檢測鄰苯二甲酸二丁酯的試劑盒制備及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種用于定量檢測牛奶中的鄰苯二甲酸二 丁酯殘留量的ELISA試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸二丁酯（DBP)是一種無色、有芳香氣味的油狀液體，蒸氣壓較低，易溶 于乙醇、乙醚、丙酮和苯等有機(jī)溶劑。鄰苯二甲酸二丁酯主要用作硝化纖維、醋酸纖維、聚 氯乙烯等的增塑劑，可使制品具有良好的柔軟性，但因其和聚氯乙烯等塑料產(chǎn)品之間并非 直接結(jié)合，而是由于范德華力和氫鍵等結(jié)合在一起，因此，易揮發(fā)進(jìn)入環(huán)境造成污染，當(dāng)前 已在大部分生物介質(zhì)和生物體中發(fā)現(xiàn)了 DBP的存在。有研究顯示，人體血液中已普遍發(fā)現(xiàn) 了 DBP的存在。各項研究表明，DBP給人類帶來越來越多的危害，造成的嚴(yán)重影響已經(jīng)逐漸 引起人們的重視。目如有關(guān)DBP的毒性研究引起人們最大關(guān)注的是DBP的生殖毒性和發(fā)育 毒性。研究表明，DBP可致雄性嚙齒類動物睪丸標(biāo)志酶活性下降、重量減輕、曲細(xì)精管變性 萎縮、生殖道畸形等人體接觸DBP的含量主要有空氣、食物、飲水以及化妝品，長期接觸DBP 可使人患多發(fā)性神經(jīng)炎，脊髓神經(jīng)炎及腦多發(fā)神經(jīng)炎等癥狀，誤食過量DBP，可出現(xiàn)惡心、嘔 吐、頭昏頭痛及眼部刺激等可逆性癥狀。隨著工業(yè)現(xiàn)代化的發(fā)展，DBP被廣泛應(yīng)用在塑料、 油漆、涂料、香料等產(chǎn)品中，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，僅國內(nèi)DBP -年使用量就達(dá)170萬噸。然而，作 為一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，隨著時間不斷推移，DBP逐漸從各種物質(zhì)中釋放出來，遷移至水 體、土壤、人體中，對人類造成極大的威脅和傷害。有研究發(fā)現(xiàn)，DBP具有一定的致癌、致畸、 免疫抑制作用和神經(jīng)毒性，尤其對人類生殖健康影響較大，DBP可影響雄性動物精液量、精 于數(shù)量、精子活性，對后代生殖發(fā)育具有較大危害。近年來，DBP安全問題已經(jīng)越來越多的 引起衛(wèi)生安全部門的重視。
[0003] 當(dāng)前有關(guān)DBP含量的檢測方法較多，主要有GC、HPLC、LC. MS、GC. MS等方法，國 內(nèi)主要集中在GC和HPLC方法，雖然檢測DBP含量的技術(shù)近些年已逐漸成熟，但此類方法大 多成本較高，且操作相對繁瑣，如何建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏、成本低廉的檢測方法已經(jīng)成 為當(dāng)前DBP檢測的首要問題。本研究旨在通過制備DBP單克隆抗體檢測食品中DBP含量， 建立一種快速、高效、準(zhǔn)確、靈敏且經(jīng)濟(jì)的檢測DBP含量的方法，可有效滿足當(dāng)前DBP含量檢 測的需要，將具有非常廣闊的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了檢測鄰苯二甲酸二丁酯的ELISA試劑 盒，其檢測靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡便、特異性強(qiáng)，遁川于人批樣*W-的儉測。本發(fā)明提供了 檢測鄰苯二甲酸二丁酯的ELISA試劑盒的制備及檢測方法。
[0005] 檢測鄰苯二甲酸二丁酯的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，包括酶標(biāo)板、鄰苯二 甲酸二丁酯的ELISA標(biāo)準(zhǔn)品、鄰苯二甲酸二丁酯的ELISA抗體工作液、鄰苯二甲酸二丁酯酶 標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液利濃縮洗滌液。
[0006] 檢測鄰苯二甲酸二丁酯的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，包括以下步驟：酶標(biāo) 板的制備、鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)準(zhǔn)品的制作、鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體及其工作液的 制備、鄰苯二甲酸二丁酯酶標(biāo)二抗工作液的制備、洗滌液的制備、底物液A的制備、底物液B 的制備、終止液的制備。
[0007] 其進(jìn)一步特征在于：所述的鄰苯二甲酸二丁酯包被抗原是將鄰苯二甲酸二丁酯 半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的，該載體蛋白為雞卵清白白蛋白（0VA)，用0. 2mol/L Na2C03 8mL，與0. 2mol/L NaHC03 17mL混合，再加75mL雙蒸水，調(diào)pH值到9. 6的碳酸鹽（CBS)緩 沖液作為包被液，將〇. 2mol/L Na2C03 8mL，與0. 2mol/L NaHC03 17mL混合，再加75mL雙蒸 水，調(diào)pH值到9. 6的碳酸鹽（CBS)緩沖液作為包被液，抗原稀釋成1 :4000比例，100 uL/ 孔，37°C放置2 h，取出酶標(biāo)板拍掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 uL/孔，洗板2次， 30 s/次；然后加入10%牛血清白蛋白（BSA)封閉，180 u L/孔，37°C放置1.5h，棄去封閉 液，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間（25°C)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4°C下保 存。
