專利名稱：含有草魚干擾素基因的重組質(zhì)粒、工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)生物技術(shù)和水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治技術(shù)領(lǐng)域。特別涉及一種利用分子生物學(xué)技術(shù)，克隆草魚干擾素基因，構(gòu)建含有該基因的重組酵母表達(dá)質(zhì)粒，并在釀酒酵母中獲得高效表達(dá)，利用表達(dá)干擾素的酵母工程菌，直接研制成抗病飼料添加劑，應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物病害防治。
背景技術(shù)：
隨著漁業(yè)生產(chǎn)的迅猛發(fā)展，水產(chǎn)動(dòng)物病害日益突出，已成為當(dāng)前嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的世界性難題，在我國尤其突出。近年來，我國因病害導(dǎo)致的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)直接經(jīng)濟(jì)損失每年超過百億元，而且逐年攀升。但長期以來，一直缺乏有效的病害防治方法；各種抗生素、殺蟲劑濫用，造成養(yǎng)殖環(huán)境和水產(chǎn)品嚴(yán)重污染，水產(chǎn)食品安全受到嚴(yán)重威脅，同時(shí)抗生素產(chǎn)生的耐藥性又加劇了水產(chǎn)動(dòng)物病害的發(fā)生，形成惡性循環(huán)。隨著我國加入WTO和食品安全法的頒布，對(duì)環(huán)境和食品安全的標(biāo)準(zhǔn)越來越高，當(dāng)前一大批抗生素已被明令禁用，水產(chǎn)動(dòng)物病害防治已面臨無藥可施的困境，因此研制開發(fā)天然、安全、高效的水產(chǎn)動(dòng)物病害防治藥物已迫在眉睫，它對(duì)支撐我國水產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展，確保我國食物安全，提高國民健康素質(zhì)，引領(lǐng)我國漁業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和水產(chǎn)科學(xué)的創(chuàng)新都非常重要和十分緊迫，具有重大的經(jīng)濟(jì)社會(huì)意義。
水產(chǎn)動(dòng)物重要免疫抗病因子的開發(fā)利用是從根本上解決水產(chǎn)動(dòng)物病害防治、保障水產(chǎn)食品安全的有效途徑。然而，由于長期來國內(nèi)外對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫抗病因子的研究比較薄弱，特別是分離鑒定的關(guān)鍵抗病因子非常有限，因此，有關(guān)該領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用研究還幾乎是空白。
干擾素(Interferon，IFN)是機(jī)體天然免疫中最關(guān)鍵的非特異性免疫因子，是機(jī)體受病毒等感染后分泌產(chǎn)生的一種具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)活性的糖蛋白。然而，目前對(duì)其研究和開發(fā)應(yīng)用主要見諸人類醫(yī)學(xué)臨床和部分高等動(dòng)物，如畜禽。作為低等脊椎動(dòng)物的魚類干擾素的研究還較少，表現(xiàn)在對(duì)其生物學(xué)性質(zhì)和免疫學(xué)功能的了解還不多，特別是對(duì)其在水產(chǎn)動(dòng)物病害防治中的開發(fā)應(yīng)用研究還幾乎是空白。由于人類(包括高等動(dòng)物)與魚類間存在較大的種族特異性差異，已有的人類干擾素制劑不適用于魚類等水產(chǎn)動(dòng)物；具體表現(xiàn)在人類干擾素在魚類中活性低，特別是人類干擾素應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物有潛在食品安全危害，因此，研制開發(fā)水產(chǎn)動(dòng)物自身的干擾素是一項(xiàng)緊迫的課題。與人類醫(yī)學(xué)干擾素的研制開發(fā)要求不同的是，水產(chǎn)動(dòng)物用干擾素要求使用方便、成本低廉，這樣才有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在醫(yī)學(xué)上，可以從人白細(xì)胞分離天然干擾素，也可以通過基因工程制備重組干擾素，但由于人類干擾素的使用采用針劑注射等方式，純度要求高，這樣成本就會(huì)大大提高；而水產(chǎn)用干擾素由于水產(chǎn)動(dòng)物水體生活的特殊性，不宜采用逐個(gè)個(gè)體針劑注射方式，采用飼料添加劑投喂是理想且方便的途徑，同時(shí)為了降低成本，天然提取方法一般難以實(shí)現(xiàn)，因此采用重組表達(dá)技術(shù)是較為合適的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種含有草魚干擾素基因的重組質(zhì)粒，以及含有該質(zhì)粒并能高效表達(dá)草魚干擾素蛋白的釀酒酵母工程菌，該工程菌及草魚干擾素蛋白能用于水產(chǎn)動(dòng)物抗病毒及提高免疫抗病能力。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種含有草魚干擾素基因的重組質(zhì)粒，該基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供一種工程菌，該菌株INVSC1-pYES2-IFN為釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日2006年10月19日，保藏號(hào)CGMCC1847。
