一種測(cè)定土壤氨基酸營(yíng)養(yǎng)貢獻(xiàn)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本說明屬于土壤科學(xué)領(lǐng)域，涉及一種測(cè)定土壤氨基酸營(yíng)養(yǎng)貢獻(xiàn)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在過去幾十年的植物營(yíng)養(yǎng)研究中，無機(jī)氮營(yíng)養(yǎng)得到了深入且廣泛的研究，而有機(jī) 氮營(yíng)養(yǎng)的研究卻相對(duì)缺乏。然而，無機(jī)氮尤其是化學(xué)氮肥的廣泛應(yīng)用，在提高了作物產(chǎn)量的 同時(shí)，也帶來了農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降、環(huán)境污染、植物抗病性差、農(nóng)藥殘留等一系列問題。隨著有 機(jī)農(nóng)業(yè)和有機(jī)食品的不斷發(fā)展，植物有機(jī)營(yíng)養(yǎng)越來越得到大家的重視。近年來的研究發(fā)現(xiàn)， 植物不僅能夠吸收銨態(tài)氮、硝態(tài)氮這樣的無機(jī)分子，還可以吸收氨基酸、多肽、血紅蛋白、核 酸等簡(jiǎn)單或復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)，而無需將這些有機(jī)物質(zhì)分解為無機(jī)氮后才可以被植物吸收利 用。氨基酸是土壤中含量較為豐富的且生物有效性較高的有機(jī)氮，因此有機(jī)氮營(yíng)養(yǎng)也多針 對(duì)氨基酸進(jìn)行研究。
[0003] 然而，氨基酸在自然環(huán)境下對(duì)植物的營(yíng)養(yǎng)貢獻(xiàn)仍然難以準(zhǔn)確估計(jì)。土壤中氨基酸 周轉(zhuǎn)速率較快，一般幾小時(shí)內(nèi)就可以周轉(zhuǎn)一次，且一直處于動(dòng)態(tài)變化中，因此采用傳統(tǒng)方法 難以進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)算。同位素標(biāo)記是研究有機(jī)氮營(yíng)養(yǎng)的重要方法，然而單一標(biāo)記難以區(qū)分植 物吸收分子態(tài)氨基酸還是經(jīng)微生物分解后的含氮的其他化合物。雙標(biāo)記技術(shù)是指采用 13c 、15N標(biāo)記的氨基酸，植物吸收分子態(tài)氨基酸后，其植物體內(nèi)的13C、15N呈現(xiàn)一定的線性相關(guān) 性，根據(jù)線性關(guān)系就可以推算植物吸收的分子態(tài)氨基酸的數(shù)量。此方法為定量研究氨基酸 的生物有效性提供了重要基礎(chǔ)，但其也存在重要的缺陷：1)微生物分解標(biāo)記氨基酸后， 13C仍 可能以其他方式進(jìn)入植物體，這就混淆了分子態(tài)氨基酸的吸收;2)植物根系吸收的13C會(huì)通 過呼吸作用排出體外，影響了計(jì)算的準(zhǔn)確性;3)標(biāo)記物質(zhì)會(huì)被微生物快速分解，難以進(jìn)行長(zhǎng) 期的試驗(yàn)。總而言之，雙標(biāo)記技術(shù)只適合短期培養(yǎng)試驗(yàn)，難以長(zhǎng)期評(píng)估自然狀態(tài)下的氨基酸 生物有效性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)定土壤氨基酸營(yíng)養(yǎng)貢獻(xiàn)的方 法，是一種利用微積分分段擬合，定量評(píng)價(jià)在微生物存在條件下氨基酸對(duì)植物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng) 貢獻(xiàn)的方法。通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：
