一種炎癥指標(biāo)檢測板及炎癥檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實(shí)用新型屬于免疫監(jiān)測技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種炎癥檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 炎癥是諸多疾病的征兆，是機(jī)體對外來物、病原體、組織損傷、自身免疫性疾病W 及其他有害刺激的保護(hù)性反應(yīng)。炎癥的表現(xiàn)包括；血管舒張、血管通透性增加、血液涌入、血 漿滲漏、嗜中性粒細(xì)胞和巨瞻細(xì)胞浸潤和活化涌入。該也是為什么炎癥往往伴隨著局部組 織發(fā)燒、紅腫等癥狀。炎癥反應(yīng)在限制外來物質(zhì)、吞瞻病原體和組織碎片中起重要作用。急 性炎癥是初始相位，是為了消除入侵的外來物質(zhì)、病原體和其他有害刺激；然而，如果刺激 持續(xù)存在，急性炎癥就會發(fā)展成慢性炎癥。在慢性炎癥過程中，組織會不停地被破壞、細(xì)胞 類型會被不斷被輪換。炎癥過程受多種細(xì)胞因子調(diào)控，而細(xì)胞因子的類型會因炎癥的原因， 位置和嚴(yán)重性而不同。因此，檢測細(xì)胞因子的類型和含量對理解炎癥及其背后的疾病有非 常重要的意義。
[0003] 降巧素原（procalcitonin，PCT)是診斷和監(jiān)測細(xì)菌性感染炎癥的特異性指標(biāo)。 PCT是一種蛋白質(zhì)，當(dāng)嚴(yán)重細(xì)菌、真菌、寄生蟲感染W(wǎng)及賊毒癥和多臟器功能衰竭時，它在血 漿中的水平升高。細(xì)菌內(nèi)毒素在誘導(dǎo)過程中擔(dān)任了至關(guān)重要的作用。
[0004] 白細(xì)胞介素-6(interle址in-6,比-6)作為一種細(xì)胞因子，是一種在白細(xì)胞或免 疫細(xì)胞間相互作用的淋己因子，可W鑒定急性炎癥。IL-6有刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生一系列急性 期蛋白的作用，參與炎癥反應(yīng)和發(fā)熱反應(yīng)，某些人體腫瘤細(xì)胞、特別是骨髓瘤細(xì)胞，可分泌 IL-6作為自身生長因子刺激其生長。
[000引 白細(xì)胞介素-18(interle址in-18,比-18)是從小鼠及人的肝細(xì)胞中克隆得到的 一種新的細(xì)胞因子，人的IL-18主要由單核-巨瞻細(xì)胞產(chǎn)生，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，可用 于鑒定自身免疫性炎癥。比-18可刺激Thl細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)Thl細(xì)胞增殖，誘 導(dǎo)調(diào)節(jié)Thl細(xì)胞的分化成熟和促進(jìn)Thl細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫反應(yīng)；并增強(qiáng)NK細(xì)胞的溶解活 性，既可促進(jìn)Fas-FasL配體介導(dǎo)的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活力，又可促進(jìn)穿孔素介導(dǎo)的NK細(xì)胞 對祀細(xì)胞傳統(tǒng)殺傷活性。
[0006] 干擾素（Interferon, IFN)是動物細(xì)胞在受到某些病毒感染后分泌的具有抗病毒 功能的宿主特異性糖蛋白。細(xì)胞感染病毒后分泌的干擾素能夠與周圍未感染的細(xì)胞上的相 關(guān)受體作用，促使該些細(xì)胞合成抗病毒蛋白防止進(jìn)一步的感染，從而起到抗病毒的作用。 干擾素-Y (Interferon-Y，IFN-y)是由免疫系統(tǒng)中的T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生的一種 水溶性二聚體細(xì)胞因子，是II型干擾素的唯一成員。最初叫巨瞻細(xì)胞活化因子。
