專利名稱：一種高效表達(dá)外源蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)外源蛋白的方法。
背景技術(shù)：
利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在生物反應(yīng)器中生產(chǎn)高附加值蛋白質(zhì)具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。生物反應(yīng)器經(jīng)歷了細(xì)菌基因工程、細(xì)胞基因工程、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器及轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器等四個(gè)階段。 細(xì)菌基因工程產(chǎn)物往往不具備生物活性，必須經(jīng)過糖基化、羥基化等一系列修飾加工后，才能成為有效的藥物，而細(xì)胞基因工程又因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件要求相當(dāng)苛刻，成本太高，限制了規(guī)模生產(chǎn)。動(dòng)物生物反應(yīng)器具有廣品質(zhì)量聞，容易提純的特點(diǎn)，彌補(bǔ)了其它各類基因表達(dá)系統(tǒng)的缺陷，但是其技術(shù)本身涉及道德倫理等問題，也限制了其大規(guī)模生產(chǎn)。轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器不僅彌補(bǔ)了上述反應(yīng)器的缺陷，而且更易于推廣，獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植物種系后，比較容易建立低成本的大規(guī)模生產(chǎn)系統(tǒng)，因而具有巨大的應(yīng)用前景。但是，在轉(zhuǎn)基因植物反應(yīng)器中，常常發(fā)生外源基因插入位點(diǎn)的不確定性和基因之間復(fù)雜的相互作用，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因作物發(fā)生代謝、發(fā)育、遺傳等方面的一系列變化，產(chǎn)生所謂的轉(zhuǎn)基因作物的非預(yù)期效應(yīng)。該效應(yīng)是轉(zhuǎn)基因作物安全性評價(jià)的重要內(nèi)容之一，但是常規(guī)的分析檢測手段卻往往難以準(zhǔn)確評價(jià)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效表達(dá)外源蛋白的方法。本發(fā)明提供的表達(dá)外源蛋白的方法，包括如下步驟(I)將所述外源蛋白的編碼基因插入pMYC2載體的多克隆位點(diǎn)，使所述外源蛋白的編碼基因和PMYC2載體上的6個(gè)MYC標(biāo)簽的編碼基因形成融合基因，得到重組質(zhì)粒；(2)將步驟(I)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，得到重組農(nóng)桿菌；(3)將步驟(2)的重組農(nóng)桿菌菌液注射煙草植株的葉片后繼續(xù)培育煙草植株；(4)取注射了重組農(nóng)桿菌菌液的煙草葉片，提取蛋白并進(jìn)行MYC親和純化，得到純化的外源蛋白。步驟(3)中，所述葉片可為新葉；所述新葉為生長30-35天的葉片。所述新葉優(yōu)選為生長32天的葉片。步驟(3)中，所述培育煙草植株的時(shí)間可為24至69小時(shí)，優(yōu)選為69小時(shí)。步驟(4)中，所述提取蛋白的方法可包括如下步驟將所述煙草葉片進(jìn)行液氮研磨，然后用蛋白提取液進(jìn)行提取，得到蛋白粗提液。所述蛋白提取液具體可為RB溶液；所述RB溶液的pH為7. 8，由溶質(zhì)和水組成；所述溶質(zhì)及其濃度如下50mM Tris, 50mM NaCl,10% (體積百分含量)甘油，0.1% (體積百分含量)Tween-20,0. 15% (體積百分含量)P -巰基乙醇，25mM咪唑。
步驟(4)中，所述MYC親和純化具體可包括如下步驟