本發(fā)明還提供上述工程菌在水產(chǎn)動(dòng)物抗病毒中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供一種蛋白質(zhì)在水產(chǎn)動(dòng)物抗病毒中的應(yīng)用，該蛋白質(zhì)為具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的草魚干擾素基因所編碼。
本發(fā)明人率先在國內(nèi)外系統(tǒng)開展了草魚干擾素的研究，先后從草魚血清和白細(xì)胞中分離純化了干擾素蛋白質(zhì)，系統(tǒng)研究了其組織細(xì)胞來源、誘導(dǎo)產(chǎn)生規(guī)律、理化性質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)功能；并克隆了其基因，實(shí)現(xiàn)了草魚干擾素蛋白在釀酒酵母中的高效表達(dá)(表達(dá)量達(dá)到30％)，測定了酵母表達(dá)的草魚干擾素具有與天然干擾素相同的生物學(xué)活性，并利用高效表達(dá)干擾素的酵母工程菌，通過超聲破碎和氣流干燥，研制成含草魚干擾素的酵母粉抗病飼料添加劑，經(jīng)魚蝦等水產(chǎn)動(dòng)物病害防治應(yīng)用試驗(yàn)，取得良好效果，表明草魚干擾素具有普遍適用于水產(chǎn)動(dòng)物免疫抗病保護(hù)作用，具有重要應(yīng)用價(jià)值，對(duì)該抗病因子的開發(fā)利用，在國內(nèi)外尚屬首次。
本發(fā)明人還率先在草魚中分離鑒定了魚類免疫抗病的關(guān)鍵因子干擾素，通過對(duì)其生物學(xué)性質(zhì)與功能的系統(tǒng)研究，證明魚類干擾素具有廣譜的抗病毒活性，同時(shí)對(duì)魚類巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等具有明顯的激活作用，具有顯著調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體免疫水平的功能，是具有重要開發(fā)應(yīng)用價(jià)值的水產(chǎn)動(dòng)物抗病因子。
在現(xiàn)有的技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)目前已發(fā)展了多種表達(dá)系統(tǒng)，包括原核和真核表達(dá)系統(tǒng)，如細(xì)菌、酵母、動(dòng)植物細(xì)胞等；通過比較分析，我們發(fā)現(xiàn)常用的大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)魚類等水產(chǎn)動(dòng)物有一定毒性，不適合直接作為抗病飼料開發(fā)應(yīng)用，而動(dòng)植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)則需大規(guī)模培養(yǎng)，成本高。為此我們采用釀酒酵母系統(tǒng)對(duì)草魚干擾素進(jìn)行開發(fā)，以保證其安全無毒性，同時(shí)由于釀酒酵母本身可作為飼料，適合于投喂，發(fā)酵生產(chǎn)成本低，是水產(chǎn)動(dòng)物活性因子開發(fā)應(yīng)用的理想系統(tǒng)。
釀酒酵母目前主要用于啤酒工業(yè)，此外也可作為酵母飼料而用于飼料工業(yè)。酵母飼料是指利用酵母菌的新陳代謝和繁殖菌體，經(jīng)過發(fā)酵和干燥等工藝制成的含有菌體和酵母細(xì)胞代謝產(chǎn)物的安全、無污染、無殘留的優(yōu)質(zhì)飼料。利用釀酒酵母表達(dá)外源基因具有翻譯后加工能力，收獲的外源蛋白質(zhì)具有一定程度的折疊加工和糖基化修飾，特別適合于表達(dá)真核生物基因，目前已在乙型肝炎疫苗、人胰島素、人粒細(xì)胞集落刺激因子、人血管抑制素等藥物開發(fā)中得以應(yīng)用，但在魚類藥物開發(fā)中的應(yīng)用很少，利用其表達(dá)干擾素，并直接作為抗病飼料的開發(fā)應(yīng)用尚屬首次。此外，釀酒酵母應(yīng)用于生產(chǎn)具有生長繁殖迅速，工藝簡單等優(yōu)點(diǎn)，能夠耐受較高的流體靜壓，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低生產(chǎn)成本，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。
本發(fā)明的工程菌和蛋白質(zhì)在水產(chǎn)動(dòng)物抗病毒中的應(yīng)用，具體表現(xiàn)為創(chuàng)制成為一種水產(chǎn)動(dòng)物干擾素抗病制劑，并研制成酵母飼料添加劑形式的應(yīng)用；目的在于開發(fā)利用我國經(jīng)濟(jì)魚類天然免疫抗病因子，保護(hù)我國魚類重要基因資源，替代目前漁業(yè)生產(chǎn)中濫用的抗生素、殺蟲劑等有害藥物，保障食品安全，同時(shí)解決水產(chǎn)動(dòng)物病毒性病害目前尚無有效防治藥物這一世界性難題。魚類干擾素制劑以飼料添加劑形式的應(yīng)用，能克服以往醫(yī)學(xué)干擾素制劑價(jià)格昂貴、以及注射給予藥物難以在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中推廣應(yīng)用等缺陷。
