專利名稱：氨基酸診斷/測定試劑(盒)及氨基酸的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度
的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨基酸含量的測定在醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中都是比較重要的測定項(xiàng)目。 現(xiàn)有的測定方法有色譜法、電化學(xué)法、儀器分析法(氨基酸分析儀)、分光光度計等方法，這 些方法或是操作方法較為繁雜、特異性差、或儀器設(shè)備成本較高等缺點(diǎn)。 氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸(儀器價 格昂貴，不能普遍使用)，對于醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中來說，多數(shù)情況下，都是很 多種氨基酸同時存在，所以需要測定總的氨基酸含量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只 能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。 大量食肉或饑餓時尿中氨基酸氮增加，孕婦及新生兒尿液氨基酸氮也增加。氨基 酸代謝異常，造成某些氨基酸在體內(nèi)積累過多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎縮、肝功能 衰竭、Reye綜合征、或某些因素造成蛋白質(zhì)分解加速的疾病，遺傳性疾病所導(dǎo)致的代謝異常 均可使尿中氨基酸氮增加。 酶法測定血、尿、體液、食品、土壤、工業(yè)產(chǎn)品中氨基酸氮含量具有特異性高、方法 簡便、成本低的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出 一 種利用酶倍增法(Enzymatic DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法 (CoupleReaction)技術(shù)，計量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的 變化，得以測定氨基酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的氨基酸診斷/ 測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進(jìn) 行氨基酸濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明氨基酸濃度測定方法如下 氨基酸+水+輔酶氨某酸脫氡酶含氧酸+氨+還原型輔酶
氨+2水+6高鐵細(xì)胞色素c亞硝酸還原酶/Ca21亞硝酸+
6亞鐵細(xì)胞色素c
亞硝酸+水+輔酶硝酸還原酶硝酸+還原型輔酶 這禾中方法應(yīng)用氨基酸脫氫酶(amino-acid dehydrogenase ;EC 1. 4. 1. 5 ; EC1. 4. 99. 1)酶(偶)聯(lián)亞硝酸還原酶(nitrite reductase ;EC 1. 7. 2. 2)、硝酸還原酶 (nitrate reductase ;EC 1. 7. 1. 1 ;EC 1. 7. 1. 2 ;EC 1. 7. 99. 4)酶促反應(yīng)比色法。氨基酸脫 氫酶酶解氨基酸反應(yīng)產(chǎn)生氨，同時將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶 (在340nm處有吸收峰)，再通過(偶)聯(lián)合亞硝酸還原酶、硝酸還原酶的作用，第二次將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定 還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測量340nm處吸光度上升的程度，可以測算 氨基酸的濃度大小。 實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單
劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明氨基酸診斷/測定試劑(盒)較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 輔酶 3mmol/L 氨基酸脫氫酶 10000U/L 亞硝酸還原酶 12000U/L 硝酸還原酶 12000U/L 高鐵細(xì)胞色素C 5,1/L 氯化f丐 6mmol/L 本發(fā)明的氨基酸診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸脫氫酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素 C、氯化鈣。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸脫氫酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶。 輔酶、氨基酸脫氫酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣在試劑 l或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸脫氫酶。 輔酶、氨基酸脫氫酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣在試劑 1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定氨基酸濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一 本實(shí)施例的氨基酸診斷/測定試劑為單試劑，包括 [OO43]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
輔酶 3,1/L
氨基酸脫氫酶 10000U/L
亞硝酸還原酶 12000U/L
硝酸還原酶 12000U/L
高鐵細(xì)胞色素C 5,1/L
氯化f丐 6mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0. l，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向
為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 實(shí)施例二 本實(shí)施例的氨基酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
高鐵細(xì)胞色素C 5mmol/L
氯化鈣 6mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 氨基酸脫氫酶 10000U/L 亞硝酸還原酶 12000U/L 硝酸還原酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0. 1，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為
2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
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實(shí)施例三本實(shí)施例的氨基酸診斷/測定試劑為」三試劑，包括試劑l三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑50mmol/L輔酶3mmol/L高鐵細(xì)胞色素c5mmol/L氯化鈣6mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑500,1/L亞硝酸還原酶12000U/L硝酸還原酶12000U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑500,1/L氨基酸脫氫酶10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定氨基酸濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度《0. 1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑2、試 劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右， 檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá)到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。 總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0008 ;吸光度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上 升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)40mmol/L ;試劑測試的不準(zhǔn)確 度，其相對偏差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達(dá)O. 02±0. 01 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā) 明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法的氨基酸的濃度測定方法，其方法如下氨基酸+水+輔酶氨基酸脫氫酶含氧酸+氨+還原型輔酶氨+2水+6高鐵細(xì)胞色素c 亞硝酸還原酶/Ca2+亞硝酸+ 6亞鐵細(xì)胞色素c亞硝酸+水+輔酶硝酸還原酶硝酸+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出氨基酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種氨基酸診斷/測定試劑(盒)，主要成分包括試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會 反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸脫氫酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸脫氫酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成；試劑 2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸脫氫酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶組成。輔酶、氨基酸脫氫酶、 亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸脫氫酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成；試劑 2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸脫 氫酶組成。輔酶、氨基酸脫氫酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣在試劑 1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。6亞鐵細(xì)胞色素c緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶氨基酸脫氫酶 亞硝酸還原酶 硝酸還原酶 高鐵細(xì)胞色素C 氯化鈣
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣、氨基酸脫氫酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
文檔編號G01N33/48GK101750334SQ20081023568
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司