專(zhuān)利名稱(chēng)：從微生物發(fā)酵液中分離提取透明質(zhì)酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸的制備方法，尤其涉及從微生物發(fā)酵液中分離提取透明質(zhì)酸的方法。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid，HA)是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖通過(guò)β，1-3和β，1-4糖苷鍵所構(gòu)成的重復(fù)單元而形成的線性高分子粘多糖，雙糖單位數(shù)為300-1100對(duì)，分子量范圍105-107Da。
1934年，Meyer和Palmer從牛眼玻璃體中分離出一種大分子多糖，他們把這種多糖命名為透明質(zhì)酸。HA溶于水，不溶于醇、酮、乙醚等有機(jī)溶劑。由于其溶液具有超強(qiáng)的持水性、粘彈性和生物易吸收性，被廣泛由于眼科手術(shù)、腹腔手術(shù)中預(yù)防粘連、關(guān)節(jié)炎以及化妝品等領(lǐng)域。
透明質(zhì)酸的生產(chǎn)主要有動(dòng)物組織提取法和發(fā)酵法兩種生產(chǎn)工藝。在早期主要是提取法，可用于生產(chǎn)透明質(zhì)酸的動(dòng)物器官組織主要有雞冠、人臍帶和動(dòng)物眼球。由于受原料來(lái)源少以及透明質(zhì)酸含量低的限制，提取法生產(chǎn)透明質(zhì)酸成本較高。與提取法相比，發(fā)酵法生產(chǎn)規(guī)模不受原料來(lái)源限制，發(fā)酵液中透明質(zhì)酸以游離狀態(tài)存在，易于分離純化和形成規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)，所以生產(chǎn)成本遠(yuǎn)低于提取法，而且無(wú)動(dòng)物來(lái)源的致病病毒污染的危險(xiǎn)，且可以得到大分子量、高產(chǎn)量的HA。因此，目前提取法正逐漸被發(fā)酵法取代。
已知的使用微生物分離并純化透明質(zhì)酸的方法如下美國(guó)專(zhuān)利No.4784990描述的純化方法包括向獸疫鏈球菌的培養(yǎng)液中加入乙醇使透明質(zhì)酸從微生物中分離出來(lái)，然后用氯代十六烷基吡啶使其沉淀。HA得率僅60-70％，需要經(jīng)高溫加熱、兩次過(guò)濾、二次絡(luò)合、四次醇沉及一次過(guò)柱才能制得高純度HA。美國(guó)專(zhuān)利No.5316926描述的純化方法包括向發(fā)酵液中加入0.01％的硫酸月桂酯(SLS)表面活性劑以分離附著在細(xì)胞壁上的透明質(zhì)酸，然后加入陽(yáng)離子表面活性劑氯代十六烷基吡啶以形成透明質(zhì)酸沉淀，并用醇使其沉淀。該過(guò)程也另外包括三次過(guò)濾和四次醇沉，還需之前對(duì)莢膜用SLS處理。美國(guó)專(zhuān)利No.5411874描述了向發(fā)酵液中加入福爾馬林溶液殺菌，加入十二烷基硫酸鈉(SDS)使莢膜脫落，后經(jīng)一次過(guò)濾、一次超濾、一次絡(luò)合和三次醇沉及后得到的HA，蛋白較高約為0.2％(蛋白/HA(g/g))，為化妝品級(jí)HA。美國(guó)專(zhuān)利No.4157296公開(kāi)的一種純化透明質(zhì)酸的方法包括用三氯乙酸處理膿鏈球菌的培養(yǎng)液以除去菌株，然后用有機(jī)溶劑使其沉淀。此法通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH殺菌，但由于也需大量重復(fù)使用有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀，導(dǎo)致成本高并且非常耗時(shí)。膜技術(shù)可純化HA，但一般均是作為一種輔助分離手段，用于菌體或小分子量去除，仍需有機(jī)溶劑進(jìn)行分離。如美國(guó)專(zhuān)利No.4517295、No.4801539等，采用MWCO10000，20000，30000Da超濾膜滲濾去除小分子物質(zhì)。但美國(guó)專(zhuān)利No.6489467描述了一種無(wú)須使用有機(jī)溶劑，而是通過(guò)調(diào)節(jié)HA的pH至2.5使HA性狀改變并使用超濾進(jìn)行提純的方法，但濾速很慢很耗時(shí)，不利于大規(guī)模生產(chǎn)，且HA不宜長(zhǎng)期處于pH為2.5環(huán)境中，易導(dǎo)致分子量降解。