[0005] (1) 土壤準(zhǔn)備:采集試驗(yàn)點(diǎn)0-15cm表層土壤，取回后過4mm篩，剔除明顯的石塊及根 系，陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干后過2mm篩，裝袋備用；
[0006] (2)植物種植:取上述制備好的土壤2000g于高、口徑分別為17cm、12.5cm的塑料盆 中，該塑料盆底部不含透水孔，在土體中均勻插入5-10根中空的且外壁上布滿小孔的聚乙 烯管，將已經(jīng)發(fā)芽的玉米種子種植在塑料盆中心，待玉米長(zhǎng)到2cm高時(shí)，挑選生長(zhǎng)一致的玉 米苗；
[0007] 塑料盆底部無透水孔，可以避免后期添加標(biāo)記物流失，插入聚乙烯管可以使得土 體通氣性更好，根系生長(zhǎng)均勻，且有利于添加的標(biāo)記物質(zhì)快速在整個(gè)土體中均勻擴(kuò)散；
[0008] (3)第一次添加標(biāo)記物:待挑選后的玉米苗再發(fā)芽l-2d后，選三盆，向每個(gè)聚乙烯 管中添加含0.001-0.00001111111〇11/ 1、標(biāo)記豐度為99.8%的13(：，14-617(^116(甘氨酸）溶液 20ml，每盆共加100-200ml，未加標(biāo)記氨基酸溶液的其它塑料盆采用相同方法添加超純水 100-200ml；
[0009] (4)樣品收集:添加 0 · 001-0 · OOOOlmmolL-1 標(biāo)記豐度為 99 · 8% 的 13C，15N-Glycine 溶 液的塑料盆，玉米吸收4h后，盡快破壞性采樣，將土壤與根系分離開來后，迅速用自來水沖 洗根系，之后在超聲波中清洗5min，用0. δπιο??/1氯化鈣沖洗三次，純凈水沖洗三次，最后放 置于凍干機(jī)冷凍干燥后，稱重，用球磨儀粉碎，樣品高溫消煮氧化，全氮含量用半微量凱氏 定氮儀蒸餾，最后用O.Olmol I/1硫酸滴定，采用同位素質(zhì)譜儀測(cè)定植株不同部位的15Ν豐度 值，采集植物樣品的同時(shí)，將新鮮的土壤迅速收集起來，放入4°C冰箱中保存，待試驗(yàn)所有土 壤樣品收集完成后，測(cè)定土壤鮮樣中水溶性氨基酸的含量；
[0010] (5)第二次添加標(biāo)記物：第一次添加標(biāo)記物及超純水3d后，進(jìn)行第二次添加標(biāo)記 物，向每個(gè)聚乙烯管中添加含0.001-0.00001臟〇1廠 1的13(：，14-617(^116溶液201111，每盆共加 100-200ml，共加三盆，未加標(biāo)記氨基酸溶液的其它塑料盆采用相同方法添加超純水100-200ml，添加標(biāo)記物的塑料盆，玉米吸收4h后，采用步驟4收集樣品；
[0011] (6)每隔三天重復(fù)步驟(3)和(4 )，共采集植物樣品15-25次；
[0012] (7)確定植物吸收分子態(tài)氨基酸的方法：
[0013] 以15N吸收量為橫坐標(biāo)，以13C吸收量為縱坐標(biāo)，兩者進(jìn)行線性擬合，得到13C^ SS = ，如果植物吸收的氨基酸均為分子態(tài)氨基酸，則a = 2，根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)得到a，與理 論值2進(jìn)行比較，就可以得到吸收的分子態(tài)氨基酸的比例。
[0014] (8)確定土壤中分子態(tài)氨基酸吸收速率的方法：
[0015]
[0016] Nrate指的是土壤游離氨基酸的吸收速率;Ντ_ι-Ν指的是每盆采集的植物樣品的含 氮量;AS指的是在植物樣品中由步驟(7)確定的植物吸收分子態(tài)氨基酸的氮量;Af標(biāo)記物質(zhì) 的15N豐度(甘氨酸99.8%);CSQil指的是土壤中游離氨基酸的濃度;Cb指的是添加到土壤中 的標(biāo)記氨基酸濃度;T指的是植物吸收的時(shí)間；