[0007] 目前臨床上用于檢測判斷炎癥的指標(biāo)不多，而且是單項(xiàng)檢測，與疾病關(guān)聯(lián)的特異 性不強(qiáng)，比如，血液中白細(xì)胞升高被視為炎癥的金指標(biāo)，但對于分析什么類型炎癥，什么原 因引起的炎癥卻無能為力。因此，檢測是否有炎癥，并且?guī)椭治鲅装Y類型，比如：病毒性炎 癥、細(xì)菌性炎癥、急性炎癥、自身免疫疾病炎癥，非常有助于疾病的早期發(fā)現(xiàn)和診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本實(shí)用新型要解決的問題是提供一種炎癥指標(biāo)聯(lián)檢試劑盒，不僅適合于檢測是否 有炎癥，還能幫助分析炎癥類型，有助于疾病的早期發(fā)現(xiàn)和診斷。
[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本實(shí)用新型采用的技術(shù)方案是；一種炎癥指標(biāo)檢測板，檢測 板上設(shè)置由4列8行連排檢測孔組成的矩陣孔，矩陣孔的上方自左至右分別標(biāo)記有；PCT、 IL6、IL8、IFN-Y，矩陣孔的左邊自上而下分別標(biāo)記有：陽性對照、陰性對照、試樣1、試樣2、 試樣3、試樣4、試樣5、空白，矩陣孔自左至右縱列是分別經(jīng)過PCT、IL6、IL18、IFN-y4種指 標(biāo)蛋白或其抗體包被過的。
[0010] 一種炎癥檢測試劑盒，包括上述的檢測板、裝有組合反應(yīng)液的試劑管、裝有組合陽 性對照液的試劑管、裝有組合陰性對照液的試劑管，所述組合反應(yīng)液是同時含有2-4種能 與待測指標(biāo)蛋白結(jié)合的預(yù)標(biāo)記抗體混合液。
[0011] 進(jìn)一步的，所述組合反應(yīng)液是同時含有2-4種能與待測指標(biāo)蛋白結(jié)合的預(yù)標(biāo)記受 體蛋白混合液。
[0012] 進(jìn)一步的，所述待測指標(biāo)蛋白為；PCT、IL6、IL18、IFN-y。
[0013] 進(jìn)一步的，所述組合陽性對照液中各蛋白濃度為；500-10(K)pg/ml PCT，30-6化g/ ml比-6，150-300pg/ml比-18，130-260pg/ml IFN-y ;所述組合陰性對照液中各蛋白濃度 為；0-500pg/ml PCT，0-30pg/ml 比-6,0-150pg/ml 比-18,0-130pg/ml IFN-y。
[0014] 進(jìn)一步的，所述試劑盒中還包括裝有樣品稀釋液的試劑瓶、裝有顯色液的試劑管 及裝有洗涂液的試劑瓶。
[0015] 進(jìn)一步的，所述樣品稀釋液含0. 4%巧樣酸H軸的緩沖液，所述的緩沖液是PBS或 lO-lOOmM的磯酸緩沖液。
[0016] 一種制備上述炎癥檢測試劑盒的方法，其特征在于；包括如下步驟：
[0017] (1)制備檢測板；
[0018] (2)配制組合反應(yīng)液；
[0019] (3)配制組合蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品
[0020] 1)配制組合陽性對照液；
[0021] 2)配制組合陰性對照液；
[0022] (4)配制樣品稀釋液
[0023] 將巧樣酸H軸溶解于PBS緩沖液，調(diào)抑值至7. 4,制成含0. 4%巧樣酸H軸的PBS 緩沖液，分裝后低溫儲存?zhèn)溆茫?br>[0024] 妨配制顯色液
[00幼取TMB (3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺）20mg與100ml的10mM(pH4)巧樣酸緩沖液混 合，再加入3%過氧化氨溶液1ml，充分混勻后，分裝后避光低溫儲存?zhèn)溆谩?br>[002引 做配制洗涂液
[0027] 取PBS溶液1L，加入1ml吐溫20 (Tween20)，充分混勻，分裝后低溫儲存?zhèn)溆谩?br>[002引 （7)取上述步驟（1)-做所制備的檢測板1個、組合反應(yīng)液1管、組合陽性對照液 1管、組合陰性對照液1管、樣品稀釋液1瓶、顯色液1管、洗涂液1瓶，合裝于一個盒子內(nèi)， 得到炎癥檢測試劑盒。
[0029] 進(jìn)一步的，所述檢測板由如下步驟制備得到：