中國(guó)專(zhuān)利200610057913.2和200610090586.0也描述了調(diào)節(jié)HA的pH至3，在電場(chǎng)和磁場(chǎng)的幫助下進(jìn)行超濾，以加大濾速，同時(shí)避免了使用有機(jī)溶劑，但是濾速仍然僅為25.8L/(m2·h)，不利于放大。日本專(zhuān)利早期公開(kāi)No.63-012293描述了一種通過(guò)使用大網(wǎng)狀陰離子交換樹(shù)脂(DianionHPA-25、HPA-75、IRA-900、IRA-904)處理含透明質(zhì)酸的溶液以除去分子量等于或小于1500000Da的低分子量透明質(zhì)酸及發(fā)熱物質(zhì)的方法。韓國(guó)專(zhuān)利No.10-2002-0048915描述了發(fā)酵液經(jīng)活性炭處理、芳族吸附樹(shù)脂處理、超濾作用及乙醇沉淀作用等得到高純度HA。
然而，無(wú)論提取法還是發(fā)酵法，在生產(chǎn)過(guò)程中都包含了反復(fù)的乙醇沉淀和選擇性沉淀。工藝路線較長(zhǎng)、復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，成本高；采用較多有機(jī)溶劑，易造成二次污染。致使透明質(zhì)酸的生產(chǎn)成本仍然很高，嚴(yán)重限制了透明質(zhì)酸應(yīng)用范圍。各種替代方法如采用一些較貴的性能穩(wěn)定的吸附樹(shù)脂或離子交換樹(shù)脂進(jìn)行除雜，或采用冷凍離心、pH調(diào)控、超濾等方法除雜，所得產(chǎn)品純度高，但HA得率和分子量損失率則因操作步驟多而有所不足，又涉及復(fù)雜的處理過(guò)程和處理設(shè)備，從而加大了生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從微生物發(fā)酵液中收集透明質(zhì)酸的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)對(duì)含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液，通過(guò)氯代十六烷基吡啶進(jìn)行絡(luò)合或通過(guò)乙醇進(jìn)行醇沉；(2)收集絡(luò)合物或醇沉物，加入氯化鈉水溶液，使絡(luò)合物或醇沉物的解離或溶解；
(3)收集解離物或溶解物中的透明質(zhì)酸沉淀，用水溶解，干燥，獲得目標(biāo)產(chǎn)物；所說(shuō)的透明質(zhì)酸的分子量為1～3MDa。
所說(shuō)的發(fā)酵液可以采用田毅紅2004年發(fā)表在《中國(guó)醫(yī)藥工程雜志》上的《高分子量透明質(zhì)酸的發(fā)酵研究》報(bào)道的方法，進(jìn)行制備；所說(shuō)的透明質(zhì)酸的分子量為1～3MDa；所說(shuō)的氯代十六烷基吡啶(簡(jiǎn)稱(chēng)CPC)可采用市售產(chǎn)品，如國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司的產(chǎn)品；優(yōu)選的，本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)將含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液加水稀釋至透明質(zhì)酸的含量為0.3～0.5g/ml，然后加入氯代十六烷基吡啶；攪拌，絡(luò)合；CPC與透明質(zhì)酸的重量比為HA∶CPC＝1∶1.5～1∶2.5；(2)將步驟(1)的產(chǎn)物離心分離，收集固體絡(luò)合物；(3)加入濃度為0.4～1M的氯化鈉水溶液至原發(fā)酵液體積的0.9～1.1倍，絡(luò)合物解離，獲得HA溶液；(4)加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶2，體積比，攪拌，沉淀，得到纖維狀HA沉淀物；(5)加入0.1～0.2M氯化鈉至兩倍的發(fā)酵液體積，攪拌至沉淀溶解；(6)在溶解液中加入珍珠巖和活性炭，攪拌，過(guò)濾，得到濾液；所說(shuō)的珍珠巖選白2號(hào)珍珠巖或4號(hào)珍珠巖中的一種以上，加入量為2～4g/L，活性炭的加入量為1.5～2.5g/L；(7)向?yàn)V液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶1.5～2.5，體積比，攪拌后得到HA沉淀；(8)用水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫(yī)用級(jí)HA干粉。
