專利名稱：作物種子脂肪酶活性快速檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種種子中脂肪酶活性的檢測方法。
背景技術：
脂肪酶(E.C.3.1.1.3)是一種甘油酯水解酶，可以水解脂肪分子中的甘油酯鍵，將脂肪(甘油三酯)水解為甘油及游離脂肪酸，是脂肪分解代謝中第一個參與反應的酶，所以一般認為是脂肪水解的調速酶，對脂肪的轉化速率起著調控作用。其催化反應如下
脂肪酶廣泛存在于動、植物及微生物中，對其脂類的消化和吸收過程中起重要作用。作物種子中的脂肪酶，其專一性不強，凡是由醇及有機酸構成的酯和脂肪都能被其分解或合成，不過不能作用得很完全。脂肪經水解后同樣生成甘油和游離脂肪酸。
以水稻為例，稻谷中脂類含量約為3％，85％分布在稻谷的種皮和胚中。稻谷脂肪極易受儲藏影響。稻谷在氧氣及高溫條件下儲藏以后，脂肪極易發(fā)生水解、氧化，致使稻谷品質劣變。稻谷脂類的變化被認為是導致稻谷陳化的最主要因素。稻谷脂肪酶則是稻谷儲藏過程中脂肪酸敗變質的主要原因之一。隨著稻谷的儲藏，脂肪的分解，游離脂肪酸含量增加，脂肪酸組成發(fā)生變化，嚴重影響了稻谷的食用品質和營養(yǎng)品質。
長期以來，稻谷種子脂類與陳化的研究始終受到人們的關注，但對水稻脂肪酶的研究僅局限于米糠穩(wěn)定化和大米風味營養(yǎng)的問題，而對水稻等作物種子脂肪酶與其儲藏陳化變質的關系研究甚少。對于脂肪酶的檢測，目前，還沒有公認的統(tǒng)一的測定方法。通常的脂肪酶檢測方法大致有堿滴定方法或用分光光度法兩類。
堿滴定方法原理脂肪在脂肪酶的作用下產生游離脂肪酸，再利用酸堿中和反應使酸堿指示劑終點變色。缺點該方法只能用于大量整粒材料粉碎，且必須離心取上清，才能加底物反應，該方法的穩(wěn)定性易受pH緩沖液，耗堿體積小及指示劑終點變色不明顯影響。
分光光度法原理脂肪在脂肪酶的作用下產生游離脂肪酸，再利用脂肪酸與銅離子形成銅皂，經萃取后進行比色測定。缺點該方法也只能用于大量整粒材料粉碎，且必須離心取上清，才能加底物反應。在測定時，乳化體系、底物、體系的pH條件、溫度、反應時間和穩(wěn)定時間的變化，可能會使測定結果差別較大。另外，象PVA的聚合度、乳化液制備時的攪拌速度、體系的離子強度及終止劑的不同等也會影響測定結果，并且由于反應過程的復雜性，還會帶進許多隨機誤差，難以確保測定的精密度。

發(fā)明內容
本發(fā)明的測定水稻等作物種子脂肪酶的酶活的快速檢測方法主要原理在給定時間內，脂肪酶酶活大小與其催化水解生成的脂肪酸的物質的量成正比?？衫弥久阜磻w系生成的脂肪酸的量的多少在有機溶劑中顯色呈現(xiàn)深淺不同而得到區(qū)分。定量可用堿滴定方法或用分光光度計來測定脂肪酸的含量(脂肪酸與銅離子形成銅皂，經萃取后進行比色測定，銅皂在715nm附近有一寬的吸收峰)。
本發(fā)明的技術方案如下作物種子脂肪酶活性快速檢測方法，包括以下步驟(1)、取種子中的脂肪酶富集部位，用Tris-HCl緩沖液配制粗酶液；(2)、配制由橄欖油和異辛烷組成的底物乳化液；(3)、配制乙酸銅指示劑；(4)、底物乳化液在35℃下預熱后，加入粗酶液、CaCl2溶液、NaCl溶液、Tris-HCl緩沖液，35℃水浴下攪拌至劇烈震蕩，反應完畢后，加入HCl溶液，加熱至沸騰，冷卻后加異辛烷，再將溶液劇烈震蕩混勻，靜置后，觀察顏色深淺，深則表示脂肪酶活性高，淺則表示脂肪酶缺失。
所述的檢測方法，其特征在于具體包括以下步驟(1)、取稻胚5～20粒或玉米胚1～2粒，或雙子葉作物大豆、花生的種子子葉10～20mg，放入研缽中，加入1ml PH7.5 Tris-HCl緩沖液，充分研磨后，即為粗酶液；
