專利名稱：一種低分子硫酸軟骨素制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體地說，是一種低分子硫酸軟骨素制備方法。
背景技術(shù)：
硫酸軟骨素是從動(dòng)物軟骨中提取的酸性粘多糖物質(zhì)，可提高脂肪酶活性加速乳糜微粒中高甘油三脂分 解成脂肪酸而澄清血液，還具有抗血栓形成，保護(hù)軟骨降解，預(yù)防老年性關(guān)節(jié)退行性疾病，維持關(guān)節(jié)健康， 抗風(fēng)濕等作用。低分子量硫酸軟骨素具有比天然分子量硫酸軟骨素更好的口服吸收率，在美國(guó)不僅做為藥 品用于治病，更多地做為高檔營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑進(jìn)行疾病預(yù)防，消費(fèi)群體從病人普及到一般人，口服劑量從0.8 克增加到1. 2克，需求量非常大。經(jīng)文本品
低分子量硫酸軟骨素生產(chǎn)常用的酸水解工藝，該方法的特異性差，脫硫酸基團(tuán)率高，生產(chǎn)成品率低， 不適合大規(guī)模生產(chǎn)用。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國(guó)專利《低分子量硫酸軟骨素的制備方法》(03114375. X)。該論 文通過利用動(dòng)物軟骨和/或市售普通大分子硫酸軟骨素為生產(chǎn)原料，經(jīng)過常規(guī)生產(chǎn)工藝、酸水解處理后， 應(yīng)用超濾膜進(jìn)行分子量截留、濃縮等特殊工藝，可以得到分子量低于10， 000道爾頓的硫酸軟骨素。雖然 該工藝采用超濾膜進(jìn)行分子量截留，但通過膜的低分子量硫酸軟骨素仍然處于酸性反應(yīng)環(huán)境被繼續(xù)降解， 未解決生產(chǎn)效率問題。因此，有必要開發(fā)高效率、低成本生產(chǎn)低分子量硫酸軟骨素的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種低分子量硫酸軟骨素制備方法，使其成本低，效率 高，大批量高效制備低分子量硫酸軟骨素。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明以酸性粘多糖酶裂解高分子量硫酸軟骨素，同時(shí)將生成的 低分子量硫酸軟骨素及時(shí)移除防止其進(jìn)一步裂解，從而得到高產(chǎn)率的低分子量硫酸軟骨素。
本發(fā)明包括以下步驟-
(1) 將酸性粘多糖酶加入的50mMTris/HCl含50mM醋酸鈉，pH 8. 0，含硫酸軟骨素底物濃度l mg/ml。 原料硫酸軟骨素的分子量為10000 - 60000 Da;
所述的步驟(1)中酸性粘多糖酶指透明質(zhì)酸酶，硫酸軟骨素酶，肝素酶裂解原料硫酸軟骨素； 所述的原料硫酸軟骨素指從各種動(dòng)物軟骨制備的硫酸軟骨素，原料純度可從36-95%。
(2) 酶解生成的低分子量硫酸軟骨素用截留分子量為5000Da的超濾膜及時(shí)移除，從而得到低分子量
硫酸軟骨素產(chǎn)品。
述的步驟(2)中，反應(yīng)條件為pH7. 5 — 9.0，醋酸鈉濃度為0.05—0.2M的緩沖液，溫度25-45'C。 本發(fā)明既克服了硫酸軟骨素酸水解工藝制備產(chǎn)品的分子量分布寬，產(chǎn)品得率低的缺點(diǎn)，可高效、大 批量制備低分子量硫酸軟骨素，得率80%以上。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
取IO g平均分子量為30000 Da的硫酸軟骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl和50 mM醋酸 鈉緩沖液，PH 8. 0，加入鏈霉菌屬透明質(zhì)酸酶0. 1 g,在3(TC條件下保溫20 min，然后在截留分子量為 3000Da的超濾系統(tǒng)中循環(huán)2 h,收集濾過液分析硫酸軟骨素平均分子量3600Da,分子量分布3000-5000Da之
間的產(chǎn)品產(chǎn)率8 g。 實(shí)施例2
取IO g平均分子量為30000 Da的硫酸軟骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl和50 mM醋酸 鈉緩沖液，PH 7.5,加入普通變形桿菌硫酸軟骨素酶ABC 0.2 g，在30。C條件下保溫20 min，然后在截留 分子量為3000Da的超濾系統(tǒng)中循環(huán)2 h，收集濾過液分析硫酸軟骨素平均分子量4200Da,分子量分布 3000-5000Da之間的產(chǎn)品產(chǎn)率7 g。
實(shí)施例3
取IO g平均分子量為30000 Da的硫酸軟骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl和50 mM醋酸 鈉緩沖液，PH 8. 5，加入肝素黃桿菌肝素酶0. 1 g，在3(TC條件下保溫20 min，然后在截留分子量為3000Da的超濾系統(tǒng)中循環(huán)2 h，收集濾過液分析硫酸軟骨素平均分子量3800Da，分子量分布3000-5000Da之間的產(chǎn)品產(chǎn)率6 g。實(shí)施例4
取IO g平均分子量為25000 Da的硫酸軟骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl和50 mM醋酸鈉緩沖液，PH8.5，加入羊睪丸透明質(zhì)酸酶0.3g,在3(TC條件下保溫20 min,然后在截留分子量為3000Da的超濾系統(tǒng)中循環(huán)2 h，收集濾過液分析硫酸軟骨素平均分子量4500Da,分子量分布3000-5000Da之間的產(chǎn)品產(chǎn)率6. 5 g。
實(shí)施例5
取IO g平均分子量為30000 Da的硫酸軟骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl和50 mM醋酸鈉緩沖液，PH 8. 0，加入牛睪丸透明質(zhì)酸酶0. 1 g，在25'C條件下保溫20 min，然后在截留分子量為3000Da的超濾系統(tǒng)中循環(huán)2 h,收集濾過液分析硫酸軟骨素平均分子量4500Da，分子量分布3000-5000Da之間的產(chǎn)品產(chǎn)率8. 5 g。
實(shí)施例6
取IO g平均分子量為30000 Da的硫酸軟骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl和50 mM醋酸鈉緩沖液，PH8.0，加入鞘胺醇桿菌肝素酶0.2g，在35'C條件下保溫20min,然后在截留分子量為3000Da的超濾系統(tǒng)中循環(huán)2 h，收集濾過液分析硫酸軟骨素平均分子量3500Da，分子量分布3000-5000Da之間的產(chǎn)品產(chǎn)率6. 3 g。