①在MYC親和介質(zhì)中加入所述蛋白粗提液，4°C孵育Ih ；②清洗步驟①的MYC親和介質(zhì)；③在步驟②的MYC親和介質(zhì)中加入MYC肽溶液，4°C孵育10小時(shí)，然后離心取上清，即為含有純化的外源蛋白的溶液。步驟②中，可用所述RB溶液進(jìn)行所述清洗。 步驟③中，所述MYC肽溶液具體由MYC肽和所述RB溶液組成。所述MYC肽的在所述MYC肽溶液中的濃度可為IO-IOOii g/ml，優(yōu)選為50ii g/ml。所述農(nóng)桿菌具體可為農(nóng)桿菌菌株GV3101。所述煙草具體可為本生煙。所述外源蛋白具體可為序列表的序列2所不的蛋白質(zhì)。所述外源蛋白的編碼基因優(yōu)選為序列表的序列3所示的基因。本發(fā)明將外源蛋白基因克隆到pMYC2載體上，使其與pMYC2載體上的6個(gè)MYC標(biāo)簽的編碼基因形成融合基因，然后以煙草葉片為反應(yīng)器，利用農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化法在煙草葉片中瞬時(shí)高效的表達(dá)外源蛋白。然后，根據(jù)重組蛋白所帶有的MYC親和標(biāo)簽，利用帶有相應(yīng)標(biāo)簽抗體的親和介質(zhì)將煙草表達(dá)蛋白高效純化，最后再競爭洗脫親和介質(zhì)最終獲得純化后的目的蛋白。純化后蛋白具有生物活性，可用于進(jìn)一步的生物學(xué)功能研究。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)一步法純化蛋白，簡單快捷，而且蛋白純度較高。利用該方法所獲得的外源重組蛋白可用于生物安全評價(jià)和生物功能研究。


圖I為MYC-COIl表達(dá)檢測；1 :注射對照農(nóng)桿菌(空載體)的葉片；2 :注射侵染液的葉片3 :注射重組農(nóng)桿菌(pMYC-COIl)的葉片。圖2為轉(zhuǎn)化需要的最佳葉片狀態(tài)；1 :注射侵染液后的葉片(陰性對照)；2 :老葉中表達(dá)的蛋白；3 :中葉中表達(dá)的蛋白；4 :新葉中表達(dá)的蛋白。圖3為轉(zhuǎn)化后蛋白表達(dá)的最佳時(shí)間；1 :注射侵染液的葉片(陰性對照)；2 :轉(zhuǎn)染重組農(nóng)桿囷24小時(shí)后葉片表達(dá)的蛋白；3 :轉(zhuǎn)染重組農(nóng)桿囷32小時(shí)后葉片表達(dá)的蛋白；4 :轉(zhuǎn)染重組農(nóng)桿菌42小時(shí)后葉片表達(dá)的蛋白；5 :轉(zhuǎn)染重組農(nóng)桿菌52小時(shí)后葉片表達(dá)的蛋白；6 :轉(zhuǎn)染重組農(nóng)桿菌62小時(shí)后葉片表達(dá)的蛋白；7 :轉(zhuǎn)染重組農(nóng)桿菌69小時(shí)后葉片表達(dá)的蛋白。圖4為最適蛋白提取緩沖液的確定；I :緩沖液A提取的蛋白；2:緩沖液B提取的蛋白；3 :緩沖液C提取的蛋白；4 :RB緩沖液提取的蛋白；5 :緩沖液D提取的蛋白；6 :緩沖液E提取的蛋白；7 =TBS緩沖液提取的蛋白；8 =PBS緩沖液提取的蛋白。圖5為最適MYC肽競爭洗脫濃度的確定；I 10 u g/ml MYC肽洗脫的蛋白；2 50 u g/ml MYC肽洗脫的蛋白；3 100 u g/ml MYC肽洗脫的蛋白。圖6為JAZl-HIS蛋白洗脫圖譜；圖中的洗脫峰即為Ni柱親和層析中得到的JAZl-HIS 蛋白。圖7為MYC-COIl活性檢測；1 :蛋白粗提液(加入冠菌素的處理)；2 =MYC-COIl蛋白液(不加入冠菌素的處理)；3 =MYC-COIl蛋白液(加入冠菌素的處理)。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。COIl蛋白的氣基酸序列如序列表的序列2所不，其編碼基因如序列表的序列3所示。在模式植物擬南芥生長發(fā)育的過程中，F(xiàn)-box蛋白COIl具有非常重要的調(diào)控作用。但是研究中發(fā)現(xiàn)，COIl蛋白無法通過原核表達(dá)大量獲得純化蛋白。而通過本發(fā)明，我們能夠高效獲得純化的并具有生物活性的COIl蛋白，并進(jìn)行其功能研究。實(shí)施例中所用的擬南芥是購自ABRC (Arabidopsis Biological ResourceCenter)的哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，貨號(hào)為CS28166。 大腸桿菌DH5 a :購自NEB公司，貨號(hào)為C2987H。農(nóng)桿菌菌株GV3101 :公眾可以從清華大學(xué)獲得；參考文獻(xiàn)R. Berres etal. Transformation of vitis tissue by different strains of agrobacteriumtumefaciens containing the T_6b gene, Plant Cell Reports 11:192—195。