上文所述的水產(chǎn)動(dòng)物免疫抗病制劑，為含草魚干擾素基因表達(dá)質(zhì)粒酵母工程菌所表達(dá)的草魚干擾素蛋白，或表達(dá)草魚干擾素的酵母工程菌菌粉，干擾素蛋白所占酵母總蛋白的比例為20％～30％。因此該水產(chǎn)動(dòng)物免疫抗病制劑，具有抗病毒功能和免疫調(diào)節(jié)生物學(xué)功能，在草魚ZC7901吻端細(xì)胞和CP80胚胎細(xì)胞株上，具有抑制草魚出血病病毒(GCHV)活性，其滴度(Log2CPEI50/0.1ml)達(dá)到11.29±0.18以上；一齡草魚背鰭皮下注射干擾素蛋白(10μg/尾)12小時(shí)后，人工感染GCHV(500TCID50)/尾，相對(duì)免疫保護(hù)率(Relative Percent Survival，RPS)可以達(dá)到59.42％；一齡草魚飼喂含有干擾素的飼料(10mg GcIFN/Kg飼料)，連續(xù)飼喂1周，人工感染GCHV(500TCID50)/尾，相對(duì)免疫保護(hù)率可以達(dá)到29.58％；將表達(dá)草魚干擾素的酵母菌粉添加入配合餌料(餌料中干擾素含量為10mg GcIFN/Kg)，飼喂南美白對(duì)蝦和中國對(duì)蝦，每天2次，連續(xù)飼喂7天，人工感染白斑綜合癥病毒(WSSV)，相對(duì)免疫保護(hù)率分別達(dá)到11.60％和10.40％；經(jīng)干擾素處理的巨噬細(xì)胞具有顯著的增強(qiáng)對(duì)酵母菌的吞噬殺菌作用，同時(shí)干擾素對(duì)外周血和頭腎T、B淋巴細(xì)胞也有明顯的促進(jìn)增殖轉(zhuǎn)化作用，對(duì)養(yǎng)殖魚類的抗病試驗(yàn)表明，使用含干擾素飼料的實(shí)驗(yàn)組草魚和鱸魚，成活率均明顯提高，免疫保護(hù)率分別達(dá)到62.39％和48.61％；對(duì)養(yǎng)殖蝦類的抗病試驗(yàn)表明，使用含干擾素飼料的實(shí)驗(yàn)組南美白對(duì)蝦和中國對(duì)蝦，成活率明顯提高，免疫保護(hù)率分別達(dá)到30.80％和20.99％，表明IFN能提高魚蝦類的免疫抗病能力。
本發(fā)明所提供的水產(chǎn)動(dòng)物干擾素抗病制劑，其優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在(1)用釀酒酵母表達(dá)的干擾素是來源于動(dòng)物本身的一種免疫抗病因子，不僅具有生物學(xué)活性，而且安全無毒、價(jià)格低廉；(2)釀酒酵母工程菌制備的菌粉可直接作為飼料，適合投喂，克服了水產(chǎn)動(dòng)物無法注射給藥的困難；(3)干擾素蛋白不僅有抗病毒作用，還具有免疫調(diào)節(jié)功能，可增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物自身的抗病能力；(4)本制劑具有廣譜的抗病作用，除草魚外還可用于鱸魚、對(duì)蝦等多種水產(chǎn)動(dòng)物的病害防治。
本發(fā)明的有益效果，具體如下本發(fā)明率先在國內(nèi)外分離鑒定了草魚干擾素免疫因子，通過對(duì)該因子生物學(xué)性質(zhì)與功能的系統(tǒng)研究，確認(rèn)干擾素為魚類關(guān)鍵免疫抗病因子，在此基礎(chǔ)上，通過克隆草魚干擾素基因和構(gòu)建草魚干擾素高效表達(dá)質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)了該因子在釀酒酵母中的高效表達(dá)，利用表達(dá)干擾素的酵母工程菌，經(jīng)適當(dāng)工藝處理，研制成抗病飼料添加劑，在魚類和蝦類等水產(chǎn)動(dòng)物病害防治中開展抗病試驗(yàn)，取得良好效果。
魚類干擾素作為一種重要免疫抗病因子，具有重大開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，它作為一種替代抗生素和農(nóng)藥的安全、高效、天然水產(chǎn)動(dòng)物病害防治藥物，可以為長期來困擾我國漁業(yè)發(fā)展的病害防治開辟新途徑，對(duì)促進(jìn)我國水產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展，確保食物安全，提高國民健康素質(zhì)，引領(lǐng)我國漁業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和水產(chǎn)科學(xué)的創(chuàng)新具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。研究成果同時(shí)對(duì)揭示魚類免疫系統(tǒng)的分子組成及其作用機(jī)制、免疫因子分子起源及進(jìn)化規(guī)律具有重要理論意義。


圖1為本發(fā)明一種實(shí)施例的重組表達(dá)質(zhì)粒IFN-pYES2的構(gòu)建。
圖2為本發(fā)明一種實(shí)施例的目的基因的菌落PCR鑒定圖。
圖3為本發(fā)明一種實(shí)施例的重組質(zhì)粒IFN-pYES2經(jīng)Hind III和Xho I雙酶切鑒定圖，酶切片斷大小約為550bp與預(yù)期大小相同。
圖4為本發(fā)明一種實(shí)施例的pYES2-IFN/INVSC1誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析圖；圖4中箭頭所指為目的蛋白，其分子量為38000Da；第3列為空載體，第4、5、6列分別為誘導(dǎo)14、38、60小時(shí)的干擾素蛋白的表達(dá)情況，在14h誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)量最高。
圖5為本發(fā)明一種實(shí)施例的GcIFN誘導(dǎo)Mx基因的時(shí)間梯度和濃度梯度效應(yīng)示意圖，結(jié)果顯示，Mx的誘導(dǎo)量隨著加入的IFN濃縮液的量的增加而增加；而在加入同樣誘導(dǎo)量的前提下，最高誘導(dǎo)峰值出現(xiàn)在加入誘導(dǎo)物后的24小時(shí)后，到了36小時(shí)開始減退。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述實(shí)施例1、草魚干擾素基因克隆從草魚背鰭皮下注射0.5ml poly IC(購自天津藥廠)，26℃水溫誘導(dǎo)12hr后再注射一次，12小時(shí)后取頭腎10克左右，用TRizol(Gibco BRL，USA)提取總RNA，提取方法按說明書進(jìn)行。然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RNA PCR kit(AMV)Ver3.0(TaKaRa，USA)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。引物序列如表1所示。
