一種hplc-ms/ms同時測定6種水溶性維生素含量的方法
【技術領域】
[00011本發(fā)明涉及維生素含量的測定方法，特別涉及一種HPLC-MS/MS同時測定6種水溶 性維生素含量的方法。
【背景技術】
[0002] 維生素是維持生命活動所必需的一種有機化合物，在生長、代謝和發(fā)育過程中發(fā) 揮著重要作用。隨著畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖的逐漸規(guī)模化，為了滿足日益增長的畜禽 消費需求，畜禽的營養(yǎng)和健康越來越受到關注。維生素作為一種重要的維持動物機體健康 的物質(zhì)，在畜禽飼料中是不可或缺的。飼料中的各種維生素的量必須達到動物體的需要量， 才能保證動物的健康生長和生產(chǎn)產(chǎn)品，如果缺少或不足將引起特殊的缺失綜合征。目前已 有13種物質(zhì)或物質(zhì)群被普遍認為是維生素，根據(jù)溶解度，可將其分為脂溶性維生素和水溶 性維生素。水溶性維生素其結(jié)構(gòu)差異大，化學性質(zhì)不穩(wěn)定，分離檢測存在困難。水溶性維生 素主要包括硫胺素（VBD、核黃素（VB 2)、煙酸（VB3)、吡哆醇（VB6)、生物素（VB7)、鈷胺素 (VB 12)等。
[0003] 現(xiàn)有的水溶性維生素含量的測定方法有光度法、微生物法、酶標法等，多以單一維 生素測定為主，且步驟繁瑣，檢測周期長，操作費時;其中一些方法受干擾因素影響大，靈敏 度低，無法滿足對維生素快速準確檢測的實際需求。隨著科技的發(fā)展，儀器精密度越來越 高，建立了高效液相色譜法，但高效液相色譜法可同時測定的水溶性維生素種類偏少，許多 需要使用離子對試劑，易造成性質(zhì)相近的維生素保留時間和洗脫順序發(fā)生變化，影響測定 結(jié)果的準確性和重現(xiàn)性。國標中規(guī)定的水溶性維生素的檢測方法，樣品前處理繁瑣耗時，針 對飼料中的含量低于20mg/kg水溶性維生素無法檢測，并且干擾較大，試劑配制繁瑣。因此， 提供一種能準確、便捷、快速地測定飼料中多種維生素含量的方法，才能滿足生活生產(chǎn)中對 維生素快速準確檢測的實際需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有使用HPLC-MS/MS測定維生素含量的測定技術中存在 同時測定維生素種類少的不足，提供一種HPLC-MS/MS同時測定6種水溶性維生素含量的方 法。該方法通過提高待測維生素的響應值和提高色譜儀對維生素的分離效果來達到使用 HPLC-MS/MS同時測定6種維生素含量的目的，測定精度高、速度快、操作方便。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種HPLC-MS/MS同時測定6種水溶性維生 素含量的方法，其具體步驟如下： 1、 待測料和標準樣品的預處理:稱取適量待測料，將待測料依次經(jīng)過乙酸銨溶液溶解、 超聲提取、冷卻定容、離心、過濾得待測樣品；準確稱取適量的硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆 醇、生物素、鈷胺素標準品配制成標準物質(zhì)工作液； 2、 選定HPLC-MS/MS檢測條件，將步驟1得到的標準物質(zhì)工作液和待測樣品分別用HPLC-MS/MS進行檢測，分別得到色譜圖和質(zhì)譜圖； 3、將步驟2得到的色譜圖和質(zhì)譜圖進行處理，對6種維生素進行定性和定量，分別得到 待測樣品的中6種維生素質(zhì)量濃度，然后計算得到待測樣品中6中維生素的含量。
[0006] 上述一種HPLC-MS/MS同時測定6種水溶性維生素含量的方法，其中步驟1所述的待 測料為畜禽飼料，包括仔豬料、育肥豬料、肉仔雞料、蛋雞料、肉鴨料等。畜禽飼料中不僅含 有多種水溶性維生素，還含有蛋白質(zhì)、脂肪等干擾物質(zhì)，且含有的水溶性維生素含量低。
