一種水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及了一種水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測試紙條，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的快速檢測，適用于大量樣品的現(xiàn)場檢測、進(jìn)出口糧食的快速檢測與應(yīng)急處理，屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻白葉枯病菌(Xan thomonas oryzae p v.0ryzae)和水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.是黃單胞菌屬水稻黃單胞菌的不同致病變種。水稻白葉枯病是一種世界性病害，以亞洲稻區(qū)發(fā)生為重，水稻細(xì)菌性條斑病的危害僅次于水稻白葉枯病，主要發(fā)生在我國南部地區(qū)，是國內(nèi)重要的檢疫性病害。這兩種病害同時(shí)也被許多國家列為檢疫性有害生物，限制從這兩種病害的的疫區(qū)進(jìn)口水稻種子及稻米。因此，發(fā)展一種靈敏?；?、準(zhǔn)確便捷的同時(shí)可從水稻上檢測這兩種細(xì)菌的檢疫技術(shù)對(duì)國內(nèi)植物檢疫及我國水稻種子及稻米的出口均有重要意義。
[0003]對(duì)水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的檢測診斷方法包括野外觀察、生理生化鑒定、免疫學(xué)檢測和鑒定、以及PCR檢測技術(shù)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)和生物傳感技術(shù)也被用來檢測。但生化檢測技術(shù)耗時(shí)過長，且檢測結(jié)果存在不可靠性。PCR檢測技術(shù)相比具有很好的靈敏性與準(zhǔn)確性，但由于依賴于昂貴的儀器和專業(yè)的檢測人員，不適用于大量產(chǎn)品的快速檢測。ELISA檢測技術(shù)在檢測靈敏度上雖然不如PCR方法，但是具有檢測快速、批量、便宜的優(yōu)勢。而膠體金試紙條具有操作簡單、穩(wěn)定性高、不需要借助專門儀器、適合現(xiàn)場快速檢測的優(yōu)點(diǎn)
[0004]由于水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)帶來巨大威脅與損失，因此快速準(zhǔn)確的檢測方法顯得尤為重要。
【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0005]本實(shí)用新型目的在于提供一種檢測水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測試紙條，操作簡單，快速方便，靈敏度高，穩(wěn)定性好，成本低廉。
[0006]本實(shí)用新型適用于海關(guān)、糧倉、企業(yè)、檢驗(yàn)檢疫單位等，可實(shí)現(xiàn)大量糧食或種子樣本中水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的快速檢測。
[0007]本實(shí)用新型的技術(shù)方案，一種水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測試紙條，包括PVC底板，在PVC底板兩端分別設(shè)有樣品墊和吸水墊；
[0008]在PVC底板中部設(shè)置有硝酸纖維素膜檢測層，在硝酸纖維素膜檢測層與樣品墊之間設(shè)置有金標(biāo)墊；所述金標(biāo)墊一端與樣品墊相連接疊放，金標(biāo)墊另一端疊放于硝酸纖維素膜檢測層上；
[0009]所述硝酸纖維素膜檢測層上依次設(shè)置有檢測線和質(zhì)控線。
[0010]所述金標(biāo)墊上包被有金標(biāo)標(biāo)記群選性抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體(3D2)；
[0011]所述檢測線上包被有群選性抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體(4D11)；
[0012]所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠IgG。
[0013]所述水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測試紙條的制備方法，步驟如下:
[0014](I)抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的單克隆抗體的制備
[0015]單克隆抗體是采用水稻白葉枯病菌(NCPPB3002，來自湖南省進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局)菌體經(jīng)過特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)融合、篩選得到的。水稻白葉枯病菌NCPPB 3002菌體做為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周進(jìn)行首免，I X 18Cfu水稻白葉枯病菌NCPPB 3002菌體/只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第四周進(jìn)行二免，IX 18Cfu水稻白葉枯病菌NCPPB 3002菌體/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第六周進(jìn)行三免，IX 17 cfu水稻白葉枯病菌NCPPB 3002菌體/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第七周尾部采血測效價(jià)，分別挑選對(duì)水稻白葉枯病菌NCPPB 3002菌體效價(jià)最高的老鼠；第九周進(jìn)行沖刺免疫，I X 17Cfu水稻白葉枯病菌NCPPB3002菌體/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺免疫3天后分別眼眶采血后進(jìn)行融合、篩選，共篩選到10個(gè)細(xì)胞株；