本生煙(Nicotiana benthamiana):公眾可以從清華大學(xué)獲得；參考文獻(xiàn)Gianinna Brignet et al.Viral pathogenicity determinants are suppressors oftransgene silencing in Nicotiana benthamiana, The EMBO Journal 17 :6739_6746。pMYC2載體公眾可以從清華大學(xué)獲得；參考文獻(xiàn)Linghui Xu et al. TheSCF COIl Ubiquitin-Ligase Complexes are Required for Jasmonate Response inarabidopsis, Plant Cell 14 :1919-1939，2002 ;pMYC2 載體是將六個(gè)拷貝的 MYC 片段的編碼DNA (如序列表中序列I所示)，通過BamHI和SmaI酶切位點(diǎn)克隆到pBIN_pR0K2載體中得到的。MYC 親和介質(zhì)Sigma_aldrich,貨號(hào) a7470。MYC 肽Sigma-aldrich，貨號(hào) M2435。RB緩沖液(pH7. 8):由溶質(zhì)和水組成；溶質(zhì)及其濃度如下50mM Tris,50mM NaCl，10% (體積百分含量)甘油，0.1% (體積百分含量)Tween-20,0. 15% (體積百分含量)￠-巰基乙醇，25mM咪唑。緩沖液A :由50mM Tris-HCl (pH7. 4)緩沖液和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其濃度如下IOOmM NaCl, IOmM MgCl2, 5mM KCl，ImM DTT。緩沖液B :由50mM Tris-HCl (pH7. 4)緩沖液和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其濃度如下IOOmM NaCl，IOmM MgCl2, 5mM KCl，ImM DTT, 0. 1% (體積百分含量)Tween-20。緩沖液C :由50mM Tris-HCl (pH7. 4)緩沖液和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其濃度如下IOOmM NaCl，ImM DTT, 0. 1% (體積百分含量)Tween-20。緩沖液D :由50mM Tris-HCl (pH7. 4)緩沖液和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其濃度如下IOOmM NaCl,5mM KCl,ImM DTT。緩沖液E(pH7.8):由溶質(zhì)和水組成；溶質(zhì)及其濃度如下50mM Tris,50mM NaCl,0. 1% (體積百分含量)Tween-20,0. 15% (體積百分含量)P -巰基乙醇。
TBS緩沖液由50mM Tris-HCl (pH7. 4)緩沖液和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其濃度如下150mM NaCl。PBS 緩沖液136mM NaCl, 4. 3mM Na2HPO4, 2. 7mM KCl，I. 4mM KH2PO4, pH7. 4。緩沖液50 由50mM PBS緩沖液(pH7. 4)和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其濃度如下0. 5MNaCl，50mM 咪唑。緩沖液400 50mM PBS緩沖液(pH7. 4)和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其濃度如下0. 5MNaCl，400mM 咪唑。實(shí)施例I、重組表達(dá)載體和重組農(nóng)桿菌的構(gòu)建一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建
