從三棱中提取鄰苯二甲酸二丁酯的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從三棱中提取鄰苯二甲酸二丁酯單 體化合物的方法，以及該鄰苯二甲酸二丁酯在制備抗肝癌、抗肺癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸二丁酯是一種通常通過有機(jī)合成方法獲得的小分子化合物，為無色透 明或略帶黃色的油狀液體，其分子式為C 16H2204，分子量為278. 35,由一個(gè)類似與四兀環(huán)的結(jié) 構(gòu)構(gòu)成其骨架，結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0003]
[0004] 現(xiàn)今對于鄰苯二甲酸二丁酯的應(yīng)用主要包括以下幾個(gè)方面：
[0005] -、用作氣相色譜固定液、溶劑；
[0006] 二、用作增塑劑，主要用作硝化纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯等的增塑劑，還可用于制 造油漆、粘接劑、人造革、印刷油墨、安全玻璃、賽璐珞、染料、殺蟲劑、香料溶劑、織物潤滑劑 等；
[0007] 三、作為纖維素酯、合成及天然橡膠、聚苯乙烯的增塑劑等，用于ICP-AES、AAS、 AFS、ICP-MS、離子色譜等。
[0008] 由于該物質(zhì)被大眾定格為有害的化工產(chǎn)品，且限定于通過合成的方法得到，對于 該分子本身就是天然存在的小分子化合物研究甚少，并且局于以上所述的應(yīng)用中，因此很 多學(xué)者研究了它的毒理作用，如生殖毒性研究、神經(jīng)毒性研究、急性毒性研究等，而對該小 分子的藥效研究比較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對以上現(xiàn)有技術(shù)問題，以中藥三棱為原材料，提 供一種從三棱中提取鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物的方法，該方法采用高效液相色譜進(jìn)行 分離純化，分離方法穩(wěn)定，重復(fù)性高，制備量大，操作簡單省時(shí)，得到的鄰苯二甲酸二丁酯單 體化合物純度可以達(dá)到99%以上。
[0010] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
[0011] -種從三棱中提取鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物的方法，該方法包括以下步驟：
[0012] (1)超低溫粉碎：取干燥的三棱為原料，放入超微粉碎機(jī)中進(jìn)行超微粉碎，同時(shí)粉 碎全過程用2~10°C的水作為超微破碎機(jī)內(nèi)部冷卻液，超微粉碎時(shí)間為5~20min，得到超 微粉；
[0013] (2)溶劑提?。?br>[0014] (a)乙酸乙酯提取：在超微粉中加入乙酸乙酯，乙酸乙酯的加入體積（L)為超微粉 質(zhì)量（Kg)的8~10倍，70~75°C加熱1~3小時(shí)進(jìn)行提取，離心取沉淀，然后重復(fù)1~3 次，最終得到沉淀，為粗品A ;
[0015] (b)乙醇提?。簩⒋制稟干燥后，按料液比（g/mL)為1 : (6~10)加入95%乙 醇，充分混勻后70~75°C加熱1~3小時(shí)進(jìn)行提取，離心取沉淀，然后重復(fù)1~3次，將得 到的上清合并，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮后轉(zhuǎn)移至60°C恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥，得到粗品B ;
[0016] (3)色譜分離：取粗品B用80%甲醇-水溶液（甲醇與水按體積比8 : 2配比而 成，下同理）20~80°C超聲溶解至濃度為15~50mg/ml，過膜后通過高壓制備液相色譜進(jìn) 行分離，采用的色譜柱為C18反相硅膠色譜柱，采用A流動(dòng)相為純水、B流動(dòng)相為甲醇的二 元流動(dòng)相體系，進(jìn)樣量為1~5mL/針，流動(dòng)相流速為12~20mL/min，洗脫方式為：20%甲 醇-水溶液洗脫5min、40%甲醇-水溶液洗脫7min、80%甲醇-水溶液洗脫13min、100% 甲醇洗脫5min，檢測波長為210~280nm，根據(jù)紫外吸收光譜收集21-22min洗脫液（11號 峰）作為目的組分，經(jīng)多功能膜分離系統(tǒng)濃縮后真空冷凍干燥，得到本發(fā)明目的化合物鄰 苯二甲酸二丁酯。
[0017] 作為優(yōu)選，所述步驟（1)中超微粉碎時(shí)間為12min。
[0018] 作為優(yōu)選，所述步驟（2)中乙酸乙酯提取和乙醇提取的提取溫度為72°C。
[0019] 作為優(yōu)選，所述步驟（2)中粗品A與95%乙醇的料液比為1 : 8。
[0020] 作為優(yōu)選，所述步驟（3)中粗品B溶解于80 %甲醇-水溶液的濃度為25mg/ml。
[0021] 作為優(yōu)選，所述步驟（3)中色譜柱的直徑為150mm，柱長為250mm，C18中硅球粒徑 為 10 μπι
[0022] 本發(fā)明進(jìn)一步提供上述提取得到的鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物在制備抗肝癌 藥物中的應(yīng)用。該鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物作為有效成分，按常規(guī)方法如口服、注射， 與藥學(xué)上的可接受載體或賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如：片劑、膠囊 劑、散劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑、懸浮液、糖漿、口腔含片、舌下含片、注射劑、軟膏劑、栓劑、 吸入劑等多種劑型。