實(shí)施例7
取IO g平均分子量為30000 Da的硫酸軟骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl和50 mM醋酸鈉緩沖液，pH 8.0，加入肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶C 0.25 g，在45'C條件下保溫20 min,然后在截留分子量為3000Da的超濾系統(tǒng)中循環(huán)2 h，收集濾過液分析硫酸軟骨素平均分子量4200Da，分子量分布3000-5000Da之間的產(chǎn)品產(chǎn)率5. 0 g。
實(shí)施例8
取IO g平均分子量為30000 Da的硫酸軟骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl和50 mM醋酸鈉緩沖液，PH 8. 0，加入肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶AC 0. 5 g，在4(TC條件下保溫20 min，然后在截留分子量為3000Da的超濾系統(tǒng)中循環(huán)2 h，收集濾過液分析硫酸軟骨素平均分子量站OODa，分子量分布3000-5000Da之間的產(chǎn)品產(chǎn)率5. 5 g。
實(shí)施例9
取IO g平均分子量為30000 Da的硫酸軟骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl緩沖液，pH 8. 0，加入肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶B 0. 3 g，在3(TC條件下保溫20 min，然后在截留分子量為3000Da的超濾系統(tǒng)中循環(huán)2 h，收集濾過液分析硫酸軟骨素平均分子量3600Da，分子量分布3000-5000Da之間的產(chǎn)品產(chǎn)率6. 6g
實(shí)施例10
取IO g平均分子量為30000 Da的硫酸軟骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl 100 mM醋酸鈉緩沖液，pH 8.0,加入金黃節(jié)桿菌硫酸軟骨素酶AC 0.1 g，在3(TC條件下保溫20 min,然后在截留分子量為3000Da的超濾系統(tǒng)中循環(huán)2 h，收集濾過液分析硫酸軟骨素平均分子量4100Da,分子量分布3000-5000Da之間的產(chǎn)品產(chǎn)率7.6 g。
權(quán)利要求
1.一種低分子量硫酸軟骨素生產(chǎn)方法，包括(1)用酸性粘多糖水解酶裂解高分子量硫酸軟骨素，(2)用截留分子量為3000Da的超濾膜將生成的低分子量硫酸軟骨素及時(shí)濾除得到低分子量硫酸軟骨素。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的低分子量硫酸軟骨素生產(chǎn)方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶為肝素黃 桿菌肝素酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的低分子量硫酸軟骨素生產(chǎn)方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶為普通變 形桿菌硫酸軟骨素酶ABC。
4. 據(jù)權(quán)利要求l所述的低分子量硫酸軟骨素生產(chǎn)方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶為金黃節(jié)桿 菌硫酸軟骨素酶AC。
5. 據(jù)權(quán)利要求l所述的低分子量硫酸軟骨素生產(chǎn)方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶為肝素黃桿 菌硫酸軟骨素酶AC。
6. 據(jù)權(quán)利要求l所述的低分子量硫酸軟骨素生產(chǎn)方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶為肝素黃桿 菌硫酸軟骨素酶B。
7. 據(jù)權(quán)利要求l所述的低分子量硫酸軟骨素生產(chǎn)方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶為肝素黃桿 菌硫酸軟骨素酶C。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的低分子量硫酸軟骨素生產(chǎn)方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶為牛睪丸 透明質(zhì)酸酶。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的低分子量硫酸軟骨素生產(chǎn)方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶為羊睪丸 透明質(zhì)酸酶。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的低分子量硫酸軟骨素生產(chǎn)方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶為鞘胺 醇桿菌肝素酶。
11. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的低分子量硫酸軟骨素生產(chǎn)方法，反應(yīng)條件為pH7. 5 — 9. 0,醋酸鈉濃度為O. 05 —0. 2M的緩沖液。
12. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的低分子量硫酸軟骨素生產(chǎn)方法，反應(yīng)溫度25-45'C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種低分子量硫酸軟骨素生產(chǎn)方法，包括(1)用酸性粘多糖水解酶裂解高分子量硫酸軟骨素，(2)用截留分子量為5000Da的超濾膜將生成的低分子量硫酸軟骨素及時(shí)濾除得到低分子量硫酸軟骨素。該方法具有產(chǎn)品回收率高，產(chǎn)品質(zhì)量高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P19/14GK101659973SQ20081014685
公開日2010年3月3日 申請(qǐng)日期2008年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月26日
發(fā)明者徐佳珊, 徐崢嶸 申請(qǐng)人:徐崢嶸;徐佳珊