專利名稱：一種發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸發(fā)酵液的方法
一種發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸發(fā)酵液的方法技術領域
本發(fā)明屬于發(fā)酵技術領域，涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸發(fā)酵液的方法。
技術背景
透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid, HA)又名透明酸或玻璃酸，是一種人體生理所必需的粘多糖，廣泛存在于動物及人體的各種組織中。在不同組織中HA的生理作用有所不 同，如在關節(jié)滑液中主要為潤滑作用；在血管壁中主要是調(diào)節(jié)通透性；在皮膚中主要表 現(xiàn)為保水作用?；贖A高黏度、潤滑性、保水性、良好的生物相容性及其特殊的生理 性能等，其在醫(yī)藥領域有廣泛的用途，目前國際上在骨科、眼科、外科、創(chuàng)傷、緩釋制 劑、誘導靶向給藥載體、腫瘤治療、皮膚填充劑等方面的應用均取得了較大的進展。
目前采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸也是一種常規(guī)方法，它彌補了傳統(tǒng)雞冠提取 法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的不足。微生物發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸，大大拓寬了 HA的來源，推動了 HA 的研究和應用。但目前發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的發(fā)酵條件中傳統(tǒng)的溫度為37°C，在公開 的申請?zhí)枮?0051012^18，專利名稱為《一種提高發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸產(chǎn)量及分子量的 方法》的專利說明書中，公開的發(fā)酵工藝條件中溫度為37°C，通氣量為1.2min/L，產(chǎn)量 6.059g/L ；在2006年10月第6卷第5期“過程工程學報”中的一篇名為《高產(chǎn)量、高 分子量透明質(zhì)酸發(fā)酵條件優(yōu)化》一文中公開的發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的發(fā)酵溫度為37°C， 通氣量1.2min/L，產(chǎn)量達5.9g/L，事實上，傳統(tǒng)發(fā)酵溫度并不能同時確保所生產(chǎn)透明質(zhì) 酸的高產(chǎn)量與高分子量。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是傳統(tǒng)發(fā)酵溫度并不能同時確保所生產(chǎn)透明質(zhì)酸的 高產(chǎn)量與高分子量的問題，并借鑒其它各種影響透明質(zhì)酸產(chǎn)量與質(zhì)量的因素，例如發(fā)酵 菌種、發(fā)酵所需的營養(yǎng)物質(zhì)、微量元素、氨基酸、發(fā)酵攪拌速度、發(fā)酵液的酸堿度、發(fā) 酵通氣量等等方面，在這些因素已經(jīng)得到優(yōu)化的前提下，尋找合適的發(fā)酵溫度，從而得 到一種發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸發(fā)酵液的方法。
本發(fā)明通過以下方案解決該技術問題
一種發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸發(fā)酵液的方法，以獸疫鏈球菌H23為發(fā)酵菌株，所述方 法的步驟為
a、將獸疫鏈球菌H23接種至腦心浸出粉瓊脂培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，得到獸疫鏈球 菌H23菌體；
b、配置種子培養(yǎng)基，所述種子培養(yǎng)基由蔗糖、酵母粉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、 硫酸錳、微量元素液、緩沖液組成，所述微量元素液由氯化鈣、氯化鋅、硫酸錳、硫酸 銅組成，所述緩沖液由磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉組成，種子培養(yǎng)基預先用氫氧化鈉調(diào)節(jié) PH值至7.2后滅菌，將獸疫鏈球菌H23菌體接種至種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到獸疫鏈球菌H23 種子培養(yǎng)液；4
C、配置發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由蔗糖、酵母粉、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、 硫酸鉀、精氨酸、微量元素液、緩沖液組成，所述微量元素液由氯化鈣、氯化鋅、硫酸 錳、硫酸銅組成，所述緩沖液由磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉組成，發(fā)酵培養(yǎng)基預先用氫氧 化鈉調(diào)節(jié)PH值至7.2后滅菌，將獸疫鏈球菌H23種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)液，發(fā)酵溫 度為40V，發(fā)酵完畢即可得到透明質(zhì)酸發(fā)酵液。
