專利名稱：一種用高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種固定化脂肪酶的方法。
背景技術：
脂肪酶是一種廣泛分布于動物、植物和微生物中的酶，能夠進行可逆的甘油酯鍵水解或合成。在一定的條件下，脂肪酶可以主要催化合成反應，即可以用來合成生物柴油。 無論在小規(guī)模的實驗還是工業(yè)規(guī)模的酯合成中，作為催化劑，脂肪酶已經得到成功應用。固定化酶技術，就是將酶結合在載體上，或將其限制在有限空間內的一類技術，酶仍能進行相應催化活性，并方便回收利用。一般將酶的固定化技術分為酶與載體的結合和包埋兩大類。 其中結合法包括物理吸附、離子吸附、共價鍵結合及交聯(lián)法等。固定化方法是否成功很大方面取決于選擇合適的載體。固定化載體的選擇主要考慮是否擁有固定化所需的最佳性能，如機械強度、穩(wěn)定性、親水疏水性、孔隙度、反應性、再生性及經濟性等方面。常用的載體主要有微晶纖維素、硅藻土、硅膠等。而以膜為載體，不僅結合了膜的分離功能，還結合了載體功能和分隔功能，具有其他載體不可比擬的優(yōu)點。

發(fā)明內容
本發(fā)明是針對自然酶混溶在反應體系中不僅不易分離回收，而且酶的制取一般較困難，且成本高昂，難以反復或連續(xù)使用等問題，而提出的用高碘酸鈉氧化法來進行固定化脂肪酶的方法。用高碘酸鈉氧化法來進行固定化脂肪酶的方法通過以下步驟實現(xiàn)一、高碘酸鈉的氧化活化。二、脂肪酶的固定化。三、酶活力的測定。四、固定化條件的優(yōu)化。五、響應面法優(yōu)化固定化條件。六、固定化酶酶學性質的討論。利用高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶中，高碘酸鈉具有將濾紙表面的羥基氧化成醛基的作用，根據醛基含量越高，與酶的交聯(lián)率越大的特性固定化脂肪酶，提高了酶在反應體系中的活性和穩(wěn)定性，調節(jié)和控制酶的活性與選擇性，從而有利于酶的回收，最終得到的固定化酶活為0. 52U/cm2，所得到的固定化酶的活力較常規(guī)固定化方法有所提高。
具體實施例方式具體實施方式
一用高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶的方法通過以下步驟實現(xiàn) 一、高碘酸鈉的氧化活化取一張膜懸浮于IOml不同濃度的高碘酸鈉溶液中，室溫下置于搖床中搖動一定時間，取出立即用去離子水洗至中性，吸干水分；二、脂肪酶的固定化取若干份Icm2的纖維素膜于平皿中，分別與一定量的酶液和pH為8. 0的磷酸鹽緩沖液，加入一定量戊二醛于進行交聯(lián)反應，交聯(lián)反應結束后懸浮于IOml 氫硼化鈉溶液中于 4V反應30min，然后用0. Imol的HAI溶液、2mol的Kcl溶液和水分別洗滌三次，取出測定酶活；三、酶活力的測定橄欖油乳化法，測定固定化酶酶活時將已固定化酶的濾紙剪碎， 平均分成兩份，其中一份做空白；四、固定化條件的優(yōu)化分別在高碘酸鈉濃度為0. 05 0. 30mol/L，活化時間10 lOOmin，溫度5 !35°C，酶液濃度0. 01 0. 25g/10mL，交聯(lián)時
4間1 6h，交聯(lián)劑濃度0. 05 0. 6%的條件下，通過測定固定化酶活力得到最佳的固定化條件。五、通過響應面尋優(yōu)得到最佳的固定化條件，在最佳的固定化條件下測得酶活力為最優(yōu)0. 5U/cm2六、固定化酶酶學性質的討論在溫度15 55°C，PH4 10范圍內，通過測定固定化酶和游離酶的活力，得出固定化酶的最適溫度，最適PH值。并通過比較確定固定化酶較游離酶穩(wěn)定性好。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復合膜在高碘酸鈉濃度為0. 01 0. 25mol/L，活化時間10 IOOmin的條件下進行脂肪酶的交聯(lián)固定。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復合膜在高碘酸鈉濃度為0. 01 0. 25mol/L,活化時間30 90min的條件下進行脂肪酶的交聯(lián)固定。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復合膜在高碘酸鈉濃度為0. 01 0. 25mol/L,活化時間30 90min，酶液在溫度15 30°C的條件下，進行脂肪酶的交聯(lián)固定，其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復合膜在高碘酸鈉濃度為0. 01 0. 25mol/L,活化時間30 90min，酶液在溫度15 30°C的條件下，添加濃度為0. 01 0. 2g/10mL的酶液。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復合膜在高碘酸鈉濃度為0. 01 0. 25mol/L,活化時間30 90min，酶液在溫度15 30°C，添加濃度為0. 01 0. 2g/10mL的酶液，與戊二醛交聯(lián)劑濃度0. 1 0. 5% 的條件下交聯(lián)固定，其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復合膜在高碘酸鈉濃度為0. 01 0. 25mol/L,活化時間30 90min，酶液在溫度15 30°C，添加濃度為0. 01 0. 2g/10mL的酶液，與戊二醛交聯(lián)劑濃度0. 1 0. 5% 的條件下交聯(lián)固定2 證。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟五中將由單因素確定的結果再進一步優(yōu)化得到固定化條件，優(yōu)化的固定化條件為交聯(lián)時間2 4h，交聯(lián)劑濃度0. 2 0. 4%，酶液濃度0. 1 0. 2g/10mL，在最優(yōu)狀態(tài)下酶活力最高0. 52U/cm2。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟六中將固定化酶與游離酶在溫度25 45°C條件下，比較固定化酶與游離酶的最適溫度。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟六中將固定化酶與游離酶在PH7 9. 5條件下，比較固定化酶與游離酶的最適PH值。其它步驟與具體實施方式