擴(kuò)增產(chǎn)物純化后(使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒DNA Gel Extraction Kit，V-gene)插入T載體(TA克隆試劑盒購自上海生工)。操作步驟均按照說明書所示。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，篩選陽性重組子進(jìn)行測序鑒定。轉(zhuǎn)化和鑒定方法按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行。根據(jù)鑒定得到的序列設(shè)計(jì)5’RACE和3’RACE引物(其序列如表1所示)，使用TaKaRa 5’-Full RACE Core Set和TaKaRa 3’-Full RACE Core Set按照說明書所述步驟進(jìn)行5’RACE和3’RACE擴(kuò)增，最后進(jìn)行序列的拚接，得到一條長1191堿基的cDNA序列。用NCBI ORFFinder分析可知開放閱讀框ORF長543bp，編碼180個(gè)氨基酸。其余5’UTR長34bp，3’UTR長614bp。
表1.草魚干擾素基因PCR擴(kuò)增所用引物(5’-3’)

實(shí)施例2、草魚干擾素基因序列測定和分析用NCBI ORF Finder分析實(shí)施例1中所得的cDNA序列，可知開放閱讀框ORF長543bp，編碼180個(gè)氨基酸。其余5’UTR長34bp，3’UTR長614bp；用PROSITE database進(jìn)行潛在功能位點(diǎn)分析以及用信號(hào)肽分析軟件SignalPprogram(version 3.0)進(jìn)行信號(hào)態(tài)分析，得出的結(jié)論是其蛋白等電點(diǎn)為9.73，且該基因具有一個(gè)長為22各氨基酸的信號(hào)肽，預(yù)示著，它的成熟肽為159個(gè)氨基酸；用Prosite進(jìn)行位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)該基因同時(shí)具有2個(gè)N末端14酰化位點(diǎn)GqcsAC和GTkvSF；2個(gè)蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)SacE ShkE；一個(gè)N末端糖基化位點(diǎn)NESL；一個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)ShK；兩個(gè)染色體核前導(dǎo)序列Kkinrhfkilkknlkkk和Kkeysaqaweqirravk；用軟件ClastalW將本發(fā)明的基因序列與其他八種生物包括人、小鼠、大西洋鮭魚、雞、斑馬魚、鯽魚、紅鰭東方豚和鯰魚的IFN同源基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果顯示，IFN同源基因的氨基酸序列在不同魚類的物種中同源性較高。其中，草魚與斑馬魚和鯽魚同為鯉科，它們的氨基酸序列存在很高的同源性，達(dá)90％以上。
實(shí)施例3、草魚干擾素表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)實(shí)施例1得到的干擾素基因序列設(shè)計(jì)表達(dá)載體構(gòu)建引物，序列如下上游引物自GcIFN ATG起始，5’端含Hind III酶切位點(diǎn)和Kozak序列ACCgc-IFN-F35’-CCC AAG CTT GGG ACC ATG GAA ACT CAA ATGTGG-3’下游引物自終止密碼字TAA開始，5’端加入Xho I酶切位點(diǎn)gc-IFN-R35’-GGCGAGCTCGCCTTATCGTCTGTTGGCAATGC-3’按照實(shí)施例1中方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物用Hind III和Xho I(TAKARA公司)進(jìn)行雙酶切，插入到表達(dá)載體pYES2中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中的堿裂解法提取重組表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果證明得到插入方向正確的重組表達(dá)質(zhì)粒，含完整的GcIFN基因，長度約560bp，包括長為22個(gè)aa的信號(hào)肽?；?’端有Hind III酶切位點(diǎn)，3’端含有Xho I酶切位點(diǎn)。重組質(zhì)粒的構(gòu)建方案如附圖1所示。
實(shí)施例4、表達(dá)草魚干擾素的釀酒酵母工程菌構(gòu)建、篩選及其誘導(dǎo)表達(dá)4.1、重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞堿裂解法抽提少量質(zhì)粒，方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。制備酵母感受態(tài)細(xì)胞，方法如下挑取YPD培養(yǎng)基中一單克隆INVSC1于2mlYPD液體培養(yǎng)基中，30℃，250～300rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取少量SC懸浮液涂SC平板，鑒定表型；取200ul接種至100ml含YPD培養(yǎng)基的三角搖瓶中，30℃，250～300rpm振蕩培養(yǎng)過夜至OD600為1.3～1.5；細(xì)胞冰浴15min，終止生長；4℃ 3000rpm5min離心收集細(xì)胞，用100ml預(yù)冷的無菌水重懸；4℃ 3000rpm 5min離心收集細(xì)胞，用50ml預(yù)冷的無菌水重懸；4℃ 3000rpm 5min離心收集細(xì)胞，用4ml預(yù)冷的1M山梨醇重懸；4℃ 2000rpm 