該技術方案采用生命力較強的獸疫鏈球菌H23作為發(fā)酵菌種生產(chǎn)透明質(zhì)酸發(fā)酵 液，在發(fā)酵過程中，針對獸疫鏈球菌H23營養(yǎng)要求高的特點，在種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng) 基中添加了各種營養(yǎng)物質(zhì)，例如提供充足碳源的蔗糖，提供維生素及蛋白質(zhì)的酵母粉， 參與獸疫鏈球菌H23代謝的各種礦物質(zhì)，微量元素，以及某些獸疫鏈球菌H23自身無法 合成，然而又是獸疫鏈球菌H23生產(chǎn)透明質(zhì)酸不可缺少的氨基酸，例如精氨酸。因此本 發(fā)明所提供的各種營養(yǎng)物質(zhì)能夠確保獸疫鏈球菌的生長，從而為提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)量與 質(zhì)量打下良好的基礎，下面是種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)液各營養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)配量
種子培養(yǎng)基包含
蔗糖濃度為10_30g/L 酵母粉濃度為18.0_22.0g/L
硫酸鎂濃度為1.0_5.0g/L 磷酸二氫鉀濃度為1.0_4.0g/L，
硫酸錳濃度為0.01_0.2g/L微量元素液濃度為0.5-10ml/L，
緩沖液為10_200ml/L ；
其中，所述微量元素液中氯化鈣濃度為50-5000mg/L，氯化鋅濃度為 10-200mg/L,硫酸錳濃度為l_50mg/L，硫酸銅濃度為l_100ml/L ；
所述種子培養(yǎng)基中所使用的緩沖液中磷酸氫二鈉濃度為10_70g/L，磷酸二氫鈉 濃度為5-30g/L。
發(fā)酵培養(yǎng)基包含
蔗糖濃度為30_120g/L 酵母粉濃度為18.0_22.0g/L
硫酸鎂濃度為1.0_5.0g/L 磷酸二氫鈉濃度為1.0-6.0g/L
硫酸鉀濃度為0.5_4.0g/L 精氨酸濃度為0.01_0.2g/L
微量元素液濃度為1.0-10.0ml/L緩沖液濃度為5_200ml/L
其中，所述微量元素液中氯化鈣濃度為200-5000mg/L，氯化鋅濃度為 5-300mg/L,硫酸錳濃度為l_50mg/L，硫酸銅濃度為l_200mg/L ；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基中所使用的緩沖液中磷酸氫二鈉濃度為10_70g/L，磷酸二氫鈉 濃度為15-30g/L。
為使獸疫鏈球菌能夠迅速大量繁殖，所述種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件可以是培養(yǎng) 溫度37°C，震蕩培養(yǎng)10-14小時。
作為本發(fā)明方法中c步驟的發(fā)酵條件，發(fā)酵攪拌速度可以是200-300rpm，用質(zhì) 量百分比濃度為30%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的酸堿度，使發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值始 終保持在7.0士0.1之間，通氣量為lvvm，發(fā)酵時間為18-22小時。
更為重要的是，本發(fā)明經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度同樣能夠?qū)ν该髻|(zhì)酸的產(chǎn)量及 質(zhì)量產(chǎn)生影響。一般認為，獸疫鏈球菌H23的葡萄糖代謝中至少存在兩個可以轉(zhuǎn)化的合 成方向，第一個方向是合成菌體細胞壁第二個方向是合成透明質(zhì)酸方向，發(fā)酵溫度較 低時，合成菌體細胞壁方向可向合成透明質(zhì)酸方向轉(zhuǎn)變，從而可以提高透明質(zhì)酸的分子量，生產(chǎn)高質(zhì)量的透明質(zhì)酸，但此時獸疫鏈球菌H23的生長速度和代謝速度均較慢，因 此，透明質(zhì)酸的產(chǎn)量無法保證。在發(fā)酵溫度較高時，獸疫鏈球菌H23的生長速度較快， 但所生產(chǎn)的透明質(zhì)酸的分子量較低。
另一種觀點認為，發(fā)酵溫度較高或者較低都會使透明質(zhì)酸的產(chǎn)量和分子量降 低，對此的解釋是目前用于生產(chǎn)透明質(zhì)酸的鏈球菌大多數(shù)是來自于哺乳動物體內(nèi)的細 菌，因此，要在體外培養(yǎng)生產(chǎn)更多的透明質(zhì)酸，需要提供類似體內(nèi)生長的人工培養(yǎng)環(huán)^Mi ο
不論是第一種觀點還是第二種觀點，為了同時達到透明質(zhì)酸的高產(chǎn)量和高分子 量，這兩種觀點所采取的措施是相同的，即將生產(chǎn)透明質(zhì)酸的發(fā)酵溫度控制在一個很小 的范圍內(nèi)，通常采用的發(fā)酵溫度是37°C。
而本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度在40°C時可以使技術人員在采用本發(fā)明所述 的技術方案后得到較高產(chǎn)量和較高分子量的透明質(zhì)酸，從而克服了本領域技術人員在使 用常規(guī)發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸習慣將發(fā)酵溫度設定在37°C的技術偏見。得到的透明質(zhì)酸發(fā) 酵液的特性黏度范圍為1700 η 2100 η，產(chǎn)量為6.1g/L 6.3g/L。