[0007] 上述一種HPLC-MS/MS同時測定6種水溶性維生素含量的方法，其中步驟1所述的乙 酸銨溶液濃度為〇. 〇2mol/L，pH值為4，采用乙酸作為pH調(diào)節(jié)劑。該濃度和pH下的乙酸銨溶液 中溶解的6種維生素，不僅穩(wěn)定性最好，不易變質(zhì)，日間重現(xiàn)性好，而且該6種維生素的響應 值同時都達到最大，有利于檢測時干擾信號的排除和維生素的信號的捕捉。
[0008] 上述一種HPLC-MS/MS同時測定6種水溶性維生素含量的方法，其中步驟1中超聲提 取的時間為15_25min，時間過長，飼料中其他較難溶解的物質(zhì)也會溶解在溶劑中，對色譜和 質(zhì)譜的檢測造成干擾，嚴重影響測量結(jié)果，時間過短，飼料中的維生素溶解、提取不完全，測 定的含量不準確;其中，優(yōu)選的，超聲提取的時間為20min，即能使飼料中的維生素完全溶解 在溶劑中，又能使溶劑中的雜質(zhì)溶解量在一個合適的范圍，對測定結(jié)果影響最小。
[0009] 上述一種HPLC-MS/MS同時測定6種水溶性維生素含量的方法，其中步驟1所述的過 濾采用0.22μπι的水相過濾膜，能過濾溶液中大部分的雜質(zhì)，減小對測定結(jié)果影響，且過濾速 度較快。
[0010]上述一種HPLC-MS/MS同時測定6種水溶性維生素含量的方法，其中步驟1所述的標 準樣品的處理方法為： a、 準確稱取適量的硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、鈷胺素標準品，用0.02mol/ L、pH=4.0的乙酸銨分別配制成質(zhì)量濃度為1000.0 mg/L的標準溶液； b、 準確分別移取適量標準溶液進行混合，并配置成標準工作中間液，在標準工作中間 液中VB!、VB3質(zhì)量濃度為lmg/L，VB 2、VB?、VB12質(zhì)量濃度為1 Omg/L，VB6質(zhì)量濃度為0 · 5mg/L; c、 吸取一定體積的標準物質(zhì)工作中間液，配成質(zhì)量濃度以VB6計，分別為1、2、5、10、 20ng/ml的5種濃度的標準物質(zhì)工作液。
[0011] 上述一種HPLC-MS/MS同時測定6種水溶性維生素含量的方法，其中所述液相色譜 條件為： 色譜柱：Capce 11 PAKADME (2 · lmml · D X 150mm，3μπι); Capce 11 PAKADME(2 · lmml · D X 150πιπι，3μπι)的色譜柱對該6種維生素具有最好的保留性，才能將該6種維生素進行分離、識 別和測定，選擇其他的色譜柱都不能達到該效果； 流速:. 2-0.4mT J min； 柱溫:30-40 °C; 樣品溫度:10-15°C; 進樣量:5yL; 流動相A:甲酸的體積分數(shù)為0.1%的甲醇溶液，流動相B:0.02mol/L乙酸銨溶液，采用梯 度洗脫程序，流速為0 · 3mL/min，梯度條件為：100%B; 0~12min，100%~10%B; 12-14min，10% B; 14. Olmin，100%B;在該條件下，測定時對6種維生素的干擾因素最小，6種維生素的響應值 最大，有利于對6種維生素進行分離、識別和測定。
[0012] 上述一種HPLC-MS/MS同時測定6種水溶性維生素含量的方法，其中所述質(zhì)譜條件 為： 離子源：電噴霧離子源正離子模式(ESI+); 監(jiān)測方式:多反應檢測(MRM); 干燥氣溫度:325°C; 干燥氣流速:9L/min; 霧化氣壓力:45psi; 鞘氣溫度:300 °C; 鞘氣流速:llL/min; 毛細管電壓：3500V; 噴嘴電壓:500V; 其中，采用甲醇分別對6種水溶性維生素標準樣品進行母離子、子離子全掃描，條件如 下：