[0017] (9)確定氨基酸在整個(gè)植物生長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)貢獻(xiàn)的方法
[0018] 由步驟(8)確定各采樣時(shí)間點(diǎn)土壤中分子態(tài)氨基酸吸收速率后，以培養(yǎng)時(shí)間為橫 坐標(biāo)，以吸收速率為縱坐標(biāo)，采用微積分的方法確定氨基酸在整個(gè)植物生長(zhǎng)期的營(yíng)養(yǎng)貢獻(xiàn)， 吸收速率曲線與種植時(shí)間所形成的面積則為總的氨基酸吸收量；
[0019] 采用此公式擬合分子態(tài)氨基酸的吸收總量：
[0020] N_;?：(g) = { (Nrate l+Nrate 2)/2*72+(Nrate 2+Nrate 3)/2*72+，，，+ (Nrate n-l+Nrate n)/2* 72}*14/1000000
[0021] Nrate指的是某次取樣時(shí)分子態(tài)氨基酸的吸收速率，由步驟(8)確定，Nrate i則為第 一次取樣時(shí)分子態(tài)氨基酸的吸收速率。
[0022] 本發(fā)明采用碳氮雙標(biāo)記技術(shù)結(jié)合微積分原理，在考慮到微生物影響的環(huán)境下研究 氨基酸對(duì)植物生長(zhǎng)的長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)貢獻(xiàn)，為研究有機(jī)營(yíng)養(yǎng)提供了方法基礎(chǔ)。本方法操作簡(jiǎn)單，培 養(yǎng)環(huán)境易調(diào)控，采用同位素技術(shù)數(shù)據(jù)精確可靠，具有相當(dāng)?shù)木_度，可以研究多種植物的氨 基酸營(yíng)養(yǎng)貢獻(xiàn)，為養(yǎng)分資源高效管理提供了理論與技術(shù)支撐。
【附圖說明】
[0023] 圖1是玉米15N含量與13C含量的相關(guān)關(guān)系。
[0024] 圖2是植物吸收分子態(tài)氨基酸速率隨時(shí)間的變化規(guī)律。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例做進(jìn)一步的說明。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] (1) 土壤準(zhǔn)備:采集浙江大學(xué)紫金港西區(qū)0-15cm表層土壤，取回后過4mm篩，剔除明 顯的石塊及根系，陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干后過2_篩，裝袋備用；
[0028] (2)植物種植:取上述制備好的土壤2000g于高、口徑分別為17cm、12.5cm的塑料盆 中，該塑料盆底部不含透水孔，在土體中均勻插入5根中空的且外壁上布滿小孔的聚乙烯 管，將已經(jīng)發(fā)芽的玉米種子種植在塑料盆中心，待玉米長(zhǎng)到2cm高時(shí)(此時(shí)玉米已經(jīng)發(fā)芽4-8 天），挑選生長(zhǎng)一致的玉米苗；
[0029]塑料盆底部無透水孔，可以避免后期添加標(biāo)記物流失，插入聚乙烯管可以使得土 體通氣性更好，根系生長(zhǎng)均勻，且有利于添加的標(biāo)記物質(zhì)快速在整個(gè)土體中均勻擴(kuò)散；
[0030] (3)第一次添加標(biāo)記物:待挑選后的玉米再發(fā)芽l-2d后，選擇其中3個(gè)塑料盆添加 標(biāo)記物，向盆內(nèi)每個(gè)聚乙烯管中添加含0.0001mm〇lL-l的 13C，15N-Glycine溶液20ml，每盆共 加 l〇〇ml，其它塑料盆采用相同方法添加超純水100ml，用于以后的添加試驗(yàn)；
[0031] (4)樣品收集:添加標(biāo)記物的塑料盆中的玉米吸收4h后，盡快破壞性采樣，將土壤 與根系分離開來后，迅速用自來水沖洗根系，之后在超聲波中清洗5min，用0. δπιο??/1氯化