所得HA干粉1.2g，葡糖醛酸純度約44.5％，HA得率為91％，分子量為2.07MDa，分子量損失率為13％，蛋白/HA(g/g)＝0.04％。
優(yōu)選的，本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)將含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液加水稀釋至透明質(zhì)酸的含量為0.3～0.5g/ml，然后加入氯代十六烷基吡啶；攪拌，絡(luò)合；CPC與透明質(zhì)酸的重量比為HA∶CPC＝1∶1.5～1∶2.5；
(2)將步驟(1)的產(chǎn)物離心分離，收集固體絡(luò)合物；(3)加入0.4～1M的氯化鈉水溶液至1.8～2.2倍的原發(fā)酵液體積，絡(luò)合物解離，獲得HA溶液；(4)在步驟(3)的溶液中加入珍珠巖和活性炭，攪拌，過(guò)濾，收集濾液；所說(shuō)的珍珠巖選自2號(hào)珍珠巖或4號(hào)珍珠巖中的一種以上，加入量為2～4g/L，活性炭的加入量為1.5～2.5g/L；(5)在濾液中加入氧化鋁，加量為HA∶氧化鋁＝1∶4～1∶8(g/g)，另加入1～2g/L活性炭，攪拌，過(guò)濾，收集濾液；(6)向?yàn)V液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶1.5～2.5，體積比，攪拌后得到HA沉淀；7)用水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫(yī)用級(jí)HA干粉。
所得HA干粉2.18g，葡糖醛酸純度約46.1％，HA得率為91％，分子量為1.92MDa，分子量損失率為10.1％，蛋白/HA(g/g)＝0.0％。
優(yōu)選的，本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)將含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶1.5～2.5，體積比，攪拌后得到纖維狀HA沉淀；(2)加入0.1～0.2M的氯化鈉水溶液至1.8～2.2倍的原發(fā)酵液體積，攪拌，沉淀溶解；(3)在步驟(2)的溶液中加入珍珠巖和活性炭，攪拌，過(guò)濾，得到濾液；所說(shuō)的珍珠巖選自2號(hào)珍珠巖或4號(hào)珍珠巖中的一種以上，加入量為2～4g/L，活性炭的加入量為1.5～2.5g/L，過(guò)濾，收集濾液；(4)在步驟(3)的濾液中加入氧化鋁，加量為HA∶氧化鋁＝1∶4～1∶8(g/g)，另加入1～2g/L活性炭，攪拌，過(guò)濾，收集濾液；(5)向?yàn)V液中加入乙醇，向?yàn)V液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶1.5～2.5，體積比，攪拌后得到HA沉淀；(6用水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫(yī)用級(jí)HA干粉。
所得HA干粉2.2g，葡糖醛酸純度約45.9％，HA得率為92％，分子量為1.90MDa，分子量損失率為11.1％，蛋白/HA(g/g)＝0.0％。
本發(fā)明采用直接對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行絡(luò)合或醇沉操作，既能脫色、使蛋白變性殺菌利于后續(xù)過(guò)濾除去蛋白，又能保證HA得率，因發(fā)酵液所含HA濃度高，HA經(jīng)醇沉，幾乎可完全沉淀。因此避免了采用酸化處理或高溫進(jìn)行殺菌，防止HA遭到降解；也避免了加入福爾馬林溶液、SDS或SLS這些殺菌劑或表面活性劑，防止二次污染；避免了對(duì)發(fā)酵液先過(guò)濾后沉淀導(dǎo)致的HA得率較低，因過(guò)濾操作需要對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行稀釋?zhuān)@樣得到的濾液所含HA的濃度就較低，此時(shí)加乙醇進(jìn)行沉淀會(huì)導(dǎo)致HA得率較低，若濾液經(jīng)薄膜濃縮后再沉淀，則增加了操作成本。