[0013] 上述一種HPLC-MS/MS同時測定6種水溶性維生素含量的方法，其中所述色譜圖和 質(zhì)譜圖的處理方法為： 定性:通過色譜圖和質(zhì)譜圖中保留時間的對比，特征峰的對比，并通過與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對 比，準確定性6種維生素； 定量:選擇任一維生素色譜圖和質(zhì)譜圖，通過調(diào)整y軸截距(X = x+b/a)，由線性方程y = ax+b得到校正方程y = aX，y代表峰面積，X代表待測樣品中該維生素的濃度;通過對標準物 質(zhì)工作液的上機測試，得到該維生素的峰面積，并根據(jù)校正方程和稀釋倍數(shù)計算出待測樣 品中該維生素的濃度，平行測定6次(n = 6)，可以得到待測樣品中該維生素的濃度X。
[0014]上述一種HPLC-MS/MS同時測定6種水溶性維生素含量的方法，其中所述計算待測 樣品的含量的方法為:將得到的待測樣品維生素濃度X代入計算式M=(XXV)/m中計算得到； 其中X為待測樣品維生素濃度，單位為微克每升(yg/L);V為待測樣品最終定容體積，單位為 毫升(mL);m為待測樣品稱取的質(zhì)量，單位為克(g);M為待測樣品含量，單位為微克每千克(μ g/kg)。
[0015] 一種HPLC-MS/MS同時測定6種水溶性維生素含量的方法，該方法為了能同時測定 出飼料中硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、鈷胺素六種維生素的含量，采用濃度為 0.0 2mo 1 /L、pΗ為4的乙酸銨溶液對飼料中的維生素進行提取并使用Capc e 11 PAKADME (2. lmml .DX 150mm，3ym)的色譜柱進行檢測的方法，兩者共同作用才能達到同時測定出硫 胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、鈷胺素六種維生素的含量的效果;濃度為〇.〇2mol/L、 pH為4的乙酸銨溶液能使硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、鈷胺素六種維生素在檢測 過程中響應值都達到最大，有利于在檢測時維生素信號的捕捉，而Capcell PAKADME (2.1 mm I. D X 15 0mm，3μπι)的色譜柱同時對硫胺素、核黃素、煙酸、P比咳醇、生物素、鈷胺素六 種維生素具有最好的保留性，能準確分離，從而有利于識別和測定;該測定方法具有能同時 測定出硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、鈷胺素六種維生素的含量的特點，且測定精 度高、速度快、操作方便。
[0016] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的顯著區(qū)別和有益效果： 1、本發(fā)明方法使用濃度為0. 〇2mo 1/L、pH為4的乙酸銨溶液對飼料中的維生素進行提 取，使硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、鈷胺素六種維生素的響應值同時都達到最大， 有利于檢測時干擾信號的排除和維生素的信號的捕捉。
[0017] 2、本發(fā)明方法使用Capcell PAKADME(2.1mmI.DX150mm，3ym)的色譜柱進行檢測， 對硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、鈷胺素六種維生素具有最好的保留性，能準確分 離，從而有利于識別和測定。
[0018] 3、本發(fā)明方法能同時測定硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、鈷胺素六種維生 素的含量，測定精度高、速度快、操作方便。
[0019]
【附圖說明】： 圖1為本發(fā)明6種水溶性維生素全掃描的質(zhì)譜圖。
[0020] 圖2為本發(fā)明VB3標準曲線及相關