一種牛奶和奶粉中氰化物含量的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全檢測技術領域，具體涉及一種牛奶和奶粉中氰化物含量的檢測方法。
【背景技術】
[0002]氰化物是一類常見劇毒物質，常見無機氰化物包括氰化鈉、氰化鉀和氰化氫等，氰化物進入機體后分解出氰離子(CN—)，抑制組織細胞內多種酶的活性，致使細胞不能利用氧，從而產生細胞內窒息，導致中樞性呼吸衰竭而死亡。我國國家標準“GB 5749-2006生活飲用水衛(wèi)生標準”中規(guī)定氰化物的限量為0.05mg/L。國外對食品中氰化物有更加詳細和嚴格的限量要求，例如俄羅斯規(guī)定飲用水中氰化物限量為0.035mg/L，歐盟除規(guī)定飲用水中氰化物限量為0.05mg/L外，還對多種食品基質提出限量要求:罐裝核果為5mg/kg，飲料等其他食品為lmg/kg。
[0003]2015年天津濱海新區(qū)爆炸事故以來，劇毒的氰化物引起了人們的廣泛關注，除大氣、水體等環(huán)境介質中的氰化物污染外，食品中氰化物的潛在危害也不容忽視。牛奶和奶粉中氰化物的污染及其對人體潛在的健康風險引起了乳品生產企業(yè)及老百姓的廣泛關注和高度重視。
[0004]氰化物檢測方法已有標準和文獻報道:國標GB/T5750.5第四部分規(guī)定了采用氯胺T衍生，生成氯化氰再與異煙酸-吡唑酮作用，生成藍色染料，比色法測定水中氰化物的含量;GB/T13084-2006飼料中氰化物的測定采用相同原理，先將樣品水解蒸餾后，再進行衍生和測定;食品安全國家標準“食品中氰化物測定”(征求意見稿)采用氯胺T將氰化物衍生為氯化氰，直接采用頂空氣相色譜法進行檢測，方法簡單快速;張學等人采用氯胺T衍生，結合吹掃捕集-氣相色譜-質譜法測定了生活飲用水中的氰化物。然而，上述方法在氰化物檢測中有一共性問題，即不能排除硫氰酸鹽的干擾，采用氯胺T衍生的方法，硫氰酸鹽同樣可以生成氯化氰，所以采用上述方法檢測的是硫氰酸鹽和氰化物的總量，不能獲得準確的氰化物含量。眾所周知，牛奶和奶粉中普遍存在硫氰酸鹽，上述方法不適用于其中氰化物含量的檢測。
[0005]采用五氟芐基溴相轉移催化衍生的原理，可以區(qū)分硫氰酸鹽和氰化物，目前該原理在國內外已應用于水、尿樣和血液等樣品中氰化物的檢測。魏萬里采用該原理結合氣相色譜-串聯(lián)質譜法檢測了生物檢材中的無機氰化物;Su-Hwei Chen等采用氣相色譜-電子俘獲檢測法同時測定了人體尿樣和唾液中的氰化物，碘化物、硝酸鹽、硫酸鹽和硫氰酸鹽等。Buddha D.Paul等人采用氣相色譜質譜法檢測了人體唾液中的的氰化物。Raj K.Bhandari等人采用化學源電離-氣相色譜質譜法測定了人體血漿樣品中的氰化物。然而，由于牛奶和奶粉中含有大量蛋白、脂肪等物質，從前處理到儀器分析，對氰化物測定都產生嚴重干擾，導致目前該原理尚未應用于乳品中氰化物的檢測。
[0006]綜上所述，目前關于牛奶和奶粉中氰化物檢測方法的研究尚未見報道。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種牛奶和奶粉中氰化物的檢測方法。
[0008]本發(fā)明提供一種牛奶和奶粉中氰化物的檢測方法，采用十八烷基三甲基溴化銨作為相轉移催化劑和蛋白沉淀劑，五氟芐基溴(PFB-Br)為衍生試劑，氣相色譜-串聯(lián)四級桿質譜法進行檢測。
[0009]所述檢測方法具體包括以下步驟:
[0010](I)取牛奶樣品(奶粉樣品使用去離子水按照1:10(m/v)的比例進行稀釋，混勻)，加入適量的氫氧化鉀溶液調節(jié)其pH值為10左右，然后加入十八燒基三甲基溴化錢溶液和五氟芐基溴-二氯甲烷溶液，混勻后在水浴條件下衍生反應；
[0011](2)離心后取下層有機相，過有機相濾膜后的待測溶液轉移至進樣瓶中，進行氣相色譜-串聯(lián)質譜(GC-MS/MS)檢測；
[0012](3)將樣品檢測結果通過外標法和氰化物基質標準曲線進行比對，計算樣品中氰化物的含量。
[0013]所述檢測方法的步驟(I)具體參數(shù)為:
[0014]I)氫氧化鉀溶液濃度0.1mol/L，
[0015]2)十八烷基三甲基溴化銨(0.05moI/L)溶液:牛奶樣本的比例為，1:5(v/v)，
[0016]3)五氟芐基溴-二氯甲烷(0.4%，v/v)溶液:牛奶樣本的比例為，1:1 (v/v)，
[0017]4)通過在渦旋混勻器上渦旋2min混勻；
[0018]5)衍生反應條件為30°C水浴30min。
[0019]所述的檢測方法的步驟(2)具體參數(shù)為:
[0020]I)離心轉速 10000r/min，溫度 4°C，時間 15min;
[0021]2)用注射器取下層有機相；
[0022]3)有機相濾膜為0.45μπι孔徑。