I、以擬南芥cDNA為模板，用Fl和Rl組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。Fl :5’ -TCCCCCGGGATGGAGGATCCTGATATCAAGA-3’ ；Rl :5’ -GGCGAGCTCTCATATTGGCTCCTTCAGGACTC-3’。PCR 擴(kuò)增程序95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 2min，共25個(gè)循環(huán)；72°C再延伸lOmin。2、用限制性內(nèi)切酶Small和SacI雙酶切步驟I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。3、用限制性內(nèi)切酶Small和SacI雙酶切步驟2的pMYC2載體，回收線性化的載體骨架(約Ilkbp)。4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架在T4連接酶的作用下16°C連接16h，得到連接產(chǎn)物。5、將步驟4的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，在含有50 U g/ml卡那霉素的平板上篩選陽性克隆。6、將步驟5的陽性克隆提取質(zhì)粒并測序，測序結(jié)果表明得到了重組質(zhì)粒PMYC2-C0I1。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pMYC2-C0Il進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在pMYC2載體的Small和SacI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列3所示DNA得到的重組質(zhì)粒(序列表的序列3所示的DNA編碼序列表的序列2所示的COIl蛋白)。重組質(zhì)粒pMYC2-C0Il中COIl蛋白的編碼基因和骨架載體上的6個(gè)MYC標(biāo)簽的編碼基因形成融合基因。二、重組農(nóng)桿菌的構(gòu)建I、將重組質(zhì)粒pMYC2-C0Il載體電激轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌菌株GV3101，28°C培養(yǎng)2_3天，得到重組農(nóng)桿菌。2、將重組農(nóng)桿菌劃線培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基(含50 ii g/ml卡那霉素、50 U g/ml慶大霉素和10 u g/ml利福平)平板上，28°C倒置培養(yǎng)2-3天。3、挑取單克隆至2-3ml液體LB培養(yǎng)基(含50 y g/ml卡那霉素，50 u g/ml慶大霉素和 IOii g/ml 利福平)中，28°C、240rpm 培養(yǎng) 20-24h。4、轉(zhuǎn)接100-200 U I菌液至IOml液體LB培養(yǎng)基(含50 y g/ml卡那霉素，50 u g/ml慶大霉素和10 u g/ml利福平)中，28°C、240rpm培養(yǎng)20_24h，至OD600值為0. 6-0. 8。實(shí)施例2、COIl蛋白的制備和純化(蛋白表達(dá)確定)一、轉(zhuǎn)化前煙草的培育I、將本生煙種子鋪于MS培養(yǎng)基上，4°C黑暗春化3天后，放置于植物房中培養(yǎng)(22°C ; 16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗)至幼苗長出兩片葉子(7-10天)。2、將幼苗移植于混合土(蛭石黑土為I : I ;質(zhì)量比)中，澆足水，繼續(xù)培養(yǎng)(280C ；16小 時(shí)光照，8小時(shí)黑暗)3周(2-3周均可)。二、轉(zhuǎn)化前重組農(nóng)桿菌的培養(yǎng)I、將Iml實(shí)施例I的步驟二得到的重組農(nóng)桿菌菌液裝于I. 5ml EP管中，20°C、4000g離心5min，收集菌體。2、用500 ill侵染注射液(由溶質(zhì)和水組成；溶質(zhì)及其含量為10mM MgCl2,IOmMMES, 0. 2mM乙酰丁香酮)懸浮菌體，室溫放置4小時(shí)(3_5h均可)。三、用重組農(nóng)桿菌瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草在步驟一得到的生長了 32天的煙草幼苗葉片上注射步驟二得到的重組農(nóng)桿菌菌液，每個(gè)葉片注射300 yl，注射菌液后開始計(jì)時(shí)，69小時(shí)后分別取各個(gè)進(jìn)行了注射處理的葉片。四、COIl蛋白的提取取I. 5g葉片，液氮充分研磨，加入4. 5ml RB緩沖液，混勻；4 °C、13000g離心15min，取上清；0. 22 ii M濾器過濾，得到約4. 5ml蛋白粗提液。五、對照液的制備I、轉(zhuǎn)化前煙草的培育同步驟一。2、對照農(nóng)桿菌的制備用pMYC2載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌菌株GV3101，采用實(shí)施例I的步驟二的方法制備得到對照農(nóng)桿菌菌液。