采用一次絡(luò)合、一次過(guò)濾和兩次沉淀的方法時(shí)，將發(fā)酵液直接用CPC絡(luò)合，CPC絡(luò)合HA關(guān)鍵在于控制好溶液離子強(qiáng)度，因此只要將發(fā)酵液稀釋足夠倍數(shù)(10倍)后加入CPC即可生成絡(luò)合物，且CPC的用量只與發(fā)酵液中HA的總質(zhì)量有關(guān)，因此發(fā)酵液稀釋并不會(huì)加大CPC用量。絡(luò)合后將絡(luò)合物解離到原發(fā)酵液體積，此時(shí)再用乙醇沉淀，由于不是沉淀發(fā)酵液的稀釋液，保證了HA高濃度，節(jié)省了乙醇的用量，且HA得率高，蛋白去除率高。然后將沉淀物溶解后過(guò)濾，由于過(guò)濾的除蛋白效率取決于助濾劑和吸附劑的用量，當(dāng)雜蛋白含量在吸附劑的吸附飽和范圍內(nèi)時(shí)可一次性被除去，而CPC絡(luò)合或乙醇沉淀的除蛋白效率僅約25％，因此若將過(guò)濾安排在較為靠前的步驟中，則最終HA的蛋白去除率就只能達(dá)到95％左右，若要提高HA純度，需再次過(guò)濾或進(jìn)行過(guò)吸附柱等操作進(jìn)一步提純。過(guò)濾放在后面進(jìn)行，除蛋白效率高，還因加入的助濾劑和活性炭等吸附劑更易于吸附變性后的蛋白，而此時(shí)蛋白早已得到了充分的變性。對(duì)發(fā)酵液先進(jìn)行絡(luò)合而非醇沉，為了防止先醇沉后絡(luò)合，則絡(luò)合物的解離液通過(guò)僅有的一次過(guò)濾，多余的CPC未必能除盡，影響產(chǎn)品質(zhì)量。采用一次過(guò)濾是為了提高生產(chǎn)效率，因?yàn)楣I(yè)生產(chǎn)中過(guò)濾的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或次數(shù)過(guò)多會(huì)直接導(dǎo)致生產(chǎn)效率低下。采用一次絡(luò)合、二次過(guò)濾和一次沉淀的方法，則主要考慮到有機(jī)溶劑使用成本高，污染大，通過(guò)增加一次過(guò)濾操作來(lái)替代一次醇沉，連續(xù)過(guò)濾可避免中間進(jìn)行濃縮或其他操作，提高HA得率。采用二次過(guò)濾和二次沉淀的方法，則主要考慮到CPC較昂貴，大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)若能避免使用，可以降低生產(chǎn)成本，于是采用醇沉來(lái)替代絡(luò)合。
采用簡(jiǎn)單的設(shè)備和簡(jiǎn)單的四步操作有序組合，就制得醫(yī)用級(jí)HA，且HA得率約90％，分子量損失率約15％，避免復(fù)雜的設(shè)備不利于放大或增加生產(chǎn)成本，無(wú)須煩瑣的步驟使HA得率降低，分子量損失率變大或大量使用有機(jī)溶劑增大成本，從而利于工業(yè)化放大生產(chǎn)透明質(zhì)酸。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
1)取500ml發(fā)酵液，含HA2g，分子量為2.38MDa。發(fā)酵液用去離子水稀釋十倍2)加入CPC，加量為HA∶CPC＝1∶1.5(g/g)，攪拌絡(luò)合后，在3000rpm下離心20min后得到絡(luò)合物。
3)加入0.5M的氯化鈉至原發(fā)酵液體積，攪拌至解離4)加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶2(v/v)，攪拌后得到纖維狀HA沉淀；5)加入0.1M氯化鈉至兩倍的發(fā)酵液體積，攪拌至沉淀充分溶解。
6)在溶解液中加入3g/L的2號(hào)珍珠巖，3g/L的4號(hào)珍珠巖和2g/L的活性炭，攪拌兩小時(shí)后，用紙板過(guò)濾，得到濾液。
7)向?yàn)V液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶2(v/v)，攪拌后得到HA沉淀8)用純水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫(yī)用級(jí)HA干粉。
所得HA干粉1.2g，葡糖醛酸純度約44.5％，HA得率為91％，分子量為2.07MDa，分子量損失率為13％，蛋白/HA(g/g)＝0.04％。
實(shí)施例21)取500ml發(fā)酵液，含HA2.4g，分子量為2.14MDa。發(fā)酵液需先用去離子水稀釋十倍2)加入CPC，加量為HA∶CPC＝1∶1.5(g/g)，攪拌絡(luò)合后，在3000rpm下離心20min后得到絡(luò)合物。