另外，由于本工藝是耗氧發(fā)酵，因此發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的熱量，發(fā)酵過程 中的熱量包括發(fā)酵過程散發(fā)熱和攪拌熱，產(chǎn)生的熱量會直接導致發(fā)酵溫度快速上升并大 大超過工藝要求的溫度，溫度快速上升之后需要大量的冷媒將發(fā)酵溫度降至在工藝要求 的范圍。因此，如果發(fā)酵溫度控制在37°C，將需要更多的冷媒將升高的溫度降至37°C; 反之，發(fā)酵溫度控制在40°C，需要的冷媒大大減少，從而降低能耗，減少生產(chǎn)成本。
上述技術方案中提到的冷媒為自來水。
具體實施方式
實施例1
以獸疫鏈球菌H23為發(fā)酵菌株發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸，其步驟為
1、將獸疫鏈球菌H23接種至腦心浸出粉瓊脂培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，于37°C培養(yǎng)16 小時，得到獸疫鏈球菌H23菌體；
2、配置500ml種子培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基的組成為蔗糖20g/L，酵母粉15.0g/L，硫酸鎂1.0g/L，磷酸二氫 鉀1.0g/L，硫酸錳0.03g/L，微量元素液20ml/L，緩沖液100ml/L ；
其中微量元素液的組成為氯化鈣1000mg/L，氯化鋅100mg/L，硫酸錳30mg/ L,硫酸銅80mg/L;
其中緩沖液的組成為磷酸氫二鈉50g/L，磷酸二氫鈉25g/L。
配置好的種子培養(yǎng)基預先用質(zhì)量百分比濃度為30%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至7.2 后滅菌，將獸疫鏈球菌H23菌體接種至種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37°C震蕩培養(yǎng)12小時，得到 獸疫鏈球菌H23種子培養(yǎng)液；
3、配置5L發(fā)酵培養(yǎng)基
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為蔗糖100g/L，酵母粉15.0g/L，硫酸鎂5.0g/L，磷酸二 氫鈉5.0g/L，硫酸鉀3.5g/L，精氨酸0.15g/L，微量元素液10ml/L，緩沖液100ml/L ；
其中微量元素液的組成為氯化鈣4000mg/L，氯化鋅200mg/L，硫酸錳:35mg/L,硫酸銅 160mg/L ；
配置發(fā)酵培養(yǎng)基后裝入IOL的發(fā)酵罐中，配置好的發(fā)酵培養(yǎng)基預先用質(zhì)量百分 比濃度為30 %的氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至7.2后滅菌，將獸疫鏈球菌H23種子培養(yǎng)液接種 至發(fā)酵培養(yǎng)液，接種后在攪拌轉(zhuǎn)速為200-300rpm，溫度為40V，PH值為7.0，通氣量為 Ivvm條件下培養(yǎng)20小時，得到透明質(zhì)酸發(fā)酵液，發(fā)酵過程中用質(zhì)量百分比濃度為30% 的氫氧化鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵液的PH值，使PH值保持在7.0士0.1之間；
試驗結(jié)果
權利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸發(fā)酵液的方法，以獸疫鏈球菌H23為發(fā)酵菌株，所述方法 的步驟為a、將獸疫鏈球菌H23接種至腦心浸出粉瓊脂培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，得到獸疫鏈球菌 H23菌體；b、配置種子培養(yǎng)基，所述種子培養(yǎng)基由蔗糖、酵母粉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸 錳、微量元素液、緩沖液組成，所述微量元素液由氯化鈣、氯化鋅、硫酸錳、硫酸銅組 成，所述緩沖液由磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉組成，種子培養(yǎng)基預先用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值 至7.2后滅菌，將獸疫鏈球菌H23菌體接種至種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到獸疫鏈球菌H23種子 培養(yǎng)液；C、配置發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由蔗糖、酵母粉、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、硫酸 鉀、精氨酸、微量元素液、緩沖液組成，所述微量元素液由氯化鈣、氯化鋅、硫酸錳、 硫酸銅組成，所述緩沖液由磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉組成，發(fā)酵培養(yǎng)基預先用氫氧化鈉 調(diào)節(jié)PH值至7.2后滅菌，將獸疫鏈球菌H23種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)液，發(fā)酵溫度為 40發(fā)酵完畢即可得到透明質(zhì)酸發(fā)酵液。