3、轉(zhuǎn)化前對照農(nóng)桿菌的培養(yǎng)用對照農(nóng)桿菌代替重組農(nóng)桿菌，其它同步驟二。4、用對照農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草用對照農(nóng)桿菌的菌液代替重組農(nóng)桿菌的菌液，其它同步驟三。5、蛋白的提取(I)取I. 5g葉片，液氮充分研磨，加入4. 5ml RB緩沖液,混勻；4°C、13000g離心15min,取上清；0. 22 u M濾器過濾，得到約4. 5ml對照粗提液。六、蛋白量的比較將步驟四得到的蛋白粗提液和步驟五得到的對照液進(jìn)行western blot鑒定。所用的一抗為抗MYC抗體(Roche，貨號(hào)11667149001)，所有的二抗為羊抗鼠抗體(Abcam，貨號(hào)Ab6789)。結(jié)果見圖I (各泳道均含有總蛋白25 y g)。步驟五得到的對照蛋白液沒有顯示雜交信號(hào)，而步驟四得到的蛋白粗提液有信號(hào)，表明COII表達(dá)正常。實(shí)施例3、COII蛋白的制備和純化(葉片的最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間的確定)一、轉(zhuǎn)化前煙草的培育同實(shí)施例2的步驟一。二、轉(zhuǎn)化前重組農(nóng)桿菌的培養(yǎng)同實(shí)施例2的步驟二。
三、用重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草在步驟一得到的同一煙草幼苗的不同葉片(老葉為生長44天的葉片；中葉為生長38天的葉片；新葉為生長32天的葉片)上分別注射步驟二得到的重組農(nóng)桿菌菌液，每個(gè)葉片注射300 yl，注射菌液后開始計(jì)時(shí)，69小時(shí)后分別取各個(gè)進(jìn)行了注射處理的葉片。四、COIl蛋白的提取同實(shí)施例2的步驟四。五、蛋白量的比較將各個(gè)葉片得到的蛋白粗提液進(jìn)行western blot鑒定，同實(shí)施例2的步驟六。結(jié)果見圖2 (各泳道均含有總蛋白25 ii g)。不同葉片中COIl蛋白表達(dá)的情況不同，在幼嫩的新葉中蛋白表達(dá)量最高。 實(shí)施例4、COIl蛋白的制備和純化(蛋白表達(dá)的最佳時(shí)間的確定)一、轉(zhuǎn)化前煙草的培育同實(shí)施例2的步驟一。二、轉(zhuǎn)化前重組農(nóng)桿菌的培養(yǎng)同實(shí)施例2的步驟二。三、用重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草在步驟一得到的生長了 32天的煙草幼苗葉片上注射步驟二得到的重組農(nóng)桿菌菌液，每個(gè)葉片注射300 iil，注射菌液后開始計(jì)時(shí)，分別于24小時(shí)、32小時(shí)、42小時(shí)、52小時(shí)、62小時(shí)和69小時(shí)后取各個(gè)進(jìn)行了注射處理的葉片。四、COIl蛋白的提取同實(shí)施例2的步驟四。五、蛋白量的比較將各個(gè)葉片得到的蛋白粗提液進(jìn)行western blot鑒定，同實(shí)施例2的步驟六。結(jié)果見圖3 (各泳道均含有總蛋白25y g)。不同表達(dá)時(shí)間的葉片COIl蛋白表達(dá)的情況不同，注射重組農(nóng)桿菌后40-70小時(shí)COIl蛋白表達(dá)量達(dá)到最高值。實(shí)施例5、COIl蛋白的制備和純化(最佳蛋白提取緩沖液的確定)一、轉(zhuǎn)化前煙草的培育同實(shí)施例2的步驟一。二、轉(zhuǎn)化前重組農(nóng)桿菌的培養(yǎng)同實(shí)施例2的步驟二。三、用重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草在步驟一得到的生長了 32天的煙草幼苗的葉片上注射步驟二得到的重組農(nóng)桿菌菌液，每個(gè)葉片注射300 iil，注射菌液后開始計(jì)時(shí)，69小時(shí)后取各個(gè)進(jìn)行了注射處理的葉片。四、COIl蛋白的提取取I. 5g葉片，液氮充分研磨，加入4. 5ml緩沖液(RB緩沖液、緩沖液A、緩沖液B、緩沖液C、緩沖液D、緩沖液E、TBS緩沖液或PBS緩沖液)，混勻；4°C、13000g離心15min，取上清；0. 22 PM濾器過濾，得到約4. 5ml蛋白粗提液。五、蛋白量的比較