5min離心收集細(xì)胞，用100ul預(yù)冷的1M山梨醇重懸，終體積約為200～300ul，按40ul/管分裝，4℃，保存一周；獲得酵母感受態(tài)細(xì)胞后，用電脈沖轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母，方法如下將40ul酵母懸浮液與小于5ul質(zhì)粒DNA混合于預(yù)冷的電穿孔管(0.2cm)，輕搖管底，以確保樣品與鋁管兩側(cè)接觸，冰浴5min；脈沖參數(shù)V＝1.5kV，25uF，200Ohms，4-5ms；電轉(zhuǎn)化后立刻加1ml預(yù)冷的1M山梨醇，用無菌移液管轉(zhuǎn)移至無菌eppendorf管；涂布SC-U培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，每200ul涂布一塊平板；將平板至于30℃培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)。
4.2、篩選陽性轉(zhuǎn)化子用酵母質(zhì)粒小提試劑盒提取酵母質(zhì)粒DNA(天為時(shí)代，DP112)。將得到的酵母質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，堿裂解法抽提質(zhì)粒(方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)，用PCR和Hind III、Xho I雙酶切等方法鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，鑒定結(jié)果如附圖2、3所示。
4.3、重組干擾素的誘導(dǎo)表達(dá)挑單菌落重組子與含2％棉籽糖的15ml SC-U培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)過夜；取過夜培養(yǎng)物測OD600值，由此計(jì)算在50ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所需加入的過夜培養(yǎng)物的數(shù)量，誘導(dǎo)培養(yǎng)基初始OD值需達(dá)到0.4；按照計(jì)算所得的量取過夜培養(yǎng)物，4℃，1,500g離心5min，收集細(xì)胞；用1～2ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種與50ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)；在0、2、4、6、8、10、12小時(shí)的時(shí)候收集細(xì)胞。每個(gè)時(shí)段取樣5ml，分別測OD600值；4℃，1500g離心5min，收集細(xì)胞；棄上清，用500ul滅菌水重懸細(xì)胞；將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5ml eppendorf管中，最高速離心30sec；棄上清，-80℃保存。
4.4、干擾素蛋白表達(dá)的鑒定用500ul裂解液(BioDev-Tech，DB001-12)重懸細(xì)胞，4℃ 1500g離心5min，收集細(xì)胞；棄上清，用裂解液重懸細(xì)胞，將OD600值調(diào)到50-100，加入等體積的玻璃珠(Sigma G-8772)振蕩30sec，冰浴30sec，重復(fù)4次裂解細(xì)胞，然后取部分鏡檢觀察細(xì)胞破碎效果；最高速離心10min；吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中；加入SDS-PAGE樣品緩沖液至終濃度為1×，煮沸5min；取20ul溶菌液加樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色，鑒定出表達(dá)蛋白的條帶。結(jié)果如附圖4所示。
實(shí)施例5、干擾素蛋白的生物學(xué)功能鑒定5.1干擾素蛋白的提取采用非變性梯度PAGE(6％～20％)電泳分離干擾素蛋白(方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)，電極液為0.025mol/L Tris-0.192mol/Lgly(pH8.3)，100V電泳6小時(shí)后，切取部分蛋白條帶染色，然后根據(jù)染色結(jié)果切取含有干擾素蛋白質(zhì)的凝膠條帶，裝入處理過的透析袋中，加入適量緩沖液，放入電泳洗脫槽中，25mA4℃低溫電泳2-3小時(shí)，收集干擾素蛋白液，冰凍干燥濃縮，再用高效液相層析(HPLC)純化，用島津Shim-Pack DIOL-150凝膠分離柱(柱長25cm，直徑0.79cm)，洗脫液為含0.2mol/L Na2SO4的10mmol/L PB緩沖液(pH7.2)，流速1mL/min，檢測波長280nm，干擾素樣品經(jīng)冰凍干燥濃縮，保存于-20℃，用于活性與功能等測定。使用前用半數(shù)細(xì)胞病變抑制(CPEI50)法測得其活性為105U/ml，使用時(shí)用L-15或TC-199培養(yǎng)液配制成5000U/ml、500U/ml、250U/ml、50U/ml和5U/ml。
5.2誘導(dǎo)Mx表達(dá)功能鑒定Mx蛋白是干擾素信號(hào)通路下游發(fā)揮抗病毒作用的重要因子，誘導(dǎo)Mx蛋白的表達(dá)是鑒定干擾素功能的重要指標(biāo)。將提取的干擾素蛋白加入到草魚ZC7901細(xì)胞中，分別于12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)取樣提RNA(方法同實(shí)施例1)，用RT-PCR方法鑒定Mx基因的表達(dá)(附圖5)。
引物序列如下上游引物(Mx-F)5’-ACATGTCTCCAAGCACTTCTT-3’下游引物(Mx-R)5’-TATTGACTGTTCTGACCACCG-35.3干擾素蛋白的抗病毒活性測定5.3.1在魚類細(xì)胞水平的抗病毒活性測定采用半數(shù)細(xì)胞病變抑制(CPEI50)法進(jìn)行，草魚ZC7901和CP80胚胎細(xì)胞株，經(jīng)不同稀釋度的干擾素蛋白作用后，分別加入100TCID50草魚出血病病毒GCHV和草魚小RNA病毒(GCPV)攻擊，以能抑制50％細(xì)胞病變的最高稀釋度為一個(gè)干擾素活性單位，用Log2CPEI50/0.1ml表示。結(jié)果如表2所示。