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸發(fā)酵液的方法，其特征在于b步驟的種子培養(yǎng)液中蔗糖濃度為10-30g/L，酵母粉濃度為18.0-22.0g/L，硫酸鎂濃 度為1.0-5.0g/L，磷酸二氫鉀濃度為1.0-4.0g/L，硫酸錳濃度為0.01_0.2g/L，微量元素液 濃度為 0.5-10ml/L，緩沖液為 10-200ml/L ；所述微量元素液中氯化鈣濃度為500-5000mg/L，氯化鋅濃度為10-200mg/L，硫酸 錳濃度為l_50mg/L，硫酸銅濃度為l-100mg/L ；所述緩沖液中磷酸氫二鈉濃度為10-70g/L，磷酸二氫鈉濃度為5-30g/L。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸發(fā)酵液的方法，其特征在于c步驟的發(fā)酵培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30-120g/L，酵母粉濃度為18.0-22.0g/L，硫酸鎂 濃度為1.0_5.0g/L，磷酸二氫鈉濃度為1.0-6.0g/L，硫酸鉀濃度為0.5_4.0g/L，精氨酸濃 度為0.01-0.2g/L，微量元素液濃度為l-10ml/L，緩沖液濃度為5_200ml/L ；所述微量元素液中氯化鈣濃度為200-5000mg/L，氯化鋅濃度為5-300mg/L，硫酸錳 濃度為l_50mg/L，硫酸銅濃度為l_200mg/L ；所述緩沖液中磷酸氫二鈉濃度為10-70g/L，磷酸二氫鈉濃度為5-30g/L。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸發(fā)酵液的方法，其特征在于b步 驟中種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度37°C，震蕩培養(yǎng)10-14小時。
5.根據(jù)權利要求3所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸發(fā)酵液的方法，其特征在于b步驟中 種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度37°C，震蕩培養(yǎng)10-14小時。
6.根據(jù)權利要求1或2所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸發(fā)酵液的方法，其特征在于c步 驟中的發(fā)酵過程中，發(fā)酵攪拌速度為200-300rpm，用質(zhì)量百分比濃度為30%的氫氧化鈉 溶液調(diào)節(jié)，使發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值在7.0士0.1之間，通氣量為lvvm，發(fā)酵時間為18-22小 時。
7.根據(jù)權利要求3所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸發(fā)酵液的方法，其特征在于c步驟中 的發(fā)酵過程中，發(fā)酵攪拌速度為200-300rpm，用質(zhì)量百分比濃度為30%的氫氧化鈉溶液 調(diào)節(jié)，使發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值在7.0士0.1之間，通氣量為lvvm，發(fā)酵時間為18-22小時。
8.根據(jù)權利要求4所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸發(fā)酵液的方法，其特征在于c步驟中 的發(fā)酵過程中，發(fā)酵攪拌速度為200-300rpm，用質(zhì)量百分比濃度為30%的氫氧化鈉溶液 調(diào)節(jié)，使發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值在7.0士0.1之間，通氣量為lvvm，發(fā)酵時間為18-22小時。
全文摘要
本發(fā)明屬于發(fā)酵技術領域，涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸發(fā)酵液的方法，為了解決傳統(tǒng)發(fā)酵溫度并不能同時確保所生產(chǎn)透明質(zhì)酸的高產(chǎn)量與高分子量的問題，本發(fā)明綜合考慮了其它各種影響透明質(zhì)酸產(chǎn)量及質(zhì)量的因素，并著重對發(fā)酵溫度進行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度在40℃時，發(fā)酵效果最好，從而克服了在發(fā)酵溫度這一因素調(diào)控上的技術偏見，并且采用本發(fā)明的發(fā)酵方法能夠顯著的降低發(fā)酵能耗，并一定程度上提高產(chǎn)量及質(zhì)量。
文檔編號C12R1/46GK102021213SQ20091019580
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月17日 優(yōu)先權日2009年9月17日
發(fā)明者付愛玲, 張延良, 曾輝, 黃宇 申請人:上海佰加壹醫(yī)藥有限公司