[0030] (1)制模，用透明聚丙帰或聚苯己帰塑料壓模制得，矩陣孔的上方自左至右分別標(biāo) 記檢測指標(biāo)蛋白名稱，矩陣孔的下方自左至右分別標(biāo)記數(shù)字編號，矩陣孔的左邊自上而下 分別標(biāo)記分組名稱；
[0031] (2)按照多克隆抗體制備方法、單克隆抗體制備方法或購買得到檢測指標(biāo)蛋白的 抗體，用0. 1M，pH = 8的Tris緩沖液分別將蛋白的特異抗體配制成濃度為1 y g/ml抗體包 被液；
[003引 做在檢測孔內(nèi)分別按照標(biāo)記的名稱添加100 上述抗體包被液，在室溫下賠育 化后，倒空板，用PBS沖洗各孔3次，然后，在各孔內(nèi)添加200 ill的2% BSA-PBS封閉 液，在室溫下賠育化，用PBS沖洗各孔3次，然后，在45C下干燥，將該檢測板抽真空密 封于鉛袋內(nèi)，儲存在低溫干燥冰箱備用。
[0033] 進(jìn)一步的，所述組合反應(yīng)液由如下步驟制備得到：
[0034] (1)將邸C、HRP、檢測指標(biāo)蛋白單克隆抗體按摩爾數(shù)20 ;1 ;1溶解于PBS緩沖液， 并在室溫反應(yīng)化；
[00巧]2)通過透析去除游離的邸C，進(jìn)一步通過HPLC純化獲得高純度HRP-檢測指標(biāo)蛋 白抗體偶聯(lián)物；
[0036] 3)分別制備得到HRP-PCT抗體偶聯(lián)物、HRP-IL6抗體偶聯(lián)物、HRP-IL18抗體偶聯(lián) 物、HRP-IFN- Y抗體偶聯(lián)物中的2-4種；
[0037] 4)取10ml含有1 % BSA的PBS溶液，逐個加入步驟3)中的HRP-PCT檢測指標(biāo)蛋 白抗體，充分混勻得到組合反應(yīng)液，分裝后低溫儲存?zhèn)溆谩?br>[003引進(jìn)一步的，所述組合蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品由如下步驟制備得到：
[0039] (1)配制組合陽性對照液；選用純化的并經(jīng)準(zhǔn)確定量的W下2-4種檢測指標(biāo)蛋白， 按照下述各蛋白濃度用含有1 % BSA的PBS溶液溶解配制而成，分裝后低溫儲存?zhèn)溆茫?蛋白濃度；PCT 500-1000pg/ml，比-630-60pg/ml，比-18150-300pg/ml, IFN- Y 130-260pg/ ml ；
[0040] (2)配制組合陰性對照液；選用純化的并經(jīng)準(zhǔn)確定量的w下2-4種檢測指標(biāo)蛋白， 按照下述各蛋白濃度用含有1% BSA的PBS溶液溶解配制而成，分裝后低溫儲存?zhèn)溆?，各?白濃度；PCT 0-500pg/ml，比-6〇-30pg/ml，比-18〇-150pg/ml, IFN-y〇-130pg/ml。
[0041] 本實(shí)用新型具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是；可在一次試驗(yàn)中同時檢測多個炎癥檢測指 標(biāo)，從而實(shí)現(xiàn)快速鑒別炎癥類型，而且使得所測得的各指標(biāo)的含量及其比例關(guān)系更具可比 性，因此能更準(zhǔn)確地用于鑒別炎癥類型及其關(guān)聯(lián)的疾病。
【附圖說明】
[0042] 圖1是本實(shí)用新型試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0043] 圖2是本實(shí)用新型的檢測板的正視圖；
[0044] 圖3是本實(shí)用新型實(shí)施例12中炎癥指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[004引圖1、圖2中；1.檢測板，2.檢測孔，3.裝有組合反應(yīng)液的試劑管，4.裝有組合陽 性對照液的試劑管，5.裝有組合陰性對照液的試劑管，6.裝有樣品稀釋液的試劑瓶，7.裝 有顯色液的試劑管，8.裝有洗涂液的試劑瓶。
【具體實(shí)施方式】
[0046] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本實(shí)用新型作進(jìn)一步說明，但不限定本實(shí)用新型的保護(hù)范 圍。
[0047] 實(shí)施例1
[0048] 一