[0023] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供上述提取得到的鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物在制備抗肺 癌藥物中的應(yīng)用。該鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物作為有效成分，按常規(guī)方法如口服、注 射，與藥學(xué)上的可接受載體或賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如：片劑、膠 囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑、懸浮液、糖漿、口腔含片、舌下含片、注射劑、軟膏劑、栓 劑、吸入劑等多種劑型。
[0024] 按照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的理解，鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物的給藥劑量應(yīng)根 據(jù)治療對象的年齡、體重、疾病嚴(yán)重程度等因素而定，一般可以是〇. 36-1. 27mg/天。
[0025] 由于本發(fā)明原料三棱為黑三棱科植物黑三棱的干燥塊莖，其化學(xué)成分復(fù)雜，所以 本發(fā)明選用二維高效液相色譜進(jìn)行有效組分的提取。
[0026] 首先：由于目的化合物鄰苯二甲酸二丁酯屬于極性較小的小分子物質(zhì)，所以本發(fā) 明先選用極性相對較小的乙酸乙酯作為粗溶劑，根據(jù)相似相溶原理，該溶劑可以盡可能多 的溶解掉與目的鄰苯二甲酸二丁酯極性相近的一些小分子雜質(zhì)，該步驟為下面一次色譜分 離就得到99%純度的鄰苯二甲酸二丁酯奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)；
[0027] 其次，利用鄰苯二甲酸二丁酯易溶于乙醇的特點(diǎn)，進(jìn)行乙醇提取，使得目的物鄰苯 二甲酸二丁酯盡可能多地溶解；
[0028] 再次，在色譜分離的條件選擇上：多次試驗(yàn)結(jié)果顯示，C18反相硅膠色譜柱對所提 物質(zhì)分離效果較好，而通過考察不同流動(dòng)相組成和不同洗脫方式、流速及進(jìn)樣量后，結(jié)果顯 示采用本發(fā)明" 20 %甲醇-水溶液洗脫5min、40 %甲醇-水溶液洗脫7min、80 %甲醇-水溶 液洗脫13min、100%甲醇洗脫5min"的洗脫方式其分離效果最佳，且進(jìn)樣量在l-5mL/針范 圍內(nèi)、流動(dòng)相在12-20mL/min范圍內(nèi)時(shí)重復(fù)性良好，得到餾分中目的化合物鄰苯二甲酸二 丁酯純度高達(dá)99%，且目的峰清晰、峰容量相對較大、無拖尾等現(xiàn)象，與其他峰之間分離非 常好，無交叉或重疊等現(xiàn)象，可直接用于后續(xù)制藥等應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明利用液相色譜制備的方法成功從中藥三棱中提取分離得到純度達(dá)到99% 的天然小分子化合物鄰苯二甲酸二丁酯，該方法工藝簡單，時(shí)間周期短，試劑耗費(fèi)量小，制 備量大，穩(wěn)定可控，重復(fù)性好，實(shí)用性高，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
[0030] 現(xiàn)在藥理研究表明，三棱具有多種藥理作用并被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、婦科 如子宮肌瘤各類疾病的治療。因此從中分離出具有確切結(jié)構(gòu)并且易于進(jìn)行化學(xué)合成的集抗 癌活性為一體的化合物必將為抗癌新藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明得到的三棱提取物鄰苯二 甲酸二丁酯性質(zhì)穩(wěn)定，通過細(xì)胞在線實(shí)時(shí)監(jiān)測的方法觀測其在體外的抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)該 化合物對肝癌Η印-g2細(xì)胞和肺癌A549細(xì)胞具有抑制作用；通過建立小鼠模型，發(fā)現(xiàn)該化合 物對肺癌A549細(xì)胞系的選擇性比較好。實(shí)驗(yàn)充分表明，該化合物在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)抗腫瘤 作用明顯，具有抗癌藥物開發(fā)潛力，為抗癌天然藥物的開發(fā)提供了有力的依據(jù)。
【附圖說明】
[0031] 圖1所示的是本發(fā)明從三棱中提取鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物的方法的高壓 液相色譜分離圖；
[0032] 圖2所示的是本發(fā)明從三棱中提取鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物的方法得到的 目的組分的HPLC驗(yàn)純圖；
[0033] 圖3所示的是本發(fā)明從三棱中提取鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物的方法得到的 目的組分的C13NMR核磁圖；
[0034] 圖4所示的是本發(fā)明從三棱中提取鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物的方法得到的 目的組分的H1NMR核磁圖；
[0035] 圖5所示的是本發(fā)明從三棱中提取鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物的方法得到的 目的組分的MS質(zhì)譜圖；
[0036] 圖6所示的是本發(fā)明鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物對肺癌A549細(xì)胞的抑制作 用；
[0037] 圖7所示的是本發(fā)明鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物對肝癌Hep_G2細(xì)胞的抑制作 用；
[0038] 圖8所示的是本發(fā)明鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物抗肺癌實(shí)驗(yàn)小鼠平均瘤重；
[0039] 圖9所示的是本發(fā)明鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物抗肺癌實(shí)驗(yàn)小鼠平均