表2.GcIFN在ZC7901和CP80細(xì)胞中的活性測定

*用100TCID50GCHV(TCID50＝105.8/0.1ml)和GCPV(TCID50＝105.2/0.1ml)進(jìn)行感染**IFN滴度Log2CPEI50/0.1ml，(X±SD)，n＝55.3.2魚體水平的抗病毒活性測定5.3.2.1通過注射途徑給予干擾素的抗病試驗(yàn)一齡草魚(10～12cm長)，背鰭皮下注射IFN蛋白，0.1ml(10μg)/尾，12小時(shí)后人工感染GCHV(500TCID50)/尾，28℃水溫飼養(yǎng)2周，統(tǒng)計(jì)發(fā)病死亡率，計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率(Relative Percent Survival，RPS)，RPS＝(1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)×100％，對(duì)照組注射空白PBS液。結(jié)果如表3所示，IFN通過注射方式，有明顯的抗病效果，其注射組的成活率比對(duì)照組提高47.68％，免疫保護(hù)率達(dá)到59.42％。
表3.魚體注射GcIFN的抗病試驗(yàn)結(jié)果

5.3.2.2通過飼喂途徑給予干擾素的抗病試驗(yàn)一齡草魚飼喂含有干擾素的飼料(每公斤飼料添加GcIFN工程菌粉33mg，干擾素蛋白在酵母中的表達(dá)量30％，即10mg GcIFN/Kg飼料)，連續(xù)飼喂1周，人工感染GCHV 0.1ml(500TCID50)/尾，28℃水溫飼養(yǎng)2周，統(tǒng)計(jì)發(fā)病死亡率，計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率。對(duì)照組飼喂不含干擾素的正常飼料。結(jié)果如表4所示，通過飼喂方式，也有明顯的抗病效果，其試驗(yàn)組的成活率比對(duì)照組提高23.92％，免疫保護(hù)率達(dá)到29.58％。
表4.魚體飼喂含GcIFN飼料的抗病試驗(yàn)結(jié)果


5.3.3草魚干擾素的蝦類抗病毒活性試驗(yàn)采用餌料添加方式進(jìn)行試驗(yàn)，將表達(dá)草魚干擾素的酵母菌粉添加入配合餌料，餌料中干擾素含量為10mg GcIFN/Kg餌料，實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦分別采用中國對(duì)蝦和南美白對(duì)蝦。實(shí)驗(yàn)分5組，每組100尾，對(duì)照組飼喂不含干擾素的正常餌料。每天飼喂2次，連續(xù)飼喂7天，然后人工感染白斑綜合癥病毒(WSSV)。病毒感染采用投喂毒餌的方法進(jìn)行，每天早晚各一次，連續(xù)投喂3天，維持水溫20～25℃，1周后統(tǒng)計(jì)發(fā)病死亡率，計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率RPS。結(jié)果如表5所示，草魚IFN對(duì)兩種蝦類有明顯的免疫抗病效果，試驗(yàn)組的免疫保護(hù)率分別達(dá)到11.60％和10.40％。
表5.草魚干擾素對(duì)南美白對(duì)蝦和中國對(duì)蝦的抗病試驗(yàn)


5.4干擾素的免疫調(diào)節(jié)功能測定5.4.1草魚干擾素對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用采用34％-51％Percoll密度梯度離心技術(shù)分離草魚頭腎巨噬細(xì)胞，在L-15培養(yǎng)液(含5％FCS、10％青霉素/鏈霉素)中27℃培養(yǎng)12小時(shí)，PBS清洗，2％臺(tái)盼蘭抽樣染色，當(dāng)活細(xì)胞量達(dá)98％以上時(shí)，加入500U/ml干擾素作用24小時(shí)，經(jīng)PBS清洗3次后分別加入終濃度為105個(gè)/ml、104個(gè)/ml、103個(gè)/ml和102個(gè)/ml酵母菌，27℃培養(yǎng)0、3和5小時(shí)，測定酵母菌的MTT顯色反應(yīng)和巨噬細(xì)胞殺菌指數(shù)(KI)，同時(shí)設(shè)不加干擾素處理組作為對(duì)照。
結(jié)果表明，經(jīng)干擾素激活后的巨噬細(xì)胞對(duì)酵母菌的吞噬和殺滅作用需要一個(gè)合適的作用時(shí)間，同時(shí)還需要巨噬細(xì)胞與酵母間有一個(gè)適當(dāng)?shù)谋壤?。?05個(gè)左右巨噬細(xì)胞中接入105或104個(gè)酵母，并作用5小時(shí)后，所剩余的活酵母量與未經(jīng)干擾素激活的巨噬細(xì)胞相比明顯減少，殺菌力極顯著地增強(qiáng)(見表6)。
表6.干擾素對(duì)草魚巨噬細(xì)胞殺菌力的調(diào)節(jié)作用


P＜0.01 t檢驗(yàn)，與不加GcIFN的對(duì)照組比較，括號(hào)內(nèi)為KI值(X±SE，n＝5)5.4.2干擾素對(duì)T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)作用5.4.2.1干擾素對(duì)有絲分裂原PHA和ConA轉(zhuǎn)化的T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用采用ficoll密度梯度離心法分離外周血和頭腎白細(xì)胞，經(jīng)干擾素處理后分別加入終濃度為0.64mg/ml PHA和25mg/ml ConA，27℃培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行3H-TdR標(biāo)記(比度20Ci/mmol，濃度1mCi/ml，標(biāo)記終濃度2μCi/ml)標(biāo)記細(xì)胞，然后用TRI-CARB 2050 CA型液體閃爍儀測定樣品的每分鐘脈沖數(shù)(CPM)。