將各個(gè)蛋白粗提液進(jìn)行western blot鑒定，同實(shí)施例2的步驟六。結(jié)果見圖4(各泳道均含有總蛋白25 y g)。RB緩沖液提取的蛋白狀態(tài)最好。實(shí)施例6、COIl蛋白的制備和純化(最適的MYC肽競爭洗脫濃度的確定)一、轉(zhuǎn)化前煙草的培育同實(shí)施例2的步驟一。二、轉(zhuǎn)化前重組農(nóng)桿菌的培養(yǎng)同實(shí)施例2的步驟二。三、用重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草 同實(shí)施例4的步驟三。四、COIl蛋白的提取和純化將步驟三得到的葉片進(jìn)行COIl蛋白的提取和純化，步驟如下UCOIl蛋白的提取取I. 5g葉片，液氮充分研磨，加入4. 5ml RB緩沖液，混勻；4 °C、13000g離心15min，取上清；0. 22 ii M濾器過濾，得到約4. 5ml蛋白粗提液。2、COIl蛋白的純化(I)取100 ill MYC親和介質(zhì)用RB緩沖液洗5次(每次Iml)進(jìn)行平衡。(2)在步驟⑴的MYC親和介質(zhì)中加入1.5ml蛋白粗提液，4°C、360度翻轉(zhuǎn)孵育Ih0(3)用RB緩沖液清洗步驟(2)的親和介質(zhì)5次(每次Iml)，往親和介質(zhì)中加入600 u I MYC肽溶液(由MYC肽和RB緩沖液組成，MYC肽的濃度分別為IOii g/ml、50ii g/ml或100 u g/ml)，在4°C >360度翻轉(zhuǎn)孵育10小時(shí)，離心(4。。、6000g、30s)取上清，即為MYC-C0I1
蛋白液。五、蛋白量的比較將采用不同MYC肽競爭濃度得到的各個(gè)MYC-COIl蛋白液進(jìn)行western blot鑒定，同實(shí)施例2的步驟六。結(jié)果見圖5。50 ii g/ml MYC肽即可達(dá)到最大競爭洗脫效果。實(shí)施例7、COII蛋白生物活性的檢測在已知的茉莉素信號(hào)通路中，COIl蛋白在JA-Ile或冠菌素存在的情況下能與JAZ蛋白相互作用，因此可利用COIl蛋白這一生物學(xué)功能檢測純化后的蛋白是否具有生物活性。一、MYC-COIl蛋白液的制備I、轉(zhuǎn)化前煙草的培育同實(shí)施例2的步驟一。2、轉(zhuǎn)化前重組農(nóng)桿菌的培養(yǎng)同實(shí)施例2的步驟二。3、用重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草同實(shí)施例4的步驟三。4、COIl蛋白的提取和純化(I)取I. 5g葉片，液氮充分研磨，加入4. 5ml RB緩沖液,混勻；4°C、13000g離心15min，取上清；0. 22 ii M濾器過濾，得到約4. 5ml蛋白粗提液。(2)COIl蛋白的純化①取100 ill MYC親和介質(zhì)用RB緩沖液洗5次(每次Iml)進(jìn)行平衡。②在步驟①的MYC親和介質(zhì)中加入I. 5ml蛋白粗提液，4°C、360度翻轉(zhuǎn)孵育Ih ;然后再加入I. 5ml蛋白粗提液，4°C、360度翻轉(zhuǎn)孵育Ih ;然后再加入I. 5ml蛋白粗提液，4°C、360度翻轉(zhuǎn)孵育Ih。③用RB緩沖液清洗步驟②的親和介質(zhì)5次(每次lml)，往親和介質(zhì)中加入600 illMYC肽溶液(由MYC肽和RB緩沖液組成，MYC肽的濃度為50 u g/ml)，在4°C、360度翻轉(zhuǎn)孵育10小時(shí)，離心(4°C、6000g、30s)取上清，即為MYC-COII蛋白液(蛋白濃度約350 y g/ml)。二、JAZl-His蛋白液的制備 I、載體構(gòu)建(I)以擬南芥的cDNA為模板，用F2和R2組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)
增產(chǎn)物。F2 :5’ -AAAAGAATTCATGTCGAGTTCTATGGAATG-3’ ；R2 :5 ’ -AAACTGCAGTTACATCATCATCATCATCACTATTTCAGCTGCTAAAC-3，。PCR 擴(kuò)增程序95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共25個(gè)循環(huán)；72°C再延伸lOmin。(2)用限制性內(nèi)切酶Ecor I和Pst I雙酶切步驟⑴的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶Ecor I和Pst I雙酶切pMAL_c2x載體(NEB，貨號(hào)謝8076S)，回收線性化的載體骨架(約7kb)。