(2)、底物乳化液的配制將橄欖油和異辛烷按2∶3體積比混合，經高速攪拌均質化，得到底物乳化液；(3)、銅指示劑的配制稱取5g乙酸銅，溶解于100ml蒸餾水中，過濾，用吡啶將濾液的PH值調至6.1，得到銅指示劑；(4)、粗酶活力測定將5ml底物乳化液在35℃下預熱后，加入1ml粗酶液、1ml 0.005mol/lCaCl2、1ml 0.5mol/l NaCl、5ml PH7.5 Tris-HCl緩沖液，35℃水浴下劇烈震蕩攪拌30min；反應完畢后加入2ml 6mol/l HCl，加熱至沸騰5min，冷卻后加入5ml異辛烷，再將溶液劇烈震蕩混勻，靜置后，觀察顏色深淺，深則表示脂肪酶活性高，淺則表示脂肪酶缺失。
精確測定上述第(4)步得到的溶液中，取上層異辛烷溶液2.5ml，(1)、加入1ml銅指示劑，取上層溶液，在715nm處測定其吸光度，以1ml PH7.5 Tris-HCl緩沖液代替粗酶液作空白；(2)、或置于干燥的錐形瓶中以酚酞作指示劑用0.025mol/1KOH乙醇溶液滴定生成的脂肪酸，在上述反應條件下，將每分鐘催化產生1μmol脂肪酸所需的酶量定義為1個活力單位(U)。
本發(fā)明的快速檢測方法優(yōu)點①、能直接取稻胚等作物種子胚作材料，用量少，無需整粒種子，無需離心。
②、能利用脂肪酸的含量不同在有機溶劑中顯色呈現(xiàn)深淺不同而得到區(qū)分，這樣做具有過程簡單、快速、穩(wěn)定性好、結果準確等特點。因為提供脂肪酶存在和缺失的陰、陽對照，對結果判別一目了然。用于選育種子脂肪酶缺失和脂肪酶抑制酶活性高的水稻等作物品種，可從根本上解決稻谷陳化變質的問題。
③、不需復雜的實驗條件和高精密的試驗儀器。易于制成試劑盒，便于攜帶和推廣。對使用者來說，不要求較高的文化，步驟簡單，并可根據(jù)對照進行結果判斷，易于操作；④、本快速顯色方法也可用堿滴定方法或用分光光度計進行定量。
⑤、本快速顯色方法也可用于其它作物如大豆、玉米、油菜、花生等種子脂肪酶活性檢測。
本發(fā)明的快速檢測方法用途①、可供農作物育種者在選擇脂肪酶缺失和脂肪酶抑制酶活性高的材料、品系、品種中，根據(jù)脂肪酶酶活性有無判斷脂肪酶或脂肪酶抑制酶基因的表達情況，決定該材料的利用價值。
②、糧食部門(特別是國家、地方、部隊專用糧貯備庫)中長期種子庫、農民貯糧大戶作為檢測其耐貯藏性，加工品質的依據(jù)。
③、種子部門作為品種儲藏特性鑒定的指標之一。
④、食品、醫(yī)藥行業(yè)作為原料質量標準之一。
具體實施例方式
一、粗酶的提取取稻胚5～20粒(玉米胚則取1～2粒，雙子葉作物大豆、花生等取種子子葉10～20mg)放入研缽中，加入lml PH7.5 Tris-HCl緩沖液，充分研磨后，即為粗酶液。
二、底物乳化液的配制將橄欖油和異辛烷按2∶3(V/V)混合，經高速攪拌均質化，得到底物乳化液。
三、銅指示劑的配制稱取5g乙酸銅，溶解于100ml蒸餾水中，過濾，用吡啶將濾液的PH值調至6.1，得到銅指示劑。
四、粗酶活力測定將5ml底物乳化液在35℃下預熱后，加入lml粗酶液、lml 0.005mol/l CaCl2、lml 0.5mol/l NaCl、5ml PH7.5 Tris-HCl緩沖液，35℃水浴下攪拌30min(劇烈震蕩)。反應完畢后加入2ml 6mol/l HCl，加熱至沸騰5min，冷卻后加入5ml異辛烷，再將溶液混勻(劇烈震蕩)，靜置后，觀察顏色深淺。深則表示脂肪酶活性高，淺則表示脂肪酶缺失。