一相同。
權利要求
1.一種用高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶的方法，其特征在于用高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶的方法通過以下步驟實現(xiàn)一、高碘酸鈉的氧化活化取一張膜懸浮于IOml不同濃度的高碘酸鈉溶液中，室溫下置于搖床中搖動一定時間，取出立即用去離子水洗至中性，吸干水分；二、脂肪酶的固定化取若干份Icm2的纖維素膜于平皿中，分別與一定量的酶液和 PH為5. 8的磷酸鹽緩沖液，加入一定量戊二醛于進行交聯(lián)反應，交聯(lián)反應結束后懸浮于IOml 氫硼化鈉溶液中于4°C反應30min，然后用0. Imol的HAI溶液、2mol的Kcl溶液和水分別洗滌三次，取出測定酶活；三、酶活力的測定測定固定化酶酶活時將已固定化酶的濾紙剪碎，平均分成兩份，其中一份做空白；四、固定化條件的優(yōu)化分別在高碘酸鈉濃度為0. 01 0. 3mol/L，活化時間30 lOOmin，溫度5 ;35°C，酶液濃度0. 01 0. 2g/10mL, 交聯(lián)時間1 6h，交聯(lián)劑濃度0. 05 0. 6%的條件下，通過測定固定化酶活力得到最佳的固定化條件。五、通過響應面尋優(yōu)得到最佳的固定化條件，在最佳的固定化條件下測得酶活力為最優(yōu)0. 5U/cm2。六、固定化酶酶學性質的討論在溫度15 55°C，PH5. 5 9. 5范圍內，通過測定固定化酶和游離酶的活力，得出固定化酶的最適溫度，最適PH值。并通過比較確定固定化酶較游離酶穩(wěn)定性好。
2.根據權利要求1所述的用高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復合膜與酶液在高碘酸鈉濃度為0. 02 0. 3mol/L,活化時間30 IOOmin的條件下進行脂肪酶的固定。
3.根據權利要求1所述的用高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復合膜與酶液在高碘酸鈉濃度為0. 01 0. 3mol/L,活化時間50 90min 的條件下，進行脂肪酶的固定。
4.根據權利要求1所述的用高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復合膜與酶液在高碘酸鈉濃度為0. 01 0. 3mol/L,活化時間30 lOOmin，溫度為20 30°C的條件下，進行脂肪酶的固定。
5.根據權利要求1所述的用高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復合膜與酶液在高碘酸鈉濃度為0. 01 0. 3mol/L,活化時間30 lOOmin，溫度為5 35°C，添加酶液濃度0. 03 0. 2g/10mL的條件下，進行脂肪酶的固定。
6.根據權利要求1所述的用高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復合膜與酶液在高碘酸鈉濃度為0. 01 0. 3mol/L,活化時間30 lOOmin，溫度為5 35°C，酶液濃度0. 03 0. 2g/10mL與交聯(lián)劑濃度為0. 2 0. 5%的條件下，進行脂肪酶的固定。
7.根據權利要求1所述的用高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚丙烯復合膜與酶液在高碘酸鈉濃度為0. 01 0. 3mol/L,活化時間30 lOOmin，溫度為5 35°C，酶液濃度0. 03 0. 2g/10mL與交聯(lián)劑濃度為0. 2 0. 5%的條件下交聯(lián)2 證，進行脂肪酶的固定。
8.根據權利要求1所述的用高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步驟五中將固定化條件進行進一步優(yōu)化，優(yōu)化結果為交聯(lián)時間2 4h，交聯(lián)劑濃度0. 2 0. 4%，酶液濃度0. 1 0. 2g/10mL，用優(yōu)化結果進行脂肪酶的固定。
9.根據權利要求1所述的用高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步驟六中將固定化酶與游離酶在溫度25 45°C條件下，比較固定化酶與游離酶的最適溫度。
10.根據權利要求1所述的用高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶，其特征在于步驟六中固定化酶與游離酶在PH7 9. 5條件下，比較固定化酶與游離酶的最適PH值。
全文摘要
一種用高碘酸鈉氧化法固定化脂肪酶的方法。本發(fā)明提供一種以醋酸纖維素/聚丙烯復合膜為載體，采用氧化劑高碘酸鈉氧化法和交聯(lián)反應相結合的固定化方法，用該氧化后的醋酸纖維素/聚丙烯復合膜固定化脂肪酶。研究了高碘酸鈉濃度、活化時間、酶液濃度、交聯(lián)時間和交聯(lián)劑濃度等不同固定化條件對脂肪酶固定化后酶活力的影響，通過響應面優(yōu)化法，進一步優(yōu)化了經高碘酸鈉氧化后的醋酸纖維素/聚丙烯復合膜固定化脂肪酶的優(yōu)勢。采用先對醋酸纖維素/聚丙烯復合膜進行氧化活化，再進一步進行脂肪酶的固定化，使脂肪酶與載體結合的更穩(wěn)定，不易溶脫，而利于固定化酶的回收利用。最終得到的固定化酶活為0.52U/cm2。
文檔編號C12N11/14GK102363776SQ20111029003
公開日2012年2月29日 申請日期2011年9月20日 優(yōu)先權日2011年9月20日
發(fā)明者于殿宇, 劉晶, 周曉丹, 常云鶴, 張佳寧, 張立國, 李志平, 李越, 梁單瓊, 王立琦, 王雪, 陳曉慧 申請人:東北農業(yè)大學