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架在T4連接酶的作用下16°C連接16h，得到連接產(chǎn)物。(5)將步驟(4)的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，在含有100 U g/ml氨芐青霉素的平板上篩選陽性克隆。(6)將步驟(5)的陽性克隆提取質(zhì)粒并測序，測序結(jié)果表明得到了重組質(zhì)粒pMAL-c2x-JAZl-HIS。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pMAL-c2x-JAZl_HIS進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在pMAL-c2x載體的Ecor I和Pst I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列4所示DNA得到的重組質(zhì)粒(序列表的序列4所示的DNA編碼JAZl-His融合蛋白)。2、重組菌的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pMAL-c2x-JAZl-HIS熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌TBl菌株(NEB，貨號(hào)E4122S)感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌。3、蛋白表達(dá)(I)挑取步驟2得到的重組菌的單克隆于20ml LB液體培養(yǎng)基(含100 ii g/ml氨芐青霉素)，37°C 220rpm培養(yǎng)約16h。(2)以I : 100的體積比轉(zhuǎn)接步驟⑴的菌液于LBG液體培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨，
0.5%酵母提取物，0.5% NaCl，0. 2%葡萄糖；含1001^/1111氨芐青霉素)，371 245rpm培養(yǎng)約 2h 30min,至 OD600 約為 0. 5。(3)在步驟⑵的菌液中加入IM IPTG溶液(每升菌液加入300u IPTG溶液I)，16 °C 220rpm 培養(yǎng)約 16h。(4)取步驟(3)的菌液，離心(4°C，5000g，5min)，收集菌體。4、蛋白純化(I)將步驟3收集的菌體加入IOOml緩沖液50，充分懸浮。(2)超聲(功率400，超聲2s，停2s，超聲IOmin)破碎菌體，離心(12000g,4°C,15min)收集上清,0. 22 u m過濾。(3)將步驟⑵的濾液以0. 5ml/min的流速上樣于Ni-NTA層析柱(GEhealthcare，貨號(hào) 17-5318-02)。(4)用緩沖液50以lml/min的流速洗脫步驟(3)的層析柱至基線。 (5)用緩沖液400以lml/min的流速對步驟(4)的層析柱進(jìn)行競爭洗脫(見圖6)，收集洗脫峰(整個(gè)洗脫過程除了穿過峰僅存在一個(gè)明顯的洗脫峰)。(6)用30kd超濾管將步驟(5)的洗脫液濃縮至Iml以下，使用離心(4°C，5000g，30min),收集上清。(7)將步驟(6)的上清以lml/min的流速上樣于HiPrep26/10 Desalting柱(GEhealthcare，貨號(hào)17508701)，用RB緩沖液以5ml/min的流速洗脫，收集洗脫峰。(8)收集的洗脫液即為JAZl-His蛋白液，進(jìn)行420 ill分裝，_80°C保存。三、COII蛋白生物學(xué)活性檢測(I)將200 ill步驟二得到的JAZl-His蛋白液、IOOiU鎳親和介質(zhì)(QiAgen，貨號(hào)30210)和400 ill RB緩沖液，在4°C下，360度翻轉(zhuǎn)孵育lh。(2)用RB緩沖液清洗步驟(I)的親和介質(zhì)5次(每次lml)，往親和介質(zhì)中加入200iil步驟一得到的MYC-COIl蛋白液，再加入或不加入0. 5iil 0. ImM冠菌素(SigmA-Aldrich，貨號(hào)C8115)和300 RB緩沖液，4°C下，360度翻轉(zhuǎn)孵育Ih ;不加入冠菌素的樣品即可作為活性的陰性對照樣。(3)用RB緩沖液清洗步驟(2)的親和介質(zhì)5次(每次lml)，離心(4°C、6000g、30s)