[0023]所述GC-MS/MS分析條件如下:
[0024](I)色譜分離條件:
[0025]色譜柱:DB-5MS毛細管柱(30mX 0.25mm X 0.25ym)；
[0026]程序升溫:初始溫度50°C，保持lmin，然后以20°C/min升至250°C，保持3min。
[0027]柱流量:I.2mL/min;
[0028]進樣口溫度:250 °C ;
[0029]載氣:高純氦(純度不低于99.999%);
[0030]進樣方式:不分流進樣；
[0031]進樣量:1.0yL。
[0032](2)質譜檢測條件:
[0033]離子源為EI源；
[0034]傳輸線溫度250Γ ;
[0035]離子源溫度230Γ ;
[0036]溶劑延遲4.0min;
[0037]碰撞氣為氬氣；
[0038]氰根離子(CN—)衍生產物五氟苯基乙腈(PFB-CN)的保留時間為5.49min;
[0039]定量離子對及對應的碰撞電壓分別為207>157，15eV;
[0040]輔助定性離子對及對應的碰撞電壓分別為207>188，10eV。
[0041]所述的氰化物基質標準曲線的制備方法為:
[0042]I)取多份牛奶樣品，向其中分別加入適量氰化物標準，混勻，使得其中氰化物為梯度濃度，所述濃度梯度優(yōu)選為0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.011^/1;
[0043]2)按照前述方法步驟(I)和(2)的操作進行標準品的衍生、分離和檢測，得基質標準曲線。
[0044]所述的外標法為:
[0045]I)將前述方法步驟(2)中獲得的待測溶液進行GC-MS/MS檢測，得到樣品中氰化物峰面積；
[0046]2)采用所述基質標準曲線進行定量，得到樣品溶液中氰化物含量，從而計算得到樣品中氰化物的含量。
[0047]本發(fā)明具有以下特點:
[0048]該方法前處理操作簡單，四級桿串聯(lián)質譜檢測(MS/MS)具有極高的選擇性和靈敏度。因此，發(fā)明一種快速高效的牛奶和奶粉中氰化物檢測的分析方法是十分必要的。
[0049](—)本發(fā)明采用五氟芐基溴衍生的原理，可以避免硫氰酸鹽對氰化物檢測的干擾，使得樣品中氰化物測定準確可靠。衍生原理如下:樣品中的氰根離子在相轉移催化劑的作用下，從水相進入二氯甲烷有機相，與有機相中的五氟芐基溴發(fā)生反應，生成反應產物PFB-CN(圖1)，該化合物具有較強揮發(fā)性，可以通過氣相色譜進行分離和檢測。
[0050](二)本發(fā)明采用MS/MS檢測，根據(jù)氰化物衍生產物PFB-CN的質譜圖(圖2)，選定了特征母離子為207，在不同碰撞電壓下將其打碎，獲得優(yōu)化的子離子和對應碰撞能量。最終在多離子反應監(jiān)測(MRM)模式下，采用兩組離子對(圖3)對PFB-CN進行定性和定量檢測。MS/MS具有極高的靈敏度和選擇性，能夠降低或消除復雜樣品基質對氰化物檢測的影響，獲得良好的峰形和較低的檢出限。
[0051](三)本發(fā)明最大的創(chuàng)新之處在于選取了一種合適的相轉移催化劑:十八烷基三甲基溴化銨。該試劑在優(yōu)化的用量條件下，不僅可以起到催化衍生反應的作用，還可以同時起到蛋白沉淀的作用，在高速離心的條件下，能將蛋白質沉淀于水相和有機相之間，形成類似于“奶片”的中間夾層，下層有機相則不會受到影響，分層良好。該試劑在催化衍生反應同時，起到了樣品凈化的作用，不僅使五氟芐基溴衍生原理的分析方法在乳制品氰化物檢測中得到實現(xiàn)，還極大地簡化了樣品處理的操作步驟，提高了分析效率。
[0052]本發(fā)明對比了不同的相轉移催化劑的催化效果及對目標物分離凈化的影響，結果表明，使用十八烷基三甲基溴化銨，不僅可以取得良好的催化效果，而且與其它常用的相轉移催化劑(如四丁基溴化銨)比較，前者更有利于離心后有機相和水相的分層(圖4)。進一步對十八烷基三甲基溴化銨的用量進行了考察，結果表明:隨該試劑用量增加，有機相和水相的分層效果越來越好(圖5)，當十八烷基三甲基溴化銨(0.05mol/L)用量達到400yL時，有機相和水相分層良好，下層有機相可以直接取出后過濾和進樣分析，極大地簡化了樣品前處理流程。
【附圖說明】
[0053]圖1是氰根離子(CN-)經(jīng)五氟芐基溴(PFB-Br)衍生為五氟苯基乙腈(PFB-CN)的原理示意圖。
[0054]圖2是PFB-CN的GC-MS—級質譜圖。
[0055]圖3是PFB-CN定量和定性離子對的多離子反應監(jiān)測(MRM)色譜圖。
[0056]圖4是使用不同相轉移催化劑條件下有機相和水相分層效果對比圖:A-四丁基溴化銨;B-十八烷基三甲基溴化銨。
[0057]圖5是添加不同含量的十八烷基三甲基溴化銨條件下有機相和水相分層效果對比圖:自左至右添加量分別為50yL，