結(jié)果顯示，干擾素對(duì)PHA和ConA轉(zhuǎn)化外周血和頭腎T淋巴細(xì)胞有明顯的調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)在低濃度處理時(shí)，有顯著的促進(jìn)作用，而高濃度處理時(shí)，則有顯著的抑制作用。干擾素促進(jìn)PHA和ConA轉(zhuǎn)化T淋巴細(xì)胞的劑量分別為500U/ml和250～500U/ml，抑制T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的劑量為5000U/ml，促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)化的時(shí)間均為12小時(shí)以上(見表7)。
表7.干擾素對(duì)PHA和ConA刺激的T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用


*0.01＜P＜0.05，**P＜0.01 t檢驗(yàn)(X±SE，n＝5)5.4.2.2干擾素對(duì)有絲分裂原LPS和SPA轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用外周血和頭腎白細(xì)胞經(jīng)干擾素處理后分別加入終濃度為125mg/ml LPS和250mg/ml SPA，27℃培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行3H-TdR標(biāo)記(比度20Ci/mmol，濃度1mCi/ml，標(biāo)記終濃度2μCi/ml)標(biāo)記細(xì)胞，然后用TRI-CARB 2050CA型液體閃爍儀測定樣品的每分鐘脈沖數(shù)(CPM)。
結(jié)果表明，干擾素調(diào)節(jié)SPA和LPS轉(zhuǎn)化外周血和頭腎B淋巴細(xì)胞的規(guī)律與調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞相類似，也表現(xiàn)為低濃度產(chǎn)生促進(jìn)作用，而高濃度產(chǎn)生抑制作用。產(chǎn)生促進(jìn)作用的劑量為50～500U/ml，時(shí)間為12h以上，而產(chǎn)生抑制作用的劑量為5000U/ml，時(shí)間為24小時(shí)以上(見表8)。
表8.干擾素對(duì)LPS和SPA刺激的B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)作用


*0.01＜P＜0.05，**P＜0.01 t檢驗(yàn)(X±SE，n＝5)實(shí)施例6、表達(dá)草魚干擾素的酵母工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)與抗病飼料添加劑的研制工程菌用10L發(fā)酵罐進(jìn)行小規(guī)模發(fā)酵，挑取單菌落種子工程菌，加入200ml含2％棉籽糖的SC-U培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)過夜；取培養(yǎng)物測OD600值，計(jì)算在10L發(fā)酵培養(yǎng)基中所需接種的培養(yǎng)物量，按發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基初始OD值需達(dá)到0.4的劑量，4℃ 1500g離心收集細(xì)胞，用適量發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮后，接種入發(fā)酵罐中，30℃發(fā)酵培養(yǎng)12～14小時(shí)。發(fā)酵后酵母細(xì)胞采用離心法(5000rpm，20min)沉淀收集，15～25kHz超聲破碎，25～30℃氣流干燥，制成酵母菌粉。取適量菌粉，加入SDS-PAGE樣品緩沖液，用SDS-PAGE電泳法分離酵母菌粉中的干擾素蛋白，方法同前。用薄層掃描法測定干擾素在酵母細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量，按每公斤魚(蝦)人工配合飼料含10mg GcIFN的劑量，添加含GcIFN的酵母工程菌粉(干擾素蛋白在酵母中的表達(dá)量一般可達(dá)到30％，則在每公斤魚(蝦)人工配合飼料中添加33mg酵母菌粉)。
實(shí)施例7、草魚干擾素在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的抗病試驗(yàn)1、對(duì)養(yǎng)殖魚類的抗病試驗(yàn)試驗(yàn)在6～9月份進(jìn)行，將養(yǎng)殖草魚和鱸魚的網(wǎng)箱分別分成8組，其中5組網(wǎng)箱為試驗(yàn)組，3組為對(duì)照組，使用含干擾素的飼料(每公斤飼料添加實(shí)施例5中制備的GcIFN工程菌粉33mg，干擾素蛋白在酵母中的表達(dá)量30％，10mgGcIFN/Kg飼料)投喂，連續(xù)投喂4周，統(tǒng)計(jì)自然發(fā)病死亡率，計(jì)算免疫保護(hù)率RPS。結(jié)果如表9和10所示，使用含干擾素飼料的實(shí)驗(yàn)組，成活率均明顯提高，免疫保護(hù)率分別達(dá)到62.39％和48.61％，表明IFN能明顯提高不同魚類的免疫抗病能力。
表9 養(yǎng)殖草魚抗病試驗(yàn)效果表

表10 養(yǎng)殖鱸魚抗病試驗(yàn)效果表


2、對(duì)養(yǎng)殖蝦類的抗病試驗(yàn)試驗(yàn)在6～9月份進(jìn)行。將養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦和中國對(duì)蝦的網(wǎng)箱分別分成8組，其中5組網(wǎng)箱為試驗(yàn)組，3組為對(duì)照組，使用含干擾素的餌料(每公斤飼料添加實(shí)施例5中制備的工程菌粉33mg，干擾素蛋白在酵母中的表達(dá)量30％，10mgGcIFN/Kg飼料)投喂，連續(xù)投喂4周，統(tǒng)計(jì)自然發(fā)病死亡率，計(jì)算免疫保護(hù)率RPS。結(jié)果如表11和12所示，使用含干擾素飼料的實(shí)驗(yàn)組，成活率均明顯提高，免疫保護(hù)率分別達(dá)到30.80％和20.99％，表明IFN能提高不同蝦類的免疫抗病能力。