收集沉淀。(4)將沉淀進(jìn)行western blot鑒定，同實(shí)施例2的步驟六。結(jié)果見圖7，純化得到的MYC-COIl具有生物學(xué)活性。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)外源蛋白的方法，包括如下步驟 (1)將所述外源蛋白的編碼基因插入PMYC2載體的多克隆位點(diǎn)，使所述外源蛋白的編碼基因和PMYC2載體上的6個(gè)MYC標(biāo)簽的編碼基因形成融合基因，得到重組質(zhì)粒； (2)將步驟(I)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，得到重組農(nóng)桿菌； (3)將步驟(2)的重組農(nóng)桿菌菌液注射煙草植株的葉片后繼續(xù)培育煙草植株； (4)取注射了重組農(nóng)桿菌菌液的煙草葉片，提取蛋白并進(jìn)行MYC親和純化，得到純化的外源蛋白。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(3)中，所述葉片為新葉；所述新葉為生長30-35天的葉片，優(yōu)選為生長32天的葉片。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在干步驟(3)中，所述培育煙草植株的時(shí)間為24至69小時(shí)，優(yōu)選為69小時(shí)。
4.如權(quán)利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于步驟(4)中，所述提取蛋白的方法包括如下步驟將所述煙草葉片進(jìn)行液氮研磨，然后用蛋白提取液進(jìn)行提取，得到蛋白粗提液。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述蛋白提取液為RB溶液；所述RB溶液的pH為7. 8，由溶質(zhì)和水組成；所述溶質(zhì)及其濃度如下50mM Tris, 50mM NaCl，10% (體積百分含量)甘油，0.1% (體積百分含量)Tween-20,0. 15% (體積百分含量)P -巰基こ醇，25mM咪唑。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在干步驟(4)中，所述MYC親和純化包括如下步驟 ①在MYC親和介質(zhì)中加入所述蛋白粗提液，4°C孵育Ih； ②清洗步驟①的MYC親和介質(zhì)； ③在步驟②的MYC親和介質(zhì)中加入MYC肽溶液，4°C孵育10小吋，然后離心取上清，即為含有純化的外源蛋白的溶液。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟②中，用所述RB溶液進(jìn)行所述清洗；步驟③中，所述MYC肽溶液由MYC肽和所述RB溶液組成，所述MYC肽的濃度為10-100 y g/ml，優(yōu)選為50 u g/ml o
8.如權(quán)利要求I至7中任一所述的方法，其特征在于所述農(nóng)桿菌為農(nóng)桿菌菌株GV3101。
9.如權(quán)利要求I至8中任一所述的方法，其特征在于所述煙草為本生畑。
10.如權(quán)利要求I至9中任一所述的方法，其特征在于所述外源蛋白為序列表的序列2所示的蛋白質(zhì)；所述外源蛋白的編碼基因優(yōu)選為序列表的序列3所示的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效表達(dá)外源蛋白的方法。本發(fā)明將外源蛋白基因克隆到pMYC2載體上，使其與pMYC2載體上的6個(gè)MYC標(biāo)簽的編碼基因形成融合基因，然后利用農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化法，在煙草葉片中瞬時(shí)高效的表達(dá)外源蛋白。然后，根據(jù)重組蛋白所帶有的MYC親和標(biāo)簽，利用帶有相應(yīng)標(biāo)簽抗體的親和介質(zhì)將煙草表達(dá)蛋白高效純化，最后再競爭洗脫親和介質(zhì)最終獲得純化后的目的蛋白。純化后蛋白可用于進(jìn)一步的生物學(xué)功能研究。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)一步法純化蛋白，簡單快捷，而且蛋白純度較高。利用該方法所獲得的外源重組蛋白可用于生物安全評價(jià)和生物功能研究。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102816758SQ20111015528
公開日2012年12月12日 申請日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者李海鷗, 閆建斌, 姚瑞楓, 謝道昕, 李素華, 白志燕, 彭文 申請人:清華大學(xué)