定量時，取上層異辛烷溶液2.5ml，①加入1ml銅指示劑，取上層溶液，在715nm處測定其吸光度。以1ml PH7.5 Tris-HCl緩沖液代替粗酶液作空白對照；②或取上層異辛烷溶液置于干燥的錐形瓶中以酚酞作指示劑用0.025mol/IKOH乙醇溶液滴定生成的脂肪酸，在上述反應條件下，將每分鐘催化產生1μmol脂肪酸所需的酶量定義為1個活力單位(U)。
權利要求
1.作物種子脂肪酶活性快速檢測方法，包括以下步驟(1)、取種子中的脂肪酶富集部位，用Tris-HCl緩沖液配制粗酶液；(2)、配制由橄欖油和異辛烷組成的底物乳化液；(3)、配制乙酸銅指示劑；(4)、底物乳化液在35℃下預熱后，加入粗酶液、CaCl2溶液、NaCl溶液、Tris-HCl緩沖液，35℃水浴下攪拌至劇烈震蕩，反應完畢后，加入HCl溶液，加熱至沸騰，冷卻后加異辛烷，再將溶液劇烈震蕩混勻，靜置后，觀察顏色深淺，深則表示脂肪酶活性高，淺則表示脂肪酶缺失。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)、取稻胚5～20粒或玉米胚1～2粒，或雙子葉作物大豆、花生的種子子葉10～20mg，放入研缽中，加入1ml PH7.5 Tris-HCl緩沖液，充分研磨后，即為粗酶液；(2)、底物乳化液的配制將橄欖油和異辛烷按2∶3體積比混合，經高速攪拌均質化，得到底物乳化液；(3)、銅指示劑的配制稱取5g乙酸銅，溶解于100ml蒸餾水中，過濾，用吡啶將濾液的PH值調至6.1，得到銅指示劑；(4)、粗酶活力測定將5ml底物乳化液在35℃下預熱后，加入1ml粗酶液、1ml 0.005mol/l CaCl2、1ml 0.5mol/l NaCl、5ml PH7.5 Tris-HCl緩沖液，35℃水浴下劇烈震蕩攪拌30min；反應完畢后加入2ml 6mol/l HCl，加熱至沸騰5min，冷卻后加入5ml異辛烷，再將溶液劇烈震蕩混勻，靜置后，觀察顏色深淺，深則表示脂肪酶活性高，淺則表示脂肪酶缺失。
3.根據(jù)權利要求2所述的檢測方法，其特征在于上述第(4)步得到的溶液中，取上層異辛烷溶液2.5ml，(1)、加入1ml銅指示劑，取上層溶液，在715nm處測定其吸光度，以1ml PH7.5 Tris-HCl緩沖液代替粗酶液作空白對照；(2)、或取上層異辛烷溶液置于干燥的錐形瓶中以酚酞作指示劑用0.025mol/lKOH乙醇溶液滴定生成的脂肪酸，在上述反應條件下，將每分鐘催化產生1μmol脂肪酸所需的酶量定義為1個活力單位(U)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種作物種子脂肪酶活性快速檢測方法，是選取種子的脂肪酶的富集部位，配制粗酶液，在底物乳化液及其它試劑中反應，然后加異辛烷進行顯色反應，并據(jù)此判定脂肪酶的活性。加乙酸銅指示劑，測量其吸光度，進行脂肪酶的量化測量。本發(fā)明方法也可用于水稻、大豆、玉米、油菜、花生等種子脂肪酶活性檢測?？晒┺r作物育種者在選擇脂肪酶缺失和脂肪酶抑制酶活性高的材料、品系、品種中，根據(jù)脂肪酶酶活性有無判斷脂肪酶或脂肪酶抑制酶基因的表達情況，決定該材料的利用價值。
文檔編號C12Q1/44GK1680587SQ200510037720
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月27日 優(yōu)先權日2005年1月27日
發(fā)明者張瑛, 吳躍進, 余增亮, 王鈺, 佘德紅, 宋美 申請人:中國科學院等離子體物理研究所