[0008] 所述的鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為0 ng/mL、0· 5ng/mL、Ing/mL、 1.5ng/mL、2ng/ml、2. 5ng/mL〇
[0009] 鄰苯二甲酸二丁酯蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克降抗體工作液的制備：采用鄰苯二甲酸二丁 酯人工抗原免疫鼠所得到，該抗體工作液用抗體稀釋液稀釋成1 :16000。
[0010] 所述鄰苯二甲酸二丁酯酶標(biāo)二抗工作液的制備：用酶標(biāo)二抗稀釋液稀釋成1 : 33000。所述底物液A為含有0. 5mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖溶液；所 述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為2mol/L的硫酸；所述濃縮洗滌液 是10倍濃縮洗滌液，其包含0. 5%吐溫-20,0. 01 mol/L的PBST，pH值范圍為7. 0-7. 5之 間。
[0011] 鄰苯二甲酸二丁酯的ELISA試劑盒的檢測方法，基于抗原抗體進(jìn)行間接競爭酶聯(lián) 免疫反應(yīng)，該方法包括以下步驟： (1) 預(yù)處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機(jī)溶劑提取待測樣 品，并將其復(fù)溶于樣品稀釋液工作液中； (2) 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20~25°C )平衡30 min以上，注意每 種液體試劑使用前均須搖勻； (3) 取包被有鄰苯二甲酸二丁酯抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50uL/孔到對應(yīng)的微孔 中，加入鄰苯二甲酸二丁酯抗體工作液，50uL/孔，反應(yīng)30 min ; (4) 再加入鄰苯二甲酸二丁酯酶標(biāo)二抗工作液，100u L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋 板后置室溫25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min ; (5) 小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液260 u L/孔，充分洗滌4-5次，每 次間隔10 s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡用未使用過的槍頭戳破）； (6) 加入底物液A 50 u L/孔，底物液B 50 u L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置 25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15min ; (7) 加入終止液50 u L/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長 450/630nm檢測，測定每孔吸光度值（請在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）； (8) 以標(biāo)準(zhǔn)品測試的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計 算樣品中鄰苯二甲酸二丁酯的含量。
[0012] 其中所述處理后的樣品經(jīng)過以下處理的樣品： 稱取奶粉50g放入具塞三角瓶中，加入150mL的正己烷，充分混勻；20°C水浴超聲 萃取lh，浸泡過夜。提取液經(jīng)無水硫酸鈉過濾，氮吹濃縮至1 mL;將SimonAldrichTM C8(3mL/200mg)固相萃取柱依次用5mL二氯甲烷、5mL甲醇、5mL純凈水淋洗進(jìn)行活化，將待 凈化液過柱，流速小于1 mL/min ;E.以5倍體積洗脫緩沖液洗脫，收集待用。
[0013] 本明采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)方法術(shù)檢測。用于檢測鄰苯二甲酸二丁酯 的ELISA試劑盒的測定原理：樣品中的鄰苯二甲酸二丁酯與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競 爭，加入酶標(biāo)二抗，與抗體反應(yīng)，通過酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色的深淺柬判斷樣品中鄰 苯二甲酸二丁酯的含量。
[0014] 如果樣品中的鄰苯二甲酸二丁酯含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本發(fā)明的試劑 盒檢測方法操作簡便，檢測靈敏、準(zhǔn)確、快