[0016](2)群選性單克隆抗體的配對(duì)篩選
[0017]將步驟(I)中純化后的10株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行夾心法配對(duì)，確定群選性免疫膠體金快速檢測試紙條所需要的抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的群選性抗體；其中3D2為金標(biāo)抗體，4D11為包被抗體；
[0018](3)水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測試紙條的制備:
[0019]a、空白膠體金的制備:
[0020]采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，在錐形瓶中加入200mL去離子水和2mL 1%氯金酸，攪拌加熱至沸騰，快速加入4mL 1%朽1檬酸鈉,繼續(xù)加熱15~20min,至呈亮紅色,然后室溫中冷卻，4 C冷減保存；
[0021]b、膠體金標(biāo)記抗體的制備:
[0022]空白膠體金溶液用0.1M K2CO3調(diào)節(jié)pH值至7.4，攪拌中滴加適量濃度步驟(2)制備的抗體，每HiL膠體金加入30 μ g抗體3D2，繼續(xù)攪拌30 min,離心，吸取上清，用金標(biāo)抗體保存液(0.02mol/L磷酸鹽緩沖溶液)重旋；
[0023]C、金標(biāo)墊的制備:
[0024]調(diào)試三維平面點(diǎn)膜噴金儀儀器(HM3055)，將lmg/mL標(biāo)記好膠體金的抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體(3D2)均勻的噴在玻璃纖維膜上，噴液量0.6 μ L/cm,37°C烘干過夜，封袋備用；
[0025]d、包被膜的制備:
[0026]調(diào)試三維平面點(diǎn)膜噴金儀儀器(HM3055)，將lmg/mL抗水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌抗體(4D11)均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測線；將羊抗鼠IgG抗體均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線，噴液量均為0.6μ L /cm，37°C烘干過夜，封袋備用。
[0027]將PVC底板、樣品墊、金標(biāo)墊、涂有檢測線與質(zhì)控線的硝酸纖維素膜檢測層、和吸水墊組合，即得產(chǎn)品水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測試紙條。
[0028]其適用于海關(guān)、糧倉、企業(yè)、檢驗(yàn)檢疫單位等，可實(shí)現(xiàn)糧食或種子樣本中水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的快速檢測，最低檢測限分別為水稻白葉枯病菌為IXlO4cfu/mL和水稻細(xì)菌性條斑病菌IXlO5 cfu/mL。。
[0029]本實(shí)用新型試紙條的工作原理:采用膠體金免疫層析技術(shù)，選用水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌群選性抗體作為固相物，利用雙抗體夾心法原理檢測樣品中是否含有水稻白葉枯病菌和/或水稻細(xì)菌性條斑病菌。當(dāng)待檢樣品中含有水稻白葉枯病菌和/或水稻細(xì)菌性條斑病菌時(shí),抗原先和膠體金標(biāo)記的群選性抗病菌抗體(3D2)結(jié)合，由于層析作用復(fù)合物沿包被膜向前移動(dòng)，當(dāng)遇到檢測線上的群選性抗病菌抗體(4D11)時(shí)，形成抗體-抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物，在檢測線上富集，形成紅色沉淀線。
[0030]與其他檢測方法相比，免疫膠體金檢測技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):1、迅速；2、靈敏度高；3、成本低廉；4、安全簡便。
[0031]本實(shí)用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0032]1.檢測速度快，全過程只需要5 min即可，可以試驗(yàn)大批量樣品的快速檢測；
[0033]2.靈敏度高，最低檢測限分別為I X 104cfu/mL和I X 105cfu/mL ；
[0034]3.操作簡便，無需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，易于推廣；
[0035]4.不需要儀器，適合現(xiàn)場檢測；
[0036]5.過程簡單,直接上樣檢測,樣本量少。
【附圖說明】
[0037]圖1本實(shí)用新型水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測試紙條結(jié)構(gòu)示意圖正視圖；
[0038]圖2本實(shí)用新型水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠體金快速檢測試紙條結(jié)構(gòu)示意圖俯視圖；
[0039]附圖標(biāo)記說明:1、PVC底板；2、硝酸纖維素膜檢測層；3、樣品墊；4、金標(biāo)墊；5、檢測線(T線)；6、質(zhì)控線(C線)；7、吸水墊。
[0040]圖3本實(shí)用新型水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的二合一免疫膠