表11 養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦抗病試驗(yàn)效果表


表12 養(yǎng)殖中國對(duì)蝦抗病試驗(yàn)效果表

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表SEQ ID NO.1cagtgtagaa agctactact acctgaatac aaagatgaaa actcaaatgt ggacgtatat60gtttgtaatg tttttaactc tgcagggtca atgctctgct tgcgaatggc tcggccgata120caggatgata agcaacgagt ctttgagcct cctgaaggaa atgggtggaa aatatcctga180gggtaccaag gtgtcatttc caggacgcct gtacaacatg atagacaatg ccaaggtgga240ggaccaggtg aagtttcttg tcctgacctt agatcatatc atccgcctca tggatgccag300agagcacatg aattcagtgc agtggaacct acagactgta gagcattttc taactgtcct360gaacaggcag tcatctgatc ttaaagaatg tgtggcccga taccagccat cacataagga420gtcctacgag aaaaagataa acagacactt caagatttta aagaagaatc taaagaaaaa480agaatatagt gctcaagcat gggagcagat ccggagagct gtgaaacatc accttcagag540gatggacatc atcgcaagca ttgccaacag acgataagac ataatgacgg atgaatgact600tgtgacacat tccatggagt gaagaaaagt taatgtaaac aatgccttaa aagctaaaac660tgaatgtaac aaatatttat ttacatgact gtattttatt tcaactagag ttgaaagttt720tgcctaatgt ctggtgttgt aatatagagt ttaccttatg tgtttcctat gaaaacttga780agtaatctga tcaagcaagc taattatgtt tcttacaaaa acctgagaaa ccttgtattt840attttatttt ggtgcaaata ggcctatgtg cctaaactat acccagattt tttgctgaat900gtgaaaaaaa tgtttaaaaa aacaagcatg ccatgtattt caagtcatgt atttattaac960ggtcaatcaa ttatgttgtg atgcacatgg atatgatgta tgttttgtga ttgtttcaga1020tatttattat acttaattta cttcatacat tgttgtgcac aatttttgta tctctgaata1080ttttattctt tttatatgta ctgaatgctt gcgataatga tttgctctat ttgcttgcaa1140aatatttttg tacttttaaa taagaaattg attgaaaaaa aacaaaaaaa agtcgtgact1200gaaaaaacaa 1210
權(quán)利要求
1.一種含有草魚干擾素基因的重組質(zhì)粒，其特征在于該基因具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。
2.一種工程菌，其特征在于該菌株INVSC1-pYES2-IFN為釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日2006年10月19日，保藏號(hào)CGMCC1847。
3.如權(quán)利要求2所述的工程菌在水產(chǎn)動(dòng)物抗病毒中的應(yīng)用。
4.一種蛋白質(zhì)在水產(chǎn)動(dòng)物抗病毒中的應(yīng)用，其特征在于該蛋白質(zhì)為具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的草魚干擾素基因所編碼。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有草魚干擾素基因的重組質(zhì)粒，該基因具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還公開了一種工程菌，該菌株INVSC1－pYES2－IFN為釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日2006年10月19日，保藏號(hào)CGMCC1847。該工程菌能應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物抗病毒。本發(fā)明還公開了一種蛋白質(zhì)在水產(chǎn)動(dòng)物抗病毒中的應(yīng)用，該蛋白質(zhì)為具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的草魚干擾素基因所編碼。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1974775SQ200610155119
公開日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月8日
發(fā)明者邵健忠, 胡向東, 項(xiàng)黎新, 彭博, 林慧芳 申請(qǐng)人:浙江大學(xué), 浙江皇冠科技有限公司