專利名稱：一種乳制品中乳鐵蛋白含量的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳制品中乳鐵蛋白含量的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
乳鐵蛋白(Lactoferrin LF)又稱“乳轉(zhuǎn)鐵蛋白”，是一種具有許多生理活性的鐵結(jié)合性糖蛋白。它廣泛存在于乳汁、唾液、淚液等外分泌或血漿中性粒細(xì)胞中。從營(yíng)養(yǎng)成分上看，乳清蛋白占母乳總蛋白質(zhì)的80%左右。這類蛋白質(zhì)的氨基酸組成全面充分且比例恰當(dāng)，還含有a-乳白蛋白、乳鐵蛋白、免疫球蛋白、血清白蛋白等活性成分。其中，乳鐵蛋白是乳清蛋白中具有很高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的活性成分。乳鐵蛋白最早是由科學(xué)家Montreuij和Johansonb于1960年在母乳乳汁中發(fā)現(xiàn)。美國(guó)乳品協(xié)會(huì)和一些科學(xué)家的研究表明，乳鐵蛋白是一種多功能蛋白質(zhì)，具有廣譜抗菌，抗病毒感染作用，能調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵的平衡；調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞的生成，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)；調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力； 抑制人體腫瘤細(xì)胞的作用；能同多種抗生素及抗真菌制劑協(xié)同作用，更有效地治療疾病。由于乳鐵蛋白的多種特殊功能，已經(jīng)在許多市售的產(chǎn)品中使用，其中包括嬰兒配方奶粉、運(yùn)動(dòng)及功能性食品、獸醫(yī)及飼料類、漱口水和牙膏等個(gè)人護(hù)理用品。乳鐵蛋白在嬰兒配方中應(yīng)用，是從比較母乳及牛乳之間的不同開(kāi)始的。母乳中乳鐵蛋白的濃度為
0.20g/100ml，而在牛乳中為0. 01g/100ml。在許多國(guó)家，乳鐵蛋白都已經(jīng)是市售的一種配料。乳鐵蛋白作為乳清蛋白中的成分，對(duì)乳清蛋白的特殊功效有重要意義，特別是添加在嬰幼兒奶粉中，對(duì)嬰兒的健康提供可靠的幫助。乳鐵蛋白出現(xiàn)在動(dòng)物乳，特別是初乳中，為媽咪和嬰幼兒提供多種生物功能，尤其是調(diào)節(jié)免疫和對(duì)病原微生物抵御功能。大量研究證明，乳鐵蛋白能促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收、消化，并保護(hù)機(jī)體面受微生物侵害，促進(jìn)腸道有益菌生長(zhǎng)，為嬰幼兒提供了第一道也是最重要的防線。乳鐵蛋白是唯一能在腸道內(nèi)運(yùn)載鐵離子的物質(zhì)，能顯著增強(qiáng)對(duì)鐵的吸收和利用率。有效預(yù)防孕產(chǎn)婦及嬰幼兒貧血。目前測(cè)定乳鐵蛋白含量的方法有很多種，但大致可以歸為幾類一是需要借助抗體，如酶聯(lián)免疫法、放射免疫擴(kuò)散法和免疫印記；二是根據(jù)不同分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)對(duì)電磁輻射選擇性吸收，如紫外分光光度法；三是根據(jù)離子遷移速度，如毛細(xì)管電泳技術(shù)；四是陽(yáng)離子交換色譜柱進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定含量。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linkedimmunosorbent assay,簡(jiǎn)稱 ELISA)米用 ELISA測(cè)定乳鐵蛋白含量具有靈敏度高、最小檢測(cè)限低、樣品無(wú)需純化等特點(diǎn)但該法受環(huán)境和操作人員的影響較大，對(duì)于定量重復(fù)差；放射免疫擴(kuò)散法的檢測(cè)范圍有限；準(zhǔn)確度不高并且存在一定的放射危害；紫外分光光度法具有快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但誤差大；而凝膠色譜法適用于高純度的樣品測(cè)定；而用陽(yáng)離子交換色譜柱進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定方法，提高了定量的準(zhǔn)確性，但此方法的流動(dòng)相中使用了大量的NaCl，對(duì)高壓液相色譜儀來(lái)講是最忌諱的，對(duì)儀器損害非常大。因而，探尋一種成本低廉、檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、適用于復(fù)雜體系乳制品中乳鐵蛋白含量的檢測(cè)方法是研究的首要問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服了酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法定量重復(fù)性差、紫外分光光度法誤差大、凝膠色譜法只適用于高純度樣品和高效液相色譜法測(cè)定中使用大量NaCl 對(duì)儀器損害大的缺陷，提供了一種乳制品中乳鐵蛋白含量的測(cè)定方法。該測(cè)定方法改進(jìn)了陽(yáng)離子交換色譜柱進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定方法，利用親和層析柱作為提取樣品的工具，使用常用的C18柱進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，測(cè)定成本低，準(zhǔn)確度和專一度高，大大節(jié)省測(cè)定時(shí)間并且具有很高的回收率。本發(fā)明提供了一種乳制品中乳鐵蛋白含量的測(cè)定方法，其包括下述步驟(I)將乳制品與水的混合液離心脫脂，去除脂肪得脫脂乳液；(2)過(guò)親和層析柱所述的脫脂乳液通過(guò)預(yù)活化的親和層析柱，用pH為6. 8 7. 4 的磷酸鈉緩沖液洗柱，用洗脫液①洗脫，收集洗脫液得進(jìn)樣溶液；該洗脫液①為含I. Omol/ L氯化鈉的磷酸鈉緩沖液，pH為6. 8 7. 4 ;(3)將所述的進(jìn)樣溶液進(jìn)行高效液相色譜法檢測(cè)洗脫液②由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B 組成，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0. lwt%的三氟乙酸水溶液，洗脫梯度如表I所示表I