3)加入0.5M氯化鈉至兩倍的發(fā)酵液體積，攪拌至沉淀溶解；4)在溶解液中加入3g/L的2號(hào)珍珠巖，3g/L的4號(hào)珍珠巖和2g/L的活性炭，攪拌兩小時(shí)后，用紙板過(guò)濾，得到初濾液。
5)在初濾液中加入氧化鋁，加量為HA∶氧化鋁＝1∶5(g/g)，另加入1～2g/L活性炭，攪拌2小時(shí)后，用紙板過(guò)濾得到濾液；6)向?yàn)V液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶2(v/v)，攪拌后得到HA沉淀7)可用純水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫(yī)用級(jí)HA干粉。
所得HA干粉2.18g，葡糖醛酸純度約46.1％，HA得率為91％，分子量為1.92MDa，分子量損失率為10.1％，蛋白/HA(g/g)＝0.0％。
實(shí)施例31)取500ml發(fā)酵液，含HA2.4g，分子量為2.14MDa。發(fā)酵液不稀釋2)發(fā)酵液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶2(v/v)，攪拌后得到纖維狀HA沉淀；3)加入0.1M氯化鈉至兩倍的發(fā)酵液體積，攪拌至沉淀溶解；4)在溶解液中加入3g/L的2號(hào)珍珠巖，3g/L的4號(hào)珍珠巖和2g/L的活性炭，攪拌兩小時(shí)后，用紙板過(guò)濾，得到初濾液。
5)在初濾液中加入氧化鋁，加量為HA∶氧化鋁＝1∶5(g/g)，另加入1～2g/L活性炭，攪拌2小時(shí)后，用紙板過(guò)濾得到濾液；6)向?yàn)V液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶2(v/v)，攪拌后得到HA沉淀7)此后可用純水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫(yī)用級(jí)HA干粉。
所得HA干粉2.2g，葡糖醛酸純度約45.9％，HA得率為92％，分子量為1.90MDa，分子量損失率為11.1％，蛋白/HA(g/g)＝0.0％。
權(quán)利要求
1.從微生物發(fā)酵液中分離提取透明質(zhì)酸的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)對(duì)含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液，通過(guò)氯代十六烷基吡啶進(jìn)行絡(luò)合或通過(guò)乙醇進(jìn)行醇沉；(2)收集絡(luò)合物或醇沉物，加入氯化鈉水溶液，絡(luò)合物或醇沉物的解離或溶解；(3)收集解離物或溶解物中的透明質(zhì)酸沉淀，用水溶解，干燥，獲得目標(biāo)產(chǎn)物；所說(shuō)的透明質(zhì)酸的分子量為1～3MDa。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)將含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液加水稀釋至透明質(zhì)酸的含量為0.3～0.5g/ml，然后加入氯代十六烷基吡啶；攪拌，絡(luò)合；(2)將步驟(1)的產(chǎn)物離心分離，收集固體絡(luò)合物；(3)加入濃度為0.4～1M的氯化鈉水溶液至原發(fā)酵液體積的0.9～1.1倍，絡(luò)合物解離，獲得HA溶液；(4)加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶2，體積比，攪拌，沉淀，得到纖維狀HA沉淀物；(5)加入0.1～0.2M氯化鈉至1.8～2.2倍的發(fā)酵液體積，攪拌至沉淀溶解；(6)在溶解液中加入珍珠巖和活性炭，攪拌，過(guò)濾，得到濾液；(7)向?yàn)V液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶1.5～2.5，體積比，攪拌后得到HA沉淀；(8)用水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫(yī)用級(jí)HA干粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，CPC與透明質(zhì)酸的重量比為HA∶CPC＝1∶1.5～1∶2.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的珍珠巖選自2號(hào)珍珠巖或4號(hào)珍珠巖中的一種以上，加入量為2～4g/L，活性炭的加入量為1.5～2.5g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)將含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液加水稀釋至透明質(zhì)酸的含量為0.3～0.5g/ml，然后加入氯代十六烷基吡啶；攪拌，絡(luò)合；(2)將步驟(1)的產(chǎn)物離心分離，收集固體絡(luò)合物；(3)加入0.4～1M的氯化鈉水溶液至1.8～2.2倍的原發(fā)酵液體積，絡(luò)合物解離，獲得HA溶液；(4)在步驟(3)的溶液中加入珍珠巖和活性炭，攪拌，過(guò)濾，收集濾液；(5)在濾液中加入氧化鋁，加量為HA∶氧化鋁＝1∶4～1∶8(g/g)，另加入1～2g/L活性炭，攪拌，過(guò)濾，收集濾液；(6)向?yàn)V液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶1.5～2.5，體積比，攪拌后得到HA沉淀；(7)用水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫(yī)用級(jí)HA干粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，CPC與透明質(zhì)酸的重量比為HA∶CPC＝1∶1.5～1∶2.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的珍珠巖選自2號(hào)珍珠巖或4號(hào)珍珠巖中的一種以上，加入量為2～4g/L，活性炭的加入量為1.5～2.5g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶1.5～2.5，體積比，攪拌后得到纖維狀HA沉淀；(2)加入0.1～0.2M的氯化鈉水溶液至1.8～2.2倍的原發(fā)酵液體積，攪拌，沉淀溶解；(3)在步驟(2)的溶液中加入珍珠巖和活性炭，攪拌，過(guò)濾，得到濾液；(4)在步驟(3)的濾液中加入氧化鋁，加量為HA∶氧化鋁＝1∶4～1∶8(g/g)，另加入1～2g/L活性炭，攪拌，過(guò)濾，收集濾液；(5)向?yàn)V液中加入乙醇，向?yàn)V液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶1.5～2.5，體積比，攪拌后得到HA沉淀；(6)用水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫(yī)用級(jí)HA干粉。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的珍珠巖選自2號(hào)珍珠巖或4號(hào)珍珠巖中的一種以上，加入量為2～4g/L，活性炭的加入量為1.5～2.5g/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從微生物發(fā)酵液中分離提取透明質(zhì)酸的方法，包括如下步驟(1)對(duì)含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液，通過(guò)氯代十六烷基吡啶進(jìn)行絡(luò)合或通過(guò)乙醇進(jìn)行醇沉；(2)收集絡(luò)合物或醇沉物，加入氯化鈉水溶液，絡(luò)合物或醇沉物的解離或溶解；(3)收集解離物或溶解物中的透明質(zhì)酸沉淀，用水溶解，干燥，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。采用簡(jiǎn)單的設(shè)備和簡(jiǎn)單的四步操作有序組合，就制得醫(yī)用級(jí)HA，且HA得率約90％，分子量損失率約15％，避免復(fù)雜的設(shè)備不利于放大或增加生產(chǎn)成本，無(wú)須繁瑣的步驟使HA得率降低，分子量損失率變大或大量使用有機(jī)溶劑增大成本，從而利于工業(yè)化放大生產(chǎn)透明質(zhì)酸。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101089021SQ200710043728
公開(kāi)日2007年12月19日 申請(qǐng)日期2007年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月12日
發(fā)明者譚文松, 胡怡虹, 張旭, 蔡海波 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)