體系分泌表達豬α -干擾素，通過優(yōu)化發(fā)酵工藝，簡化純化工藝，獲得高表達、高活性、高穩(wěn)定性，且及具產(chǎn)業(yè)化價值的豬α -干擾素。
具體實施例方式實施例
1、干擾素的產(chǎn)生
取單克隆，接種到一級種子液中，培養(yǎng)17 20h，按1:10比例二級接種于三角燒瓶，培養(yǎng)4 8h，上罐發(fā)酵，pH5. 0，溫度20°C，D0 > 35%，當溶氧上升到10 15后，轉(zhuǎn)速加50%甘油。待甘油耗盡，溶氧再次上升后用含甲醇的混合物以轉(zhuǎn)速1開始誘導，誘導4 后，檢測產(chǎn)物濃度。2、干擾素的純化
取發(fā)酵液50L，經(jīng)過二級串聯(lián)過濾器過濾，濾膜孔徑分別為0. 45 μ m和0. 22 μ m,將濾液通過22KD超濾系統(tǒng)過濾，所得濾液再通過18KD超濾系統(tǒng)進行濃縮，待濃縮液體積為0. 5L 時停止?jié)饪s，將濃縮液中樣品含量合格后無菌分裝到西林瓶，冷凍干燥。以上實施例僅為了對本發(fā)明作進一步的說明，而本發(fā)明的范圍不受所舉實施例的局限。
權(quán)利要求
1. 一種豬α-干擾素的生產(chǎn)方法，其步驟包括一、用甲醇的混合物生產(chǎn)干擾素第一步、備料單克隆、甘油、甲醇的混合物；第二步、單克隆接種到一級種子液，培養(yǎng)17 20h ；第三步、按XX =YY=I 10比例二級接種于三角燒瓶，培養(yǎng)4 他；第四步、發(fā)酵PH5.0，溫度20°C，D0>35%，當溶氧上升到10 15后；轉(zhuǎn)速加50%甘油，待甘油耗盡， 溶氧再次上升后；第五步、甲醇的混合物誘導得到α-干擾素用含甲醇的混合物以轉(zhuǎn)速1開始誘導，誘導4 后，得到α -干擾素；二、純化α-干擾素第六步、α-干擾素液體經(jīng)二級串聯(lián)過濾器過濾，一級串聯(lián)過濾器串接二級串聯(lián)過濾器，一級串聯(lián)過濾器濾膜孔徑為0. 45 μ m、二級串聯(lián)過濾器濾膜孔徑為0. 22 μ m ； 第七步、濾液通過22KD超濾系統(tǒng)過濾； 第八步、所得濾液再通過18KD超濾系統(tǒng)進行濃縮； 第九步、冷凍干燥后得到的較純的α-干擾素。
全文摘要
本發(fā)明涉及的一種豬α-干擾素的生產(chǎn)方法屬于治療豬感染病領域，主要是提供了一個高效簡單的干擾素分泌、分離純化方法。其目的旨在簡化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本，獲得高活性、高穩(wěn)定性重組豬α-干擾素產(chǎn)品。所提供的生產(chǎn)方法是一是用甲醇的混合物生產(chǎn)干擾素；二是采用多效超濾提純干擾素。根據(jù)干擾素分子量選擇不同截留分子量的超濾膜做成過濾器，通過過濾使發(fā)酵液中大于干擾素分子量的雜蛋白和雜質(zhì)、小于干擾素分子量的雜蛋白、無機鹽以及水被出去，僅保留干擾素和少量的水，冷凍干燥得到的干擾素成品純度高、活性高、穩(wěn)定性好。
文檔編號C12R1/84GK102559819SQ20121006124
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月9日
發(fā)明者劉易通, 李振天, 王慶福 申請人:廣東紫金正天藥業(yè)有限公司