權(quán)利要求
1.一種乳制品中乳鐵蛋白含量的測(cè)定方法，其包括下述步驟(1)將乳制品與水的混合液離心脫脂，去除脂肪得脫脂乳液；(2)過(guò)親和層析柱所述的脫脂乳液通過(guò)預(yù)活化的親和層析柱，用pH為6.8 7. 4的磷酸鈉緩沖液洗柱，用洗脫液①洗脫，收集洗脫液得進(jìn)樣溶液；該洗脫液①為含I. Omol/L氯化鈉的磷酸鈉緩沖液，pH為6. 8 7. 4 ;(3)將所述的進(jìn)樣溶液進(jìn)行高效液相色譜法檢測(cè)用洗脫液②進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液 ②由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0. Iwt %的三氟乙酸水溶液，洗脫梯度如下表所示
2.如權(quán)利要求I所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述的親和層析柱為為肝素親和層析柱；所述的肝素親和層析柱的規(guī)格較佳地為ImL或5mL ;所述的肝素親和層析柱較佳地為 HiTrap Heparin HP親和層析柱；所述預(yù)活化的親和層析柱較佳地為經(jīng)pH為6. 8-7. 4的磷酸鈉緩沖液活化過(guò)的所述親和層析柱。
3.如權(quán)利要求I或2所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述高效液相色譜法檢測(cè)的條件還包括所述的檢測(cè)波長(zhǎng)為270 290nm，較佳地為280nm ;所述的柱溫為25 30°C ;所述流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的總流速為0. 8 I. OmL/min ;所述進(jìn)樣溶液的進(jìn)樣量為10 50 y L。
4.如權(quán)利要求I或2所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟⑵中所述的磷酸鈉緩沖液采用下述方法制備配制50mmol/L的磷酸氫二鈉溶液,用磷酸調(diào)節(jié)pH至6. 8 7. 4。
5.如權(quán)利要求I或2所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟⑵中，所述的洗脫液①采用下述方法制備配制含50mmol/L的磷酸氫二鈉和I. Omol/L氯化鈉的溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH 至 6. 8 7. 4。
6.如權(quán)利要求5所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述的乳制品為液體乳或乳粉；所述的乳制品為乳粉時(shí)，所述乳粉與水的混合比例為Ig乳粉IOmL水 Ig乳粉15mL水； 所述的乳制品為液體乳時(shí)，所述液體乳與水的混合比例為Ig液體乳2. 5mL水 Ig液體乳5mL水。
7.如權(quán)利要求I或2所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟(I)中所述離心的溫度為0 4°C ;所述離心的轉(zhuǎn)速為5000 8000r/min ;所述離心的時(shí)間為10 20min。
8.如權(quán)利要求I或2所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟(2)中，在所述的收集洗脫液后還進(jìn)行過(guò)濾；所述過(guò)濾較佳地采用水相過(guò)濾膜過(guò)濾；所述水相過(guò)濾膜的孔徑較佳地為.0.45 u m。
9.如權(quán)利要求I或2所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟(3)中所述的C18色譜柱為 Agilent Zorabax 300SB_C18 色譜柱。
10.如權(quán)利要求I或2所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟⑶中，所述的洗脫液②經(jīng)過(guò)預(yù)處理，所述的預(yù)處理為采用有機(jī)相過(guò)濾膜過(guò)濾流動(dòng)相A和流動(dòng)相B ;所述有機(jī)相過(guò)濾膜的孔徑較佳地在0. 45 ii m以下，但不包括O。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種乳制品中乳鐵蛋白含量的測(cè)定方法(1)將乳制品與水的混合液離心脫脂，去除脂肪得脫脂乳液；(2)過(guò)親和層析柱脫脂乳液通過(guò)預(yù)活化的親和層析柱，用pH為6.8～7.4的磷酸鈉緩沖液洗柱，用洗脫液①洗脫，收集洗脫液得進(jìn)樣溶液；該洗脫液①為含1.0mol/L氯化鈉的磷酸鈉緩沖液，pH為6.8～7.4；(3)進(jìn)樣溶液進(jìn)行高效液相色譜法檢測(cè)高效液相色譜法的洗脫液②由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1wt％的三氟乙酸水溶液，梯度洗脫，色譜柱為C18色譜柱。該測(cè)定方法具有專一性和可重復(fù)性，去除其他干擾物質(zhì)及環(huán)境變化影響等優(yōu)點(diǎn)，降低了檢測(cè)費(fèi)用，準(zhǔn)確度高，簡(jiǎn)化了乳鐵蛋白檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)G01N30/88GK102590418SQ20121003021
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月10日
發(fā)明者何亞斌, 孟瑾, 王霞, 鄭小平, 韓惠雯, 馬穎清 申請(qǐng)人:上海德諾產(